本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种双向荧光硫化氢探针及其应用。
背景技术：
硫化氢广泛存在于各类工业生产活动中，是公认的环境危害物之一。近年来的研究表明，硫化氢还是一种重要的内源性指标因子，可以在生物体内经酶催化分解生物硫醇类物质后产生，而硫化氢在生物体内的含量及分布是诊断众多生理疾病，是包括阿尔兹海默症在内等生理疾病的重要前期指标。因此，构建开发新型的传感材料，快速准确的检测硫化氢的含量具有重要的现实意义。
为了构建具有理想选择性的高效传感器，人们开发设计了很多基于硫化氢特征反应的探针，分别通过叠氮/硝基类化合物还原，亲核加成、金属硫化物沉淀等不同原理实现了一定程度上的选择性检测。然而，由于生物硫醇类物质天然具有与硫化氢十分类似的化学反应活性，因此从根本上还是难以彻底避免各类干扰性物质对检测结果的影响。虽然不管基于何种反应类型所设计开发的探针材料都存在各类固有的缺陷，然而不同的传感原理所导致的缺陷种类各有不同，如果能够借助多种检测原理获得双重检测结果，则可以通过交叉比对的方式消除干扰误差影响，实现高选择性硫化氢检测传感。
技术实现要素：
为了解决由于生物硫醇类物质与硫化氢具有十分类似的化学反应活性，从而导致对硫化氢检测结果的影响，本发明以成熟稳定的锆基框架材料uio-66为载体，将氨基功能化的uio-66-nh2进行酰胺化修饰处理，获得了一个具有硫化氢双向荧光检测活性的新型探针材料，该探针材料可以通过荧光增强和荧光猝灭的双重方式直接和间接定量识别硫化氢。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种双向荧光硫化氢探针，所述探针是通过对带有氨基的锆基框架材料进行酰胺化修饰后得到。
进一步地，所述带有氨基的锆基框架材料为uio-66-nh2，所述酰胺化修饰是采用马来酸酐与uio-66-nh2的氨基进行酰胺化反应。
上述双向荧光硫化氢探针在硫化氢识别中的应用。
进一步地，所述硫化氢识别是指双向荧光硫化氢探针先发生荧光增强识别硫化氢，然后再通过加入cu2 离子发生荧光猝灭对硫化氢识别进行第二重验证。
上述双向荧光硫化氢探针在硫化氢定量检测中的应用。
上述双向荧光硫化氢探针在制备硫化氢传感器中的应用。
有益效果：本发明的双向荧光硫化氢探针材料可以基于组合式探测原理准确识别硫化氢分子，即分别通过s-亲核加成以及s-cu亲和配位两种探测机理，相应地以荧光增强以及荧光猝灭的方式选直接和间接择性定量识别硫化氢，实现对硫化氢的双向荧光定量传感。
附图说明
图1为本发明中探针材料uio-66-ma的合成及双向荧光传感实施过程示意图。
图2为本发明中电子显微镜照片对比。其中：a为uio-66-nh2，b为uio-66-ma，c为uio-66-ma/h2s，d为uio-66-ma/h2s cu2 。
图3为本发明中粉末衍射图谱对比。其中：1为模拟图谱，2为uio-66-nh2，3为uio-66-ma，4为uio-66-ma/h2s，5为uio-66-ma/h2s cu2 。
图4为本发明中红外振动吸收谱图对比。其中：1为uio-66-nh2，2为uio-66-ma，3为uio-66-ma/h2s，4为uio-66-ma/h2s cu2 。
图5为本发明中uio-66-ma与uio-66-nh2红外吸收图谱的特征性对比。
图6为本发明中uio-66-ma与uio-66-nh2中n1sxps谱图对比。
图7为本发明中uio-66-ma的1h核磁共振图谱。
图8为本发明中uio-66-ma的1h核磁共振图谱细节对比。
图9为本发明中uio-66-nh2、uio-66-ma、uio-66-ma/h2s和uio-66-ma/h2s cu2 在77k下的n2吸附/脱附等温线。
图10为本发明中uio-66-nh2、uio-66-ma、uio-66-ma/h2s和uio-66-ma/h2s cu2 的孔径分布变化对比。
图11为本发明中uio-66-ma的荧光激发和发射光谱。
图12为本发明中uio-66-ma在不同浓度h2s环境中的荧光发射光谱变化。
图13为本发明中uio-66-ma荧光发射强度与h2s浓度之间的线性关系，内图为uio-66-ma荧光发光强度随h2s浓度增加的总体变化趋势。
图14为本发明中uio-66-ma在不同干扰性物质存在下的荧光发光光谱。
图15为本发明中不同干扰性物质的荧光增强因子对比。
图16为本发明中uio-66-ma检测h2s前后的红外振动吸收光谱细节对比。
图17为本发明中uio-66-ma对h2s检测后添加cu2 离子前后样品的s2pxps测试谱图。
图18为本发明中uio-66-ma对h2s检测后样品的氢核磁共振谱图。
图19为本发明中uio-66-ma对h2s检测后样品的氢核磁共振细节谱图对比。
图20为本发明中uio-66-ma/h2s识别cu2 离子后的样品cu2pxps测试谱图。
图21为本发明中uio-66-ma/h2s在不同浓度cu2 离子环境下的荧光发射光谱。
图22为本发明中uio-66-ma/h2s对cu2 离子的荧光猝灭因子与cu2 离子浓度直接的线性关系，内图为uio-66-ma/h2s随cu2 离子浓度增加荧光发光强度的整体变化趋势。
图23为本发明中uio-66-ma/cys在不同浓度cu2 离子存在下的荧光发光光谱。
图24为本发明中h2s及半胱氨酸处理过的uio-66-ma对0.3μmcu2 离子的荧光猝灭因子对比。
具体实施方式
金属-有机框架材料(mofs)是一类具有周期性开放多孔结构的多功能杂化材料，具有可设计调控的材料结构及功能，是催化、传感、光电、储能等领域的明星材料。利用mofs的可修饰性，借助其开放多孔的特性，可以构建各类结构功能新颖的探针材料，并利用mofs的客体富集特性进一步提升检测的活性。本发明以成熟稳定的锆基框架材料uio-66为实施载体，将氨基功能化的uio-66-nh2进行酰胺化修饰处理，获得了一个具有硫化氢双向荧光检测活性的新型探针材料uio-66-ma。该探针材料可以基于组合式探测原理准确识别硫化氢分子，即分别通过s-亲核加成以及s-cu亲和配位两种探测机理，相应地以荧光增强以及荧光猝灭的方式直接或间接选择性定量识别硫化氢，实现对硫化氢的双向荧光定量传感。本发明的uio-66-ma是首个基于组合式探测原理的双向荧光硫化氢探针材料。
如图1所示，uio-66-ma的合成是以氨基功能化的mofs材料uio-66-nh2为实施对象，通过马来酸酐与框架材上裸露的氨基进行酰胺化反应，获得马来酰亚胺修饰的uio-mof，亦即uio-66-ma。首先，氨基具有较强的供电子特性，是良好的生色团，能够向体系的芳环结构进行电荷转移并通过芳环的π-π*跃迁产生明显的蓝色荧光发射，使得uio-66-nh2表现出中等强度的荧光发射活性。在修饰以马来酰亚胺后，由于羰基的强烈吸电子能力，激发态下电荷会从配体的芳环部分向马来酰亚胺基团转移，导致分子内能量转移引发的荧光猝灭，因此uio-66-ma几乎无法表现出明显的荧光发射活性。
其次，在马来酰亚胺基团中，不饱和的c＝c双键受到临近两个强吸电子的羰基影响，其上的电荷密度显著下降，非常容易发生亲和加成。在遇到硫化氢后，由于硫负离子富电荷易亲核的特性，c＝c与h2s之间可以发生高效的亲核性迈克尔加成反应，反应的结果是在体系内引入一个巯基(-sh)。此时，由于s原子的富电荷特性，可以发生从-sh到羰基部分的电荷转移，从而取代了在uio-66-ma中原有的芳环向羰基的电荷转移。在此情况下，芳环的能量不会再通过分子内能量转移的途径消散，从而可以再次表现出原有的蓝色荧光发射行为，整体表现为荧光增强。受限于uio-66框架内部的孔道尺寸大小，在修饰后其孔道尺寸被进一步压缩，而硫化氢的分子尺寸显著小于其它可能发生干扰的生物硫醇类分子(例如半胱氨酸和谷胱甘肽等)，因此可以高效进入材料内部发生亲核加成，从而表现出更高的荧光增强效率。该亲核加成对亲核试剂的亲核性要求较高，其它的含硫物质，例如各类硫酸盐、亚硫酸盐等均不能发生此类反应，从而保障了极高的硫化氢选择性。
再次，虽然uio-66-ma具有极高的h2s选择性，但不可否认其它硫化物，例如半胱氨酸等，仍能少量的与位于材料表面的反应位点发生亲核加成反应，使得单纯依靠荧光增强原理难以获得最极致的选择性。值得注意的是，不同的硫化物与uio-66-ma虽然能发生不同程度的亲核加成反应，但加成产物的结构却是完全不同，其中只有h2s的加成产物具有裸露的-sh，而其它硫化物的加成产物只能产生c-s-c结构，硫原子以硫醚的形式存在，因此具有性能迥异的金属离子识别能力(以cu2 离子为例)。uio-66-ma与h2s反应后所得到的材料，亦即uio-66-ma/h2s，由于具有裸露的-sh，具有很强的过渡金属亲核性，因此可以用来构建金属离子识别体系，利用金属离子识别活性的差异将h2s加成产物与其它含硫化合物的加成产物进行有效区分，进而也可以为前一步h2s的探测识别结果提供第二重有效性验证。经过第一步的亲核加成导致的选择性荧光增强，以及第二步的选择性金属离子配位引发的荧光猝灭，通过交叉比较两步的结果可以建立对h2s的选择性识别唯一结果。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
uio-66-ma的合成
uio-66-nh2的合成参照文献方法进行。
将新鲜制备的uio-66-nh2(1mmol，约0.28g)及马来酸酐(2mmol，0.196g)加入到20ml的无水四氢呋喃中，在氮气保护下加热回流搅拌反应36h。反应结束，离心收集固体，并用丙酮进行洗涤，然后真空室温干燥6h，可得uio-66-ma为淡黄色粉末约0.33g。
1hnmr测试
将新合成的uio-66-ma约20mg加入到10ml的koh溶液(4m)中，超声震荡30分钟。然后离心分离获得上清液，并用浓盐酸调节ph＝1。析出的沉淀用乙酸乙酯进行萃取，有机相经浓缩干燥后获得黄色固体粉末，加入到dmso-d6中，在400mhz核磁共振仪上测试记录其氢核磁共振谱图。硫化氢识别后样品的核磁共振谱图依照类似步骤实施。
反应前后，电镜照片显示材料良好保持了其微观形貌(如图2所示)，而粉末衍射测试表明材料的结构并没有发生显著变化(如图3所示)，充分说明后修饰的成功。对uio-66-ma进行红外测试表明，1299.8cm-1出现新的振动吸收峰，可以归属为酰胺c-n键的振动，而自由氨基在1656.6cm-1处的弯曲振动吸收变弱，全面表明成功在uio-66-nh2的氨基位点上引入了马来酰亚胺结构(如图4和图5所示)。xps测试表明，uio-66-ma中的n1s结合能从uio-66-nh2中的399.55ev增加到了400.07ev，而元素结合能的增加表明其电荷密度下降，表明成功在n原子上引入了强吸电子的羰基结构，也侧面印证了后修饰的成功(如图6所示)。
此外，将uio-66-ma进行破坏并进行1hnmr测试可以获得最直接的修饰信息。测试表明，在化学位移6.63-6.32区间内出现了典型的烯烃氢的磁共振信号，直接表明成功在uio框架上引入了马来酰亚胺结构。进一步研究发现，芳环区出现两组不同种类的磁共振信号，是由于氨基的不完全酰胺化导致的。积分计算表明，酰胺化和未酰胺化的比例为2:1，因此可知在经过后修饰处理后uio-66-nh2内约2/3的氨基被成功酰胺化(如图7和图8所示)。n2吸附/脱附测试表明，uio-66-ma表现出典型的i型吸附脱附行为，说明良好保持了原有的微观框架结构，而其比表面积相比于uio-66-nh2的922.6m2g-1下降到了599.7m2g-1，孔体积也发生显著缩小，主要归因于孔道内引入马来酰亚胺结构所致。(如图9和图10所示)。
实施例2
uio-66-ma对h2s的荧光增强型定量识别
以na2s作为h2s的来源设计实施荧光检测应用。将0.5mg新制备的uio-66-ma超声分散在1ml具有不同浓度的na2s水溶液中，溶液浓度分别为0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.25,1.45,1.67,1.875,2.01,2.5,3.0,3.5,4.1,5.2,6.25μm。超声分散均匀后在345nm激发下测试其荧光发光光谱。
抗干扰性测试
将0.5mg新制备的uio-66-ma超声分散在1ml含有各类不同干扰性物质的水溶液中，分别在345nm激发下测试其荧光发光光谱。干扰性物质的浓度均为0.6μm，分别用ki，nabr，na2s2o3,na2so4,nahso3,nacl,na2so3,l-半胱氨酸(cys)及谷胱甘肽(gsh)来提供实验所需的i-，br-，s2o32-,so42-,hso3-,cl-,so32-,cys及gsh作为干扰源。
测试表明，uio-66-nh2具有一定的荧光发光活性，在修饰以马来酰亚胺结构后，由于羰基的吸电子效应发生分子内电荷从芳环向酰胺结构的电荷转移，引起荧光猝灭。当加入h2s后，由于马来酰亚胺结构可以选择性与h2s发生迈克尔加成，在体系内引入富电子的-sh基团，从而使得原有的电荷转移途径发生变化。在h2s处理过后的样品内，电荷主要从-sh向马来酰亚胺基团进行转移，此时配体芳环结构的激发能量可以通过π-π*跃迁的方式发射出蓝色荧光，从而表现出荧光恢复，并随着h2s加入量的增多，越来越多的单元内的电荷转移途径发生了改变，从而表现出逐渐增强的荧光发射(如图12所示)。由于荧光增强的过程是基于量化的反应单元累积叠加，因此在一定范围内可以发现荧光增强因子与h2s的浓度呈现线性相关(如图13所示)。uio-66-ma荧光发光强度随h2s浓度(1-4.5μm)增加的总体变化趋势的线性方程为：y＝8.94x-7.51。
荧光增强因子计算公式如下：
荧光增强因子
其中i和i0分别是uio-66-ma在添加和不添加各类分析测试物质情况下的荧光发射强度。
干扰性实验表明，uio-66-ma具有极强的h2s选择性，对h2s的最大荧光增强因子可以高达31.5，而相对的，cys和gsh的荧光增强因子仅为1.7和2.1(如图14和图15所示)。通过荧光增强因子的对比可以发现，uio-66-ma具有极高的h2s特异选择性。该选择性的来源主要是利用了uio-mof的孔道限域效应及亲核加成的选择性。uio-mof原有的孔道经过后修饰处理后引入了大体积的马来酰亚胺单元，占据了大部分原有孔道内的空间，使得cys及gsh等分子尺寸较大的干扰物不能有效进入内部发生亲核加成反应，因此无法获得较高的荧光增强效应。此外，该亲核加成反应对于亲核试剂的活性有较高要求，其它常见的含s类阴离子不能满足对亲核性的要求，因此也不能有效增强uio-66-ma的荧光发射强度。
uio-66-ma在测试完成后良好的保持了原有结构的微观形貌(如图2所示)及稳定性(如图3所示)，而且经红外测试表明，h2s处理过的样品中出现了c-s键的特征性振动吸收(1133.9cm-1)以及脂肪族c-c键振动吸收(1002.8cm-1)，表明成功发生了h2s的亲核加成反应(如图4和图16所示)。xps测试也表明了在h2s处理过的样品中存在s元素(如图17所示)，而且将反应后的样品按照前述步骤进行了氢核磁共振测试，结果表明原有烯烃h的特征性磁共振信号(6.63-6.32区间内)彻底消失了，而经过亲核加成反应后原有的烯烃结构被还原为饱和脂肪族碳链，特征性的氢磁共振信号及巯基h的磁共振信号在化学位移4.5-1.0区间内出现，直接表明h2s成功与uio-66-ma发生了亲核加成反应(如图18和图19所示)。
实施例3
uio-66-ma/h2s对cu2 离子的荧光猝灭型定量检测
根据实施例2，将uio-66-ma用h2s处理彻底转化为相应的亲核加成产物，得到的样品命名为uio-66-ma/h2s。在1ml浓度为0.5mg/ml的uio-66-ma/h2s水分散液中，分别加入一定量的cu(no3)2，使得cu2 离子的浓度分别为0,0.02,0.05,0.07,0.1,0.12,0.15,0.17,0.2,0.25,0.275,0.3μm。依次在345nm激发下测试其荧光发光光谱。将h2s替换为半胱氨酸，其它条件保持不变，测试cys加成产物对cu2 离子的识别活性。
分析测试表明，加入cu2 离子后，样品的形貌及结构仍然保持不变(如图2和图3所示)。红外吸收测试表明c-s键(1133.9cm-1)的振动吸收强度显著降低，说明发生了s-cu配位(如图4所示)。进一步的xps测试表明，样品出现了二价cu2 离子(如图20所示)，而且对比s的xps图谱可以发现，加入cu2 离子后s的2p结合能显著增加，说明发生s-cu配位引起s原子上电荷密度降低(如图17所示)。
由于s-cu的强烈亲和性，uio-66-ma/h2s中的s原子可以与加入的cu2 离子进行选择性配位，发生s向cu的电荷转移。配位后，cu2 离子的非充满壳层电子构型使得其可以通过d-d跃迁的形式消耗能量，从而导致材料整体的荧光发生猝灭。测试表明，uio-66-ma/h2s的荧光发射强度随着cu2 离子的浓度增加逐渐降低(如图21所示)，而且在0-0.2μm浓度范围内荧光猝灭因子与浓度呈现线性关联(如图22所示)。荧光猝灭因子的计算按照与荧光增强因子相同的方式进行。uio-66-ma/h2s随cu2 离子浓度增加荧光发光强度的整体变化趋势的线性方程为：y＝1-2.27x。
与此相对的，cys加成产物uio-66-ma/cys则只能表现极弱的cu2 离子响应活性，添加cu2 离子后其荧光强度只能微弱下降(如图23所示)，对比发现uio-66-ma/h2s具有显著的，极大优于uio-66-ma/cys的cu2 离子猝灭因子(如图24所示)，从而可以有效区分h2s与cys加成的产物，亦即为间接区分h2s及其它干扰性硫化物提供了第二重验证保障。
由以上结果可知，本发明所构建的双向荧光硫化氢探针uio-66-ma可利用亲核加成以及s-cu配位两种组合式原理，以荧光增强和荧光猝灭的双向荧光响应方式构建硫化氢的唯一性选择识别，是拓展现有分子特异性识别机制，开发基于多重组合式作用原理的重要开拓工作。
1.一种双向荧光硫化氢探针，其特征在于：所述探针是通过对带有氨基的锆基框架材料进行酰胺化修饰后得到。
2.根据权利要求1所述的双向荧光硫化氢探针，其特征在于：所述带有氨基的锆基框架材料为uio-66-nh2，所述酰胺化修饰是采用马来酸酐与uio-66-nh2的氨基进行酰胺化反应。
3.权利要求1所述的双向荧光硫化氢探针在硫化氢识别中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述硫化氢识别是指双向荧光硫化氢探针先发生荧光增强识别硫化氢，然后再通过加入cu2 离子发生荧光猝灭对硫化氢识别进行第二重验证。
5.权利要求1所述的双向荧光硫化氢探针在硫化氢定量检测中的应用。
6.权利要求1所述的双向荧光硫化氢探针在制备硫化氢传感器中的应用。
技术总结