相关申请的交叉引用
本申请要求2017年10月18日提交的美国临时申请号62/573,835的权益，所述临时申请特此出于所有目的以引用的方式整体并入。
序列表
本申请含有已经以电子方式以ascii格式提交并且特此以引用的方式整体并入的序列表。所述ascii副本创建于2018年9月26日，名称为41619wo_crf_sequencelisting.txt并且大小为6,241字节。
背景技术：
全世界绝大多数癌症是实体瘤。在2016年，据估计，在美国将有超过1,600,000人被新诊断为患有恶性实体瘤(siegel等人(2016),cancerstatistics,2016.ca:acancerjournalforclinicians,66:7–30)。对于实体瘤的当前护理标准包括手术切除、放射疗法、细胞毒性化学疗法以及分子靶向的小分子和单克隆抗体(mab)。尽管有这些疗法，但大多数患有转移性癌症的患者仍将死于所述疾病和/或治疗并发症。由于预先存在或出现的耐药性，靶向癌症的小分子作为单一剂的功效有限，并且通常对正常细胞表现出毒性。
治疗性抗体的开发已实质上影响了一些类型的癌症的治疗。常规地，这些重组蛋白特异性地结合癌细胞并阻断信号传导途径或标记它们以被免疫系统破坏。然而，仅针对少数癌症存在靶向抗体，即使是最有效的抗体也可能需要与常规化学疗法联合治疗，并且经常产生不完全的治疗应答。在许多患者中，疾病通过失去抗体靶标(当分子对于肿瘤细胞存活非必需时)或通过发展对肿瘤杀伤的耐药性而对抗体治疗产生耐药性。通常患者经历疾病复发。
cd47已被鉴定为通过先天免疫系统介导癌细胞逃避吞噬作用的关键分子。cd47似乎是一种不可或缺的手段，癌细胞(包括癌症干细胞)克服它们的吞噬前信号“吃掉我”的内在表达。从正常细胞进展至癌细胞涉及触发程序性细胞死亡(pcd)和程序性细胞除去(pcr)的基因和/或基因表达的变化。癌症进展中的许多步骤都颠覆了pcd的多种机制，并且显性抗吞噬信号cd47的表达可代表重要的检查点。
cd47的表达在来自大量不同人肿瘤类型的癌细胞的表面上增加，包括以下原发性恶性肿瘤：头颈部肿瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、平滑肌肉瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、少突胶质细胞瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。在鼠异种移植物研究中，已显示cd47阻断抗体通过实现吞噬作用和消除来自各种血液系统恶性肿瘤和若干实体瘤的癌症干细胞和癌细胞来抑制人癌症生长和转移。
cd47充当sirpα的配体，它在吞噬细胞包括巨噬细胞和树突细胞上表达。当sirpα通过cd47结合活化时，它起始信号转导级联反应，从而抑制吞噬作用。以这种方式，cd47通过向吞噬细胞传递显性抑制信号而充当抗吞噬信号。已经证明阻断性抗cd47抗体能够吞噬消除癌症干细胞和癌细胞。
在小鼠异种移植物中，cd47阻断抗体通过实现吞噬作用和消除来自各种血液系统恶性肿瘤和实体瘤中的癌细胞来抑制人异种移植物肿瘤的生长和转移。此外，cd47阻断抗体与已确立的癌细胞靶向抗体利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗协同作用，以增强一些肿瘤类型中的治疗功效。
用于有效递送阻断cd47的抗体的方法具有临床意义，并且在本文中提供。
技术实现要素：
本文公开了一种治疗患有上皮性卵巢癌的人受试者或减小所述人受试者的所述上皮性卵巢癌的大小的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗cd47剂。抗cd47剂可包括抗cd47抗体。
所述上皮性卵巢癌可以是浆液性肿瘤、粘液性肿瘤、透明细胞肿瘤、子宫内膜样肿瘤、移行细胞肿瘤、布伦纳瘤、癌肉瘤肿瘤、混合性上皮肿瘤、交界性上皮肿瘤、未分化癌肿瘤、输卵管肿瘤或原发性腹膜肿瘤。在一些方面，所述上皮性卵巢癌是浆液性肿瘤。在一些方面，如通过组织学分析亚分型所确定，所述浆液性卵巢癌是低级别或高级别型。
在一些方面，本文公开的方法还包括向所述人受试者施用至少一种另外的剂。
本文还公开了一种治疗患有卵巢癌的人受试者或减小所述人受试者的所述上皮性卵巢癌的大小的方法，所述方法包括向所述人受试者施用抗cd47剂；并且向所述人受试者施用至少一种另外的剂。抗cd47剂可包括抗cd47抗体。
所述另外的剂可包括以下中的至少一者：化学治疗剂、vegf抑制剂、parp抑制剂、免疫检查点抑制剂、免疫肿瘤学剂和叶酸抑制剂。
在一些方面，所述另外的剂是化学治疗剂。在一些方面，所述化学治疗剂是铂(顺铂/卡铂)。在一些方面，所述化学治疗剂是紫杉烷(紫杉醇
在一些方面，所述另外的剂是vegf抑制剂，任选地是贝伐单抗
在一些方面，所述另外的剂是parp抑制剂，任选地所述parp抑制剂是鲁卡帕尼
在一些方面，所述另外的剂是免疫检查点抑制剂，任选地其中所述另外的剂抑制ctla4、pd1和pdl1中的至少一者。
在一些方面，所述另外的剂是抑制叶酸代谢或靶向叶酸受体的叶酸抑制剂。
在一些方面，同时或依序施用所述抗cd47抗体和所述另外的剂。
在一些方面，所述抗cd47抗体包含igg4fc。在一些方面，所述抗cd47抗体与hu5f9-g4竞争结合至cd47。在一些方面，所述抗cd47结合至与hu5f9-g4相同的cd47表位。在一些方面，所述抗cd47抗体是hu5f9-g4。
在一些方面，所述抗体与药学上可接受的赋形剂一起配制在药物组合物中。
在一些方面，所述人受试者为铂敏感型。
在一些方面，所述人受试者是铂耐药型。
在一些方面，静脉内施用所述抗cd47抗体。在一些方面，腹腔内施用所述抗cd47抗体。在一些方面，肿瘤内施用所述抗cd47抗体。
在一些方面，与基线相比，施用降低所述受试者中的ca125水平，任选地其中约每月一次测量所述ca125水平。在一些方面，与基线相比，施用使所述受试者中的所述ca125水平降低至少30％-90％、40％-80％、50％-70％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。可用免疫测定法测量ca125。可使用mongia等人,performancecharacteristicsofsevenautomatedca125assays.amjclinpathol.2006年6月；125(6):921-7中公开的一种或多种测定来测量ca125；所述文献出于所有目的以引用的方式并入本文。
在一些方面，与基线相比，施用减小所述癌症或其转移的大小，任选地如通过成像所测量，任选地其中所述成像是ct/pet/ct或mri，任选地包括最初从基线增加、但随后大小减小的疾病。
在一些方面，与基线相比，施用降低ca125、he4(人附睾蛋白4)、ca-72-4、ca-19-9和cea中的至少一者的水平。
在一些方面，卵巢癌是上皮性卵巢癌，任选地是浆液性肿瘤、粘液性肿瘤、透明细胞肿瘤、子宫内膜样肿瘤、移行细胞肿瘤、布伦纳瘤、癌肉瘤肿瘤、混合性上皮肿瘤、交界性上皮肿瘤、未分化癌肿瘤、输卵管肿瘤或原发性腹膜肿瘤。在一些方面，卵巢癌是浆液性肿瘤。在一些方面，如通过组织学分析所确定，所述浆液性肿瘤是低级别或高级别型。
在一些方面，通过组织学分析确定肿瘤类型。
在一些方面，本文公开的方法还包括施用初免剂量的抗cd47抗体。在一些方面，本文公开的方法还包括施用初免剂量的促红细胞生成素刺激剂。
在一些方面，以约0.5至约5mg/kg抗体范围内，任选地为1mg/kg抗体的初免剂量向所述受试者施用抗cd47抗体。在一些方面，以约20至约67.5mg/kg抗体范围内，任选地为20mg/kg抗体、30mg/kg抗体、45mg/kg抗体、60mg/kg抗体或67.5mg/kg抗体的剂量向所述受试者施用抗cd47抗体。在一些方面，每周、每2周或每3周向所述受试者施用抗cd47抗体。
如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括：(a)向所述受试者施用初免剂量的抗cd47抗体，其中所述初免剂量是约0.5至约5mg/kg的抗体；以及(b)向所述受试者施用治疗有效剂量的抗cd47抗体，其中步骤(b)在开始步骤(a)后至少约3至14天之后、任选地在(a)之后7天进行。
在一些方面，所述方法包括(a)在第1天以1mg/kg抗体的剂量向所述受试者施用所述初免剂量的抗cd47抗体；以及(b)在第8天以20mg/kg抗体、30mg/kg抗体、45mg/kg抗体、60mg/kg抗体或67.5mg/kg抗体的剂量向所述受试者施用所述治疗有效剂量的所述抗cd47抗体。
在一些方面，基于施用所述初免剂量后所述受试者的贫血状况确定所述初免剂量的有效性。在一些方面，在以下情况下认为所述初免剂量有效：所述受试者的血红蛋白水平的下降不小于8.0g/dl；和/或所述受试者的血红蛋白水平的绝对下降小于3.0至3.75g/dl。
在一些方面，本文公开的方法还包括在步骤(a)之后且在步骤(b)之前：确定所述初免剂量的施用是否有效的步骤。在一些方面，所述确定步骤包括进行网织红细胞计数，其中如果所述网织红细胞计数为每l约100x109个网织红细胞至每l约–1000x109个网织红细胞，则确定所述初免剂量的施用已经有效。在一些方面，所述确定步骤包括进行网织红细胞计数，其中如果血液中的网织红细胞的百分比大于约1.5％，则确定所述初免剂量的施用已经有效。在一些方面，所述确定步骤包括进行网织红细胞计数，其中如果网织红细胞指数大于约2％，则确定所述初免剂的施用已经有效。
在一些方面，以具有约0.05mg/ml至约0.5mg/ml浓度的抗cd47抗体的输注液的形式向所述人受试者施用所述初免剂量。
如权利要求[0038]所述的方法，其中在至少约1-3、8-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时的时间段内递送所述输注液。在一些方面，在至少约3小时的时间段内递送所述输注液。在一些方面，在约2.5小时至约6小时的时间段内递送所述输注液。
在一些方面，在约6小时至约3天的时间段内通过连续泵递送所述初免剂量。
在一些方面，皮下递送所述初免剂量。
在一些方面，所述初免剂量使红细胞上至少约50％至100％的cd47位点、任选地红细胞上100％的cd47位点饱和。在一些方面，通过受体占用测定来确定所述剂量，其中在向所述受试者施用一定剂量的未标记的抗cd47剂后，获得血液样品并将所述血液样品与饱和剂量的可检测标记的抗cd47抗体合并；并且确定结合的水平。
在一些方面，(b)的所述治疗有效剂量足以实现大于100、250、500或1000μg/ml的所述抗cd47抗体的循环水平持续一段持续的时间段，任选地其中所述持续的时间段是至少1-28、7-28、7-21、14-28或21-28天。在一些方面，所述持续的时间段是约1、2、3或4周。
在一些方面，所述抗cd47抗体初免剂量是1mg/kg的抗体。
在一些方面，治疗有效的抗cd47抗体剂量是20mg/kg的抗体。
在一些方面，治疗有效的抗cd47抗体剂量是30mg/kg的抗体。
在一些方面，治疗有效的抗cd47抗体剂量是45mg/kg的抗体。
在一些方面，治疗有效的抗cd47抗体剂量是60mg/kg的抗体。
在一些方面，治疗有效的抗cd47抗体剂量是67.5mg/kg的抗体。
在一些方面，约每7、14、21或28天施用所述治疗有效的抗cd47抗体剂量。
在一些方面，每7天施用所述治疗有效的抗cd47抗体剂量。
本文还公开了一种治疗患有非上皮性卵巢癌的人受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗cd47抗体，任选地其中所述非上皮性卵巢癌是恶性性索肿瘤或恶性生殖细胞肿瘤。抗cd47剂可包括抗cd47抗体。
本文还公开了一种组合物，所述组合物包含抗cd47剂和至少一种另外的剂，任选地其中所述另外的剂是化学治疗剂、vegf抑制剂、parp抑制剂、免疫检查点抑制剂、免疫肿瘤学剂或叶酸抑制剂。抗cd47剂可包括抗cd47抗体。
本文还公开了一种药盒，所述药盒包括抗cd47抗体、至少一种另外的剂和使用说明书，任选地其中所述另外的剂是化学治疗剂、vegf抑制剂、parp抑制剂、免疫检查点抑制剂、免疫肿瘤学剂或叶酸抑制剂。抗cd47剂可包括抗cd47抗体。
附图说明
本发明的这些和其他特征、方面和优点关于以下描述和附图将变得更好理解，其中：
图1示出在施用hu-5f9-g4的五(5)名卵巢癌患者中的每一个中，ca125相对于基线的百分比(％)变化。
图2示出在基线和hu-5f9-g4施用后8周时11-305的扫描。肿瘤大小的变化在每个图中指示。
图3示出在基线和hu-5f9-g4施用后8周时11-305的扫描。肿瘤大小的变化在每个图中指示。
图4示出在基线和hu-5f9-g4施用后8周时11-305的扫描。肿瘤大小的变化在每个图中指示。
图5示出在基线和hu-5f9-g4施用后8周时01-312的扫描(左主动脉旁淋巴结)。肿瘤大小的变化在每个图中指示。
图6示出在基线和hu-5f9-g4施用后8周时01-312的扫描(肝门淋巴结)。肿瘤大小的变化在每个图中指示。
图7示出在基线和hu-5f9-g4施用后8周时01-312的扫描(腔静脉后淋巴结)。肿瘤大小的变化在每个图中指示。
图8示出在基线和hu-5f9-g4施用后8周时01-312的扫描(门静脉周淋巴结)。肿瘤大小的变化在每个图中指示。
具体实施方式
本发明涉及用抗cd47剂如hu5f9-g4治疗患有卵巢癌的受试者的方法。
在描述本发明方法和组合物之前，应理解本发明不限于所述的特定方法或组合物，因而当然也可有所变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且并不意图是限制性的，因为本发明的范围将仅受所附权利要求限制。
在提供数值范围的情况下，应理解，还明确公开了所述范围的上限与下限之间的各中间值，其中除非上下文另外明确地指出，否则精确至下限单位的十分位一。在所陈述范围中的任何陈述值或中间值与在所陈述范围中的任何其他陈述值或中间值之间的各个较小范围涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可被独立地包括在所述范围中或排除在所述范围外，并且当两个界限之一、都不或全都包括在所述较小范围中时各个范围也涵盖在本发明内，服从于在所陈述范围内任何确切排除的限值。当所陈述范围包括限值中的一者或两者时，本发明中还包括排除那些所包括的限值中的任一者或两者的范围。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术性和科学性术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。虽然在实践或测试本发明时可使用与本文所描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述一些可能和优选的方法和材料。为了公开和描述公布在引用时所涉及的方法和/或材料，本文中提到的所有公布均以引用的方式并入本文。应理解，如果有矛盾，本公开取代所并入公布的任何公开内容。
本领域的技术人员在阅读本公开时将显而易见的是，本文所描述且说明的各个个别实施方案具有离散组分和特征，所述组分和特征可易于与任何其他若干实施方案的特征分离或组合而不偏离本发明的范围或精神。任何叙述的方法均可以叙述的事件的顺序或以在逻辑上可能的任何其他顺序进行。
必须指出，除非上下文另外明确地规定，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“细胞”包括多个此类细胞且提及“肽”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种肽及其等效物，例如多肽，诸如此类。
本文所论述的出版物仅仅出于其在本申请的提交日期之前公开而提供。本文没有任何内容被解释为承认本发明不能由于现有发明而有权先于这种公布。此外，所提供的出版日期可不同于实际出版日期，其可能需要单独证实。
如本文所用，术语“抗cd47剂”是指减少cd47(例如，在靶细胞上)与sirpα(例如，在吞噬细胞上)的结合的任何剂。适合的抗cd47试剂的非限制性实例包括sirpα试剂，包括但不限于高亲和力sirpα多肽、抗sirpα抗体、可溶性cd47多肽和抗cd47抗体或抗体片段。在一些实施方案中，适合的抗cd47剂(例如抗cd47抗体、sirpα试剂等)特异性地结合cd47以减少cd47与sirpα的结合。在一些实施方案中，适合的抗cd47剂(例如，抗sirpα抗体、可溶性cd47多肽等)特异性地结合sirpα以减少cd47与sirpα的结合。结合sirpα的适合的抗cd47剂不会活化sirpα(例如，在表达sirpα的吞噬细胞中)。适合的抗cd47剂的功效可通过测定所述剂来评估(下文进一步描述)。在示例性测定中，在存在或不存在候选剂的情况下孵育靶细胞。用于本发明方法中的剂将使吞噬作用与不存在所述剂情况下的吞噬作用相比上调至少10％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少120％、至少140％、至少160％、至少180％或至少200％)。类似地，用于sirpα的酪氨酸磷酸化水平的体外测定将显示与在不存在候选剂的情况下观察到的磷酸化相比，磷酸化降低至少5％(例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％)。
在一些实施方案中，所述抗cd47剂在结合后不活化cd47。
当cd47被活化后，可能发生类似于细胞凋亡的过程(即程序性细胞死亡)(manna和frazier,cancerresearch,64,1026-1036,2004年2月1日)。因此，在一些实施方案中，所述抗cd47剂不直接诱导表达cd47的细胞的细胞死亡。
一些病原体(例如痘病毒、粘液瘤病毒、鹿痘病毒、猪痘病毒、山羊痘病毒、绵羊痘病毒等)表达cd47类似物(即cd47模拟物)(例如m128l蛋白)，所述cd47类似物充当导致感染的毒力因子(cameron等人,virology.2005年6月20日；337(1):55-67)，并且一些病原体诱导宿主细胞中内源性cd47的表达。感染了表达cd47类似物的病原体的细胞因此可单独或与内源性cd47一起表达病原体提供的cd47类似物。这种机制允许病原体在增加或不增加内源性cd47水平的情况下增加受感染细胞中的cd47表达(经由cd47类似物的表达)。在一些实施方案中，抗cd47剂(例如抗cd47抗体、sirpα试剂、sirpα抗体、可溶性cd47多肽等)可减少cd47类似物(即，cd47模拟物)与sirpα的结合。在一些情况下，适合的抗cd47剂(例如sirpα试剂、抗cd47抗体等)可结合cd47类似物(即cd47模拟物)以减少cd47类似物与sirpα的结合。在一些情况下，适合的抗cd47剂(例如，抗sirpα抗体、可溶性cd47多肽等)可结合至sirpα。结合sirpα的适合的抗cd47剂不会活化sirpα(例如，在表达sirpα的吞噬细胞中)。当病原体是提供cd47类似物的病原体时，抗cd47剂可用于本文提供的任何方法中。换句话说，如本文所用，术语“cd47”涵盖cd47以及cd47类似物(即，cd47模拟物)。
sirpα试剂包含足以以可识别的亲和力结合cd47的sirpα部分，所述部分通常位于信号序列与跨膜结构域或其保留结合活性的片段之间。适合的sirpα试剂减少(例如阻断、阻止等)天然蛋白sirpα与cd47之间的相互作用。sirpα试剂通常将至少包含sirpα的d1结构域。在一些实施方案中，sirpα试剂是例如与第二多肽框内融合的融合蛋白。在一些实施方案中，所述第二多肽能够增加融合蛋白的大小，例如以使得所述融合蛋白不会从循环中迅速清除。在一些实施方案中，所述第二多肽是免疫球蛋白fc区的部分或全部。fc区通过提供“吃掉我”信号来辅助吞噬作用，这增强由高亲和力sirpα试剂提供的“不要吃掉我”信号的阻断。在其他实施方案中，所述第二多肽是基本上类似于fc的任何适合的多肽，例如提供增加的大小、多聚化结构域和/或与ig分子的额外结合或相互作用。
在一些实施方案中，主题抗cd47剂是“高亲和力sirpα试剂”，其包括sirpα来源的多肽及其类似物。高亲和力sirpα试剂在国际申请pct/us13/21937中进行了描述，所述申请特此明确地以引用的方式并入。高亲和力sirpα试剂是天然sirpα蛋白的变体。在一些实施方案中，高亲和力sirpα试剂是可溶性的，其中所述多肽缺乏sirpα跨膜结构域并且包含相对于野生型sirpα序列的至少一个氨基酸改变，并且其中所述氨基酸改变例如通过使解离速率降低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或更多倍而增加sirpα多肽结合至cd47的亲和力。
高亲和力sirpα试剂包含足以以可识别的亲和力(例如高亲和力)结合cd47的sirpα部分，所述部分通常位于信号序列与跨膜结构域或其保留结合活性的片段之间。高亲和力sirpα试剂通常将至少包含具有修饰的氨基酸残基以增加亲和力的sirpα的d1结构域。在一些实施方案中，本发明的sirpα变体是例如与第二多肽框内融合的融合蛋白。在一些实施方案中，所述第二多肽能够增加融合蛋白的大小，例如以使得所述融合蛋白不会从循环中迅速清除。在一些实施方案中，所述第二多肽是免疫球蛋白fc区的部分或全部。fc区通过提供“吃掉我”信号来辅助吞噬作用，这增强由高亲和力sirpα试剂提供的“不要吃掉我”信号的阻断。在其他实施方案中，所述第二多肽是基本上类似于fc的任何适合的多肽，例如提供增加的大小、多聚化结构域和/或与ig分子的额外结合或相互作用。提供增加的亲和力的氨基酸改变位于d1结构域中，并且因此高亲和力sirpα试剂包含人sirpα的d1结构域，相对于d1结构域内的野生型序列具有至少一个氨基酸改变。这种高亲和力sirpα试剂任选地包含另外的氨基酸序列，例如抗体fc序列；野生型人的部分
除d1结构域外的sirpα蛋白，包括但不限于天然蛋白的残基150至374或其片段，通常是与d1结构域相邻的片段；等等。高亲和力sirpα试剂可以是单体的或多聚体的，即二聚体、三聚体、四聚体等。
在一些实施方案中，主题抗cd47剂是特异性地结合sirpα(即，抗sirpα抗体)并且减少一种细胞(例如，受感染的细胞)上的cd47与另一种细胞(例如，吞噬细胞)上的sirpα之间的相互作用的抗体。适合的抗sirpα抗体可结合sirpα而不活化或刺激通过sirpα的信号传导，因为sirpα的活化将抑制吞噬作用。相反，适合的抗sirpα抗体促进罹患疾病的细胞相对于正常细胞的优先吞噬。相对于其他细胞(未感染的细胞)表达更高水平的cd47的细胞(例如，受感染的细胞)将被优先吞噬。因此，适合的抗sirpα抗体特异性地结合sirpα(而不活化/刺激足够的信号传导应答来抑制吞噬作用)并阻断sirpα与cd47之间的相互作用。适合的抗sirpα抗体包括此类抗体的完全人、人源化或嵌合形式。人源化抗体由于其低抗原性而特别适用于人体内的体内应用。类似地，犬源化、猫源化等抗体分别特别适用于狗、猫和其他物种中的应用。目标抗体包括人源化抗体，或犬源化、猫源化、马源化、牛源化、猪源化等抗体及其变体。
可溶性cd47多肽。在一些实施方案中，主题抗cd47剂是可溶性cd47多肽，所述可溶性cd47多肽特异性地结合sirpα并减少之间的相互作用
如本文所用，“抗cd47抗体”是指减少cd47(例如，在靶细胞上)与sirpα(例如，在吞噬细胞上)的结合的任何抗体。非限制性实例在下文更详细地描述，并且包括但不限于hu5f9-g4。在一些实施方案中，主题抗cd47剂是特异性地结合cd47(即，抗cd47抗体)并且减少一种细胞(例如，受感染的细胞)上的cd47与另一种细胞(例如，吞噬细胞)上的sirpα之间的相互作用的抗体。在一些实施方案中，适合的抗cd47抗体在结合后不活化cd47。适合的抗体的非限制性实例包括克隆b6h12、5f9、8b6和c3(例如，如国际专利公布wo2011/143624中所描述，所述专利明确地以引用的方式并入本文)。适合的抗cd47抗体包括此类抗体的完全人、人源化或嵌合形式。人源化抗体(例如，hu5f9-g4)由于其低抗原性而特别适用于人体内的体内应用。类似地，犬源化、猫源化等抗体分别特别适用于狗、猫和其他物种中的应用。目标抗体包括人源化抗体，或犬源化、猫源化、马源化、牛源化、猪源化等抗体及其变体。
如本文所用，“抗体”包括提及与特定抗原免疫反应的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆抗体和单克隆抗体。所述术语还包括遗传工程化的形式，如嵌合抗体(例如，人源化鼠类抗体)和异缀合物抗体。术语“抗体”还包括抗体的抗原结合形式，包括具有抗原结合能力的片段(例如，fab'、f(ab')2、fab、fv和rigg。所述术语还指重组单链fv片段(scfv)。术语抗体还包括二价或双特异性分子、双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体。术语抗体的另外描述在下文找到。
出于本发明的目的，“患者”包括人和其他动物，特别是哺乳动物，包括宠物和实验室动物，例如小鼠、大鼠、兔等。因此，所述方法可适用于人疗法和兽医学应用。在一个实施方案中，患者是哺乳动物，优选灵长类动物。在其他实施方案中，患者是人。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用来指正在评估治疗和/或正在治疗的哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物是人。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患有癌症的个体。受试者可以是人，而且还包括其他哺乳动物，特别是适用作人疾病的实验室模型的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。
如本文所用，短语“铂敏感性”是指在接受最后的基于铂的化学疗法后超过6个月发展复发性疾病的人受试者。
如本文所用，短语“铂耐药性”是指在接受最后的基于铂的化学疗法之后不到6个月发展复发性疾病的人受试者。
如本文所用，术语“基线”被定义为在向患有卵巢癌的人受试者首次治疗施用之前30天的时间段。
关于患者的术语“样品”包括生物起源的血液和其他液体样品、固体组织样品如活检标本或源自其的组织培养物或细胞及其子代。所述定义还包括在其取得之后以任何方式操作的样品，如用试剂处理、洗涤或针对某些细胞群体如癌细胞来加以富集。所述定义还包括已经富集特定类型的分子(例如核酸、多肽等)的样品。术语“生物样品”涵盖临床样品，并且还包括通过手术切除获得的组织、通过活检获得的组织、培养物中的细胞、细胞上清液、细胞溶解产物、组织样品、器官、骨髓、血液、血浆、血清等。“生物样品”包括从患者的癌细胞获得的样品，例如，包含从患者的癌细胞获得的多核苷酸和/或多肽的样品(例如，细胞溶解产物或包含多核苷酸和/或多肽的其他细胞提取物)；以及包含来自患者的癌细胞的样品。包含来自患者的癌细胞的生物样品也可包括非癌性细胞。
术语“诊断”在本文用于指分子或病理状态、疾病或疾患的鉴定，如乳腺癌、前列腺癌或其他类型的癌症的分子亚型的鉴定。
术语“预后”在本文用于指预测肿瘤性疾病(如卵巢癌)的癌症可归因的死亡或进展(包括复发、转移性扩散和耐药性)的可能性。术语“预测”在本文用于指基于观察结果、经验或科学推理的预言或估计行为。在一个实例中，医生可预测在手术切除原发性肿瘤和/或化学疗法一定时间段之后患者将存活而无癌症复发的可能性。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指为了获得作用而施用剂或进行手术。作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可为预防性的和/或就实现部分或完全治愈疾病和/或疾病的症状而言可为治疗性的。如本文所用，“治疗”可包括对哺乳动物，特别是人的肿瘤的治疗，并且包括：(a)预防所述疾病或疾病的症状在可易患所述疾病但尚未诊断为患有所述疾病的受试者中发生(例如，包括可与原发性疾病相关或由原发性疾病引起的疾病)；(b)抑制所述疾病，即遏止其发展；以及(c)减轻所述疾病，即引起所述疾病消退。
治疗可指成功治疗或改善或预防癌症的任何征候，包括任何客观或主观参数，如减轻；缓解；削弱症状或使疾病病状更可被患者耐受；减缓退化或衰退的速率；或使退化终点的致虚弱性较小。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数；包括医生检查的结果。因此，术语“治疗”包括施用本发明的化合物或剂以预防或延迟、减轻或遏止或抑制与癌症或其他疾病相关的症状或病状的发展。术语“治疗作用”是指减轻、消除或预防受试者的疾病、疾病的症状或疾病的副作用。
“与......组合”、“组合疗法”和“组合产物”在某些实施方案中是指向患者同时施用本文所述的剂。当组合施用时，每种组分可同时施用或在不同时间点以任何顺序依次施用。因此，每种组分可分开施用，但在时间上足够接近以提供所需的治疗作用。
在本发明的方法中，活性剂的“伴随施用”是指在使得所述剂将同时具有治疗作用的这种时间与试剂一起施用。这种伴随施用可涉及在施用所述剂同时(即，同一时间)、之前或之后施用。本领域普通技术人员将毫无困难地确定本发明的特定药物和组合物的适当施用时机、顺序和剂量。
如本文所用，术语“相关”或“与......相关”和类似术语是指两个事件的实例之间的统计关联，其中事件包括数字、数据集等。例如，当事件涉及数字时，正相关(本文也称为“直接相关”)意指当一个增加时，另一个也增加。负相关(本文也称为“逆相关”)意指当一个增加时，另一个减少。
“剂量单位”是指适合作为待治疗的特定个体的单一剂量的物理上离散的单位。每个单位都可含有与需要的药物载体结合的经计算产生所需治疗作用的预定量的活性化合物。剂量单位形式的规格可通过(a)所述活性化合物的独特特性和要获得的特定治疗效果，和(b)在合成这些活性化合物的领域中固有的限制来规定。
“治疗有效量”意指在向受试者施用以用于治疗疾病时，足以实现对所述疾病的治疗的量。
受体占用(ro)测定测量cd47结合剂(例如抗cd47抗体(ab))对cd47占用的水平。测量cd47ro水平的目的是确定cd47结合剂的剂量、cd47受体饱和度和药理学作用之间的关系。随时间推移的受体占用百分比可提供有关产生所需药理学作用所需的药物量或暴露持续时间的有用信息。这种测定可用于通过测量替代细胞，例如cd45阴性(-)红细胞(rbc)和cd45阳性( )白细胞(wbc)或其他细胞群体(例如通过组织活检获得的骨髓或组织细胞)上的cd47ro来确定体内的总体ro。ro测定也可用于确定用于cd47结合和/或阻断疗法的靶细胞(例如rbc、白血病细胞或实体瘤细胞)上的cd47ro。
令人感兴趣的是，这种测定用于确定与所需的药理学作用相关的cd47受体占用的阈值。此阈值可通过离体(体外)进行的测定或通过体内给药/治疗过程中的样品分析来确定。
在所述测定的一个实施方案中，通过使用各种浓度的荧光染料缀合的抗体，形成关于目标细胞的cd47结合标准曲线。通过将靶细胞与不同浓度的未标记的抗体一起孵育来测量受体占用率，且然后在体外吞噬作用中测定细胞或基于所述标准曲线将细胞与饱和浓度的标记的抗体一起孵育并通过流式细胞术分析结合。受体占用率计算如下：
％ro＝100–((mfi测试–mfi未染色的)/(mfi饱和的std–mfi未染色的))x100
在其他实施方案中，通过向患者输注限定剂量的抗体、通常在输注所述抗体之前和之后从患者获得组织样品(例如血液样品)来进行所述测定。将组织样品与饱和浓度的标记的抗体一起孵育，并通过流式细胞术进行分析。所述分析可例如在红细胞、白细胞、癌细胞等上进行门控。
已经发现实现rbc上至少约80％的cd47饱和度的初免剂量足以诱导对贫血的补偿并在随后的剂量降低贫血程度。在人中，已发现初免剂量是如上所论述，即约0.5mg/kg至约5mg/kg。在本发明的一些实施方案中，用候选cd47结合剂进行受体占用测定以确定初免剂量的水平，所述初免剂量提供rbc上至少约50％的饱和度、至少约60％的饱和度、至少约70％的饱和度、至少约80％的饱和度、至少约90％的饱和度、至少约95％的饱和度、至少约99％的饱和度或更高。
在本发明的一些实施方案中，进行受体占用测定以确定候选抗cd47剂(例如结合至cd47、sirpα多肽等的抗体)的适当初免剂量。
治疗方法
提供了用治疗剂量的抗cd47剂治疗受试者的方法。主题方法包括向受试者施用初免剂(primeragent)的步骤，随后是向受试者施用治疗有效剂量的抗cd47剂的步骤。在一些实施方案中，施用治疗有效剂量的步骤在开始施用初免剂后至少约3天(例如，至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天或至少约10天)之后进行。这种时间段例如足以提供个体的增强的网织红细胞产生。
治疗有效剂量的抗cd47剂的施用可以许多不同方式实现。在一些情况下，在施用初免剂之后施用两个或更多个治疗有效剂量。治疗有效剂量的适合施用可要求施用单剂量，或者可需要每日一次、每半周一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每年等施用剂量。在一些情况下，将治疗有效剂量作为浓度递增的两个或更多个剂量(即增加剂量)施用，其中(i)所有剂量均是治疗剂量，或者其中(ii)初始给予亚治疗剂量(或两个或更多个亚治疗剂量)，并通过所述递增来达到治疗剂量。作为说明递增浓度(即，增加剂量)的一个非限制性实例，可从亚治疗剂量(例如5mg/kg的剂量)开始每周一次施用治疗有效剂量，并且每个后续剂量可以特定的增量(例如5mg/kg)或可变的增量增加，直到达到治疗剂量(例如，30mg/kg)，此时可停止施用或者可继续施用(例如持续治疗剂量，例如30mg/kg的剂量)。作为说明递增浓度(即，增加剂量)的另一个非限制性实例，可从治疗剂量(例如10mg/kg的剂量)开始每周一次施用治疗有效剂量，并且每个后续剂量可以特定的增量(例如10mg/kg)或可变的增量增加，直到达到治疗剂量(例如，30mg/kg、100mg/kg等)，此时可停止施用或者可继续施用(例如持续治疗剂量，例如30mg/kg、100mg/kg的剂量等)。在一些实施方案中，治疗有效剂量的施用可以是连续输注，并且剂量可随时间推移而改变(例如递增)。
剂量和频率可取决于抗cd47剂在患者体内的半衰期而变化。本领域技术人员将理解，此类指南将例如在抗体片段的使用中、在抗体缀合物的使用中、在sirpα试剂的使用中、在可溶性cd47肽的使用中等根据活性剂的分子量进行调整。对于局部施用(例如鼻内、吸入等)或对于全身施用(例如肌内、腹膜内、静脉内、皮下等)，剂量也可变化。
cd47结合剂的初始剂量(包括但不限于初免剂量)可在紧随输注后的时间段内导致血凝。不受理论束缚，据信多价cd47结合剂的初始剂量可引起结合至所述剂的rbc的交联。在本发明的某些实施方案中，cd47结合剂在一段时间内和/或降低存在rbc和所述剂的高局部浓度的血液微环境的可能性的浓度下以初始剂量并且任选地以后续剂量输注给患者。
在一些实施方案中，在至少约2小时、至少约2.5小时、至少约3小时、至少约3.5小时、至少约4小时、至少约4.5小时、至少约5小时、至少约6小时或更长的时间段内输注初始剂量的cd47结合剂。在一些实施方案中，在约2.5小时至约6小时、例如约3小时至约4小时的时间段内输注初始剂量。在一些此类实施方案中，输注液中剂的剂量是约0.05mg/ml至约0.5mg/ml；例如约0.1mg/ml至约0.25mg/ml。
在其他实施方案中，通过连续输注，例如作为渗透泵、递送贴剂等施用初始剂量的cd47结合剂(例如初免剂量)，其中在至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天的时间段内施用所述剂量。许多此类系统是本领域中已知的。例如，duros技术提供了由活塞隔开的双隔室系统。所述隔室中的一个包括专门用过量的固体nacl配制的渗透引擎，以使得它在整个递送时间段中保持存在，并且产生恒定的渗透梯度。它在一端还包括半透膜，水通过所述半透膜被吸入渗透引擎中并在组织水与渗透引擎之间建立大且恒定的渗透梯度。另一隔室包括具有孔口的药物溶液，药物由于渗透梯度而从所述孔口释放出来。当植入人体内时，这有助于提供部位特异性和全身性药物递送。植入的优选部位是皮下放置在上臂内侧。
在施用初免剂并允许有效增加网织红细胞产生的时间段后，施用治疗剂量的抗cd47剂。所述治疗剂量可以多种不同方式施用。在一些实施方案中，在施用初免剂后，例如以每周给药时间表施用两个或更多个治疗有效剂量。在一些实施方案中，治疗有效剂量的抗cd47剂以浓度递增的两个或更多个剂量施用，在其他实施方案中剂量是相等的。初免剂量后血凝减轻，并且因此不需要延长的输注时间。
提供了用于治疗患有卵巢癌的人受试者或减小卵巢癌的大小的方法，方法方法包括向所述受试者施用抗cd47抗体和另外的剂。此类方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量或有效剂量的本发明的组合剂，包括但不限于与esa的组合。
另外的剂可增强抗cd47剂的功效。抗cd47抗体可组合施用或在另外的剂之前施用。
所述另外的剂可包括以下中的至少一者：化学治疗剂、vegf抑制剂、parp抑制剂、免疫检查点抑制剂、免疫肿瘤学剂和叶酸抑制剂。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与化学治疗剂一起施用。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与vegf抑制剂一起施用。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与parp抑制剂一起施用。
抗cd47抗体(例如，hu5f9-g4)可与免疫检查点抑制剂一起施用。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与免疫肿瘤学剂一起施用。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与叶酸抑制剂一起施用。
在一些方面，所述另外的剂是化学治疗剂。在一些方面，所述化学治疗剂是铂(顺铂/卡铂)。在一些方面，所述化学治疗剂是紫杉烷(紫杉醇
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与铂(例如，顺铂/卡铂)一起施用。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与紫杉烷(例如紫杉醇
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与吉西他滨一起施用。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与白蛋白结合型紫杉醇(例如，纳米白蛋白结合型紫杉醇，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与六甲蜜胺(例如，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与卡培他滨(例如，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与环磷酰胺(例如，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与依托泊苷(例如，vp-16)一起施用。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与吉西他滨(例如，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与异环磷酰胺(例如，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与伊立替康(例如cpt-11，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与脂质体阿霉素(例如，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与美法仑一起施用。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与培美曲塞(例如，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与托泊替康一起施用。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与长春瑞滨(例如，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与曲贝替定(例如，
在一些方面，所述另外的剂是vegf抑制剂，任选地是贝伐单抗
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与贝伐单抗(例如，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与瑞戈非尼(例如，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与阿柏西普(例如，
在一些方面，所述另外的剂是parp抑制剂，任选地所述parp抑制剂是鲁卡帕尼
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与鲁卡帕尼(例如，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与尼拉帕尼(例如，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与奥拉帕尼(例如，
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与他拉唑帕尼(例如，bmn-673)一起施用。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与维利帕尼(例如，abt-888)一起施用。
在一些方面，所述另外的剂是免疫检查点抑制剂，任选地其中所述另外的剂抑制ctla4、pd1和pdl1中的至少一者。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与ctla4抑制剂一起施用。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与pd1抑制剂一起施用。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与pdl1抑制剂一起使用。
在一些方面，所述另外的剂是抑制叶酸代谢或靶向叶酸受体的叶酸抑制剂。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与抑制叶酸代谢的叶酸抑制剂一起施用。
抗cd47剂(例如，hu5f9-g4)可与靶向叶酸受体的叶酸抑制剂一起施用。
将抗cd47抗体与本文所述的另外的剂的组合给予至具有对这些疗法有反应的肿瘤亚型的患者。如本文所述，这些肿瘤可由更高的突变频率来定义，从而导致更多的肿瘤抗原，因此更具免疫原性。在一些实施方案中，用组合疗法治疗的患者对用免疫活化剂或检查点抑制剂治疗有反应；然而，这代表了特定潜在反应性肿瘤亚型中大约25％患者的亚群。在一些实施方案中，所述个体可以是铂疗法敏感型或耐药型。
在一些实施方案中，主题方法包括向受试者施用初免剂的步骤，随后是向所述受试者施用治疗有效剂量的抗cd47抗体和另外的剂的步骤。在一些实施方案中，施用治疗有效剂量的步骤在开始施用初免剂后至少约3天(例如，至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天或至少约10天)之后进行。这种时间段例如足以提供个体的增强的网织红细胞产生。
治疗有效剂量的抗cd47抗体和/或另外的剂的施用可以许多不同方式实现。在一些情况下，在施用初免剂之后施用两个或更多个治疗有效剂量。治疗有效剂量的适合施用可要求施用单剂量，或者可需要每日一次、每半周一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每年等施用剂量。在一些情况下，将治疗有效剂量作为浓度递增的两个或更多个剂量(即增加剂量)施用，其中(i)所有剂量均是治疗剂量，或者其中(ii)初始给予亚治疗剂量(或两个或更多个亚治疗剂量)，并通过所述递增来达到治疗剂量。作为说明递增浓度(即，增加剂量)的一个非限制性实例，可从亚治疗剂量(例如5mg/kg的剂量)开始每周一次施用治疗有效剂量，并且每个后续剂量可以特定的增量(例如5mg/kg)或可变的增量增加，直到达到治疗剂量(例如，30mg/kg)，此时可停止施用或者可继续施用(例如持续治疗剂量，例如30mg/kg的剂量)。作为说明递增浓度(即，增加剂量)的另一个非限制性实例，可从治疗剂量(例如10mg/kg的剂量)开始每周一次施用治疗有效剂量，并且每个后续剂量可以特定的增量(例如10mg/kg)或可变的增量增加，直到达到治疗剂量(例如，30mg/kg、100mg/kg等)，此时可停止施用或者可继续施用(例如持续治疗剂量，例如30mg/kg、100mg/kg的剂量等)。在一些实施方案中，治疗有效剂量的施用可以是连续输注，并且剂量可随时间推移而改变(例如递增)。
剂量和频率可取决于抗cd47抗体和/或其另外的剂在患者体内的半衰期而变化。本领域技术人员将理解，此类指南将例如在抗体片段的使用中、在抗体缀合物的使用中、在sirpα试剂的使用中、在可溶性cd47肽的使用中等根据活性剂的分子量进行调整。对于局部施用(例如鼻内、吸入等)或对于全身施用(例如肌内、腹膜内、静脉内、皮下等)，剂量也可变化。
在本发明的某些实施方案中，抗cd47抗体在一段时间内和/或降低存在rbc和所述剂的高局部浓度的血液微环境的可能性的浓度下以初始剂量并且任选地以后续剂量输注给患者。
在本发明的一些实施方案中，在至少约2小时、至少约2.5小时、至少约3小时、至少约3.5小时、至少约4小时、至少约4.5小时、至少约5小时、至少约6小时或更长的时间段内输注初始剂量的抗cd47抗体。在一些实施方案中，在约2.5小时至约6小时、例如约3小时至约4小时的时间段内输注初始剂量。在一些此类实施方案中，输注液中剂的剂量是约0.05mg/ml至约0.5mg/ml；例如约0.1mg/ml至约0.25mg/ml。
卵巢癌
本文提供了用于治疗患有卵巢癌的个体或减小受试者的卵巢癌的大小的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的抗cd47抗体；以及任选地向所述受试者施用治疗有效量的至少一种另外的剂。
卵巢癌的实例包括上皮性卵巢癌，任选地是浆液性肿瘤、粘液性肿瘤、透明细胞肿瘤、子宫内膜样肿瘤、移行细胞肿瘤、布伦纳瘤、癌肉瘤肿瘤、混合性上皮肿瘤、交界性上皮肿瘤、未分化癌肿瘤、输卵管肿瘤或原发性腹膜肿瘤。
在一些实施方案中，上皮性卵巢癌是浆液性肿瘤。浆液性肿瘤卵巢癌可通过组织学分析亚分型被确定为低级别或高级别型。在一个实施方案中，所述个体为铂化学疗法敏感型。在另一个实施方案中，所述个体为铂化学疗法耐药型。
在一些实施方案中，所述患者具有低突变负荷。在一些实施方案中，所述患者具有高突变负荷。如本领域已知的，癌症类型可在突变的平均或具体程度上变化，其中更高水平的突变与新抗原的表达增加相关。参见，例如vogelstein等人(2013)，同上。低突变负荷可以是对于个体肿瘤，每个肿瘤具有平均或特定数量的至多约10、至多约20、至多约30、至多约40、至多约50个非同义突变的癌症类型。高突变负荷可以是每个肿瘤具有大于约50、大于约75、大于约100、大于约125、大于约150个非同义突变的癌症类型。
在一些此类实施方案中，癌症是但不限于卵巢癌。在一些此类实施方案中，所述癌症是具有高新抗原或诱变负荷的类型(参见vogelstein等人(2013)science339(6127):1546-1558，所述文献明确地以引用的方式并入本文)。在其他实施方案中，癌症是具有低新抗原负荷的类型。在一些此类实施方案中，本发明的组合疗法增强检查点抑制剂的活性。在其他实施方案中，当个体癌症对单独检查点抑制剂没有反应时，组合疗法提供治疗应答。在一些实施方案中，所述个体为铂敏感型。在其他实施方案中，所述个体为铂耐药型。
癌症
术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”在本文中可互换使用来指表现出自主的不受调控的生长、这样使得它们表现出异常生长表型的细胞，所述异常生长表型的特征在于对细胞增殖的控制的显著丧失。本申请中用于检测、分析或治疗的目标细胞包括癌前细胞(例如，良性细胞)、恶性细胞、转移前细胞、转移细胞和非转移细胞。几乎每种组织的癌症都是已知的。短语“癌症负荷”是指受试者中癌细胞的量或癌症体积。因此，减轻癌症负荷是指减少受试者中癌细胞的数量或癌症体积。如本文所用的术语“癌细胞”是指为癌细胞或源自癌细胞的任何细胞，例如癌细胞的克隆。许多类型的癌症是本领域技术人员已知的，包括实体瘤如癌、肉瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤等；以及循环癌症如白血病。癌症的实例包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌、癌、黑素瘤、头颈部癌和脑癌。
癌症的“病理学”包括损害患者健康的所有现象。这包括但不限于异常或不可控制的细胞生长、转移、干扰邻近细胞的正常功能、细胞因子或其他分泌产物以异常水平释放、遏制或加剧炎症或免疫应答、瘤形成、癌前病变、恶性肿瘤、侵袭周围或远处组织或器官如淋巴结等。
如本文所用，术语“癌症复发”和“肿瘤复发”及其语法变体是指在诊断癌症后赘生性细胞或癌细胞的进一步生长。特别地，当在癌组织中发生进一步的癌细胞生长时可发生复发。类似地，“肿瘤扩散”在肿瘤细胞播散到局部或远处组织和器官中时发生；因此，肿瘤扩散包括肿瘤转移。当肿瘤生长局部扩散以通过压迫、破坏或阻止正常器官功能来损害所涉及组织的功能时，发生“肿瘤侵袭”。
如本文所用，术语“转移”是指器官或身体部分中的癌性肿瘤的生长，其不直接连接至原始癌性肿瘤的器官。转移将被理解为包括微转移，其是在器官或身体部分中存在不可检测量的癌细胞，其不直接连接至原始癌性肿瘤的器官。转移也可被定义为过程的若干步骤，如癌细胞从原始肿瘤部位离开以及癌细胞迁移和/或侵入身体的其他部分。
临床终点
与基线相比，本文描述的方法产生至少一个改善的终点。
在本发明的一些实施方案中，与基线相比，在有或没有另外的剂的情况下施用抗cd47剂降低癌症标志物如ca125、he4(人附睾蛋白4)、ca-72-4、ca-19-9以及cea的水平。在一些实施方案中，与基线相比，在有或没有另外的剂的情况下施用抗cd47剂降低受试者的ca125。在一些实施方案中，约每月一次测量ca125的水平。在其他实施方案中，与基线相比，施用使所述受试者中的ca125水平降低至少30％-90％、40％-80％、50％-70％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在其他实施方案中，与基线相比，施用减小所述癌症或其转移的大小，任选地如通过成像所测量，任选地其中所述成像是ct/pet/ct或mri，任选地包括最初相比基线增加、但随后大小减小的疾病。
如本文所用，治疗的终点将给予本领域已知以及食品和药品管理局所使用的含义。
总体存活期被定义为从任何原因随机化直至死亡的时间，并在意向治疗群体中进行测量。存活被认为是最可靠的癌症终点，并且当可进行研究以充分评估存活时，它通常是优选的终点。此终点精确且易于测量，由死亡日期记录。偏差不是终点测量的因素。应将存活改善分析为评估临床益处的风险-效益分析。可在随机化受控研究中评价总体存活率。如果毒性概况是可接受的，并且通常支持新药物批准，则可认为总体存活率的统计上显著的改善的证明具有临床意义。本发明方法的益处可包括患者的总体存活增加。
基于肿瘤评估的终点包括dfs、orr、ttp、pfs和治疗失败时间(ttf)。关于这些时间依赖性终点的数据的收集和分析是基于间接评估、计算和估计(例如，肿瘤测量值)。无疾病存活(dfs)被定义为从随机化直到肿瘤复发或因任何原因死亡的时间。这种终点的最频繁使用是在确定性手术或放射疗法后的辅助治疗中。当大部分患者通过化学疗法实现完全应答时，dfs也可能是重要的终点。
客观应答率。orr被定义为肿瘤大小减小预定量且持续最小时间段的患者的比例。应答持续时间通常从初始应答直到记录的肿瘤进展的时间进行测量。通常，fda已将orr定义为部分应答加完全应答的总和。当以这种方式定义时，orr是药物抗肿瘤活性的直接量度，其可在单臂研究中评价。
进展时间和无进展存活。ttp和pfs已成为药物批准的主要终点。ttp被定义为从随机化直到客观肿瘤进展的时间；ttp不包括死亡。pfs被定义为从随机化直到客观肿瘤进展或死亡的时间。肿瘤进展的准确定义是重要的并且应在方案中仔细详述。
抗体
本文所述的方法包括施用一种或多种抗体，即施用抗cd47抗体，并且在一些实施方案中，施用另外的抗体。如上所述，术语“抗体”包括提及与特定抗原免疫反应的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆抗体和单克隆抗体。所述术语还包括遗传工程化的形式，如嵌合抗体(例如，人源化鼠类抗体)和异缀合物抗体。术语“抗体”还包括抗体的抗原结合形式，包括具有抗原结合能力的片段(例如，fab'、f(ab')2、fab、fv和rigg。所述术语还指重组单链fv片段(scfv)。术语抗体还包括二价或双特异性分子、双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体。
抗体的选择可基于各种标准，包括选择性、亲和力、细胞毒性等。短语“特异性(或选择性)结合”至抗体或“与……特异性(或选择性)免疫反应”在涉及蛋白质或肽时，是指确定在蛋白质和其他生物制剂的异质群体中的蛋白的存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，指定的抗体以背景的至少两倍，更通常以背景的大于10至100倍结合到特定蛋白序列。一般来说，本发明的抗体在效应细胞(如自然杀伤细胞或巨噬细胞)存在下结合靶细胞表面上的抗原。效应细胞上的fc受体识别结合的抗体。
可通过重组方法，如在噬菌体或类似载体中选择重组抗体的文库或通过用抗原或编码所述抗原的dna对动物进行免疫来产生与特定抗原免疫反应的抗体。制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。或者，抗体可以是单克隆抗体。可使用杂交瘤方法制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，适当的宿主动物通常用免疫剂来进行免疫以引发淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生将特异性地结合至免疫剂的抗体。或者，淋巴细胞可在体外免疫。然后使用适合的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。
人抗体可使用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示文库来产生。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如其中内源性免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的小鼠来制备人抗体。在激发时，观察到人抗体产生，这与人中在所有方面中观察到的非常相似，包括基因重排、组装和抗体谱系。
抗体还作为许多由各种肽酶消化产生的良好表征的片段存在。因此，胃蛋白酶在铰链区中二硫键联下方消化抗体以产生f(ab)'2(fab的二聚体)，其本身是通过二硫键接合至vh-ch1的轻链。可在温和条件下还原f(ab)'2以使铰链区中的二硫键联断裂，从而将f(ab)'2二聚体转化成fab’单体。fab'单体实质上是具有铰链区的一部分的fab。虽然各种抗体片段根据完整抗体的消化加以定义，但是本领域技术人员将认识到，此类片段可以化学方法或通过使用重组dna方法来从头合成。因此，如本文所用的术语抗体还包括通过修饰完整抗体而产生的抗体片段，或使用重组dna方法从头合成的抗体片段(例如，单链fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段。
“人源化抗体”是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白分子。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(cdr)的残基被来自诸如小鼠、大鼠或兔的非人物种(供体抗体)的cdr的具有所需特异性、亲和力和能力的残基置换。在一些情况下，所述人免疫球蛋白的fr框架残基被对应的非人残基置换。人源化抗体还可包含既不发现于接受者抗体中也不发现于输入cdr或框架序列中的残基。通常，所述人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的基本全部，其中全部或基本全部的cdr区对应于非人免疫球蛋白的那些cdr区且全部或基本全部的框架(fr)区是人免疫球蛋白共有序列的那些fr区。所述人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常人类免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分。
可测试目标抗体诱导adcc(抗体依赖性细胞毒性)或adcp(抗体依赖性细胞吞噬作用)的能力。可通过检测标记或乳酸脱氢酶从溶解的细胞的释放或检测靶细胞活力降低(例如膜联蛋白测定)来监测和定量抗体相关的adcc活性。细胞凋亡的测定可通过末端脱氧核苷酸基转移酶介导的地高辛-11-dutp缺口末端标记(tunel)测定来进行(lazebnik等人,nature:371,346(1994)。细胞毒性也可通过本领域已知的检测试剂盒直接检测，如来自rocheappliedscience(indianapolis,ind.)的细胞毒性检测试剂盒。
抗cd47抗体
本文所述的方法包括施用抗cd47抗体。
cd47是具有单个ig样结构域和5个跨膜区的广泛表达的跨膜糖蛋白，其充当sirpα的细胞配体，其中结合通过sirpα的nh2末端v样结构域介导。sirpα主要在骨髓细胞上表达，所述骨髓细胞包括巨噬细胞、粒细胞、髓样树突状细胞(dc)、肥大细胞以及其前体，包括造血干细胞。介导cd47结合的sirpα上的结构决定簇由lee等人(2007)j.immunol.179:7741-7750；hatherley等人(2008)molcell.31(2):266-77；hatherley等人(2007)j.b.c.282:14567-75论述；并且sirpα顺式二聚化在cd47结合中的作用由lee等人(2010)j.b.c.285:37953-63论述。与cd47抑制正常细胞的吞噬作用的作用一致，有证据表明它就在它们的迁移期之前和期间在造血干细胞(hsc)和祖细胞上瞬时上调，并且cd47在这些细胞上的水平决定它们在体内被吞没的可能性。
术语“抗cd47剂”或“提供cd47阻断的剂”是指减少cd47(例如，在靶细胞上)与sirpα(例如，在吞噬细胞上)的结合的任何剂。适合的抗cd47试剂的非限制性实例包括sirpα试剂，包括但不限于高亲和力sirpα多肽、抗sirpα抗体、可溶性cd47多肽和抗cd47抗体或抗体片段。在一些实施方案中，适合的抗cd47剂(例如抗cd47抗体、sirpα试剂等)特异性地结合cd47以减少cd47与sirpα的结合。
在一些实施方案中，主题抗cd47抗体特异性地结合cd47并且减少一种细胞(例如，受感染的细胞)上的cd47与另一种细胞(例如，吞噬细胞)上的sirpα之间的相互作用的抗体。在一些实施方案中，适合的抗cd47抗体在结合后不活化cd47。一些抗cd47抗体不会减少cd47与sirpα的结合，并且这种抗体可被称为“非阻断性抗cd47抗体”。作为“抗cd47剂”的适合的抗cd47抗体可被称为“cd47阻断抗体”。适合的抗体的非限制性实例包括克隆b6h12、5f9、8b6和c3(例如，如国际专利公布wo2011/143624中所描述，所述专利明确地以引用的方式并入本文)。适合的抗cd47抗体包括此类抗体的完全人、人源化或嵌合形式。人源化抗体(例如，hu5f9-g4)由于其低抗原性而特别适用于人体内的体内应用。类似犬源化、猫源化等抗体分别特别适用于狗、猫和其他物种中的应用。目标抗体包括人源化抗体，或犬源化、猫源化、马源化、牛源化、猪源化等抗体及其变体。
在一些实施方案中，抗cd47抗体包含人iggfc区，例如igg1、igg2a、igg2b、igg3、igg4恒定区。在一个实施方案中，所述iggfc区是igg4恒定区。igg4铰链可通过氨基酸取代s241p稳定(参见angal等人(1993)mol.immunol.30(1):105-108，明确地以引用的方式并入本文)。
在一些实施方案中，所述抗cd47抗体与hu5f9-g4竞争结合至cd47。在一些实施方案中，所述抗cd47结合至与hu5f9-g4相同的cd47表位。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括施用抗cd47抗体hu5f9-g4。在一些实施方案中，本文所述的方法包括施用具有与hu5f9-g4的序列至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列(轻链、重链和/或cdr)的抗cd47抗体。表1含有hu5f9-g4抗体重链和轻链的序列。cdr区以粗体示出。
表1
给药
本文所述的方法包括施用治疗有效剂量的组合物，即治疗有效剂量的抗cd47抗体和任选的另外的剂。
如上所述，组合物以足以基本上消除靶向细胞的量施用于患者。足以实现此目的的量被定义为“治疗有效剂量”，所述量可提供总体存活率的改善。可根据患者所需药和耐受的剂量和频率施用组合物的单次或多次给药。治疗所需的特定剂量将取决于哺乳动物的医学病状和病史以及其他因素，如年龄、体重、性别、施用途径、效率等。
用于治疗癌症的本发明的组合剂的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括施用方式、靶部位、患者的生理状态、患者为人还是动物、所施用的其他药物和治疗为预防性还是治疗性。一般来说，患者是人，但也可治疗非人哺乳动物，例如伴侣动物如狗、猫、马等，实验室哺乳动物如兔、小鼠、大鼠等。可滴定治疗剂量以使安全性和功效最优化。
抗cd47抗体的治疗有效剂量可取决于所用的具体剂，但通常是约20mg/kg体重或更高(例如，约20mg/kg或更高、约25mg/kg或更高、约30mg/kg或更多、约35mg/kg或更高、约40mg/kg或更高、约45mg/kg或更高、约50mg/kg或更高、或约55mg/kg或更高、或约60mg/kg或更高、或约65mg/kg或更高、或约70mg/kg或更高)、或约20mg/kg至约70mg/kg(例如，约20mg/kg至约67.5mg/kg，或约20mg/kg至约60mg/kg)。
在一些实施方案中，抗cd47抗体的治疗有效剂量是20、30、45、60或67.5mg/kg。在一些实施方案中，抗cd47抗体的治疗有效剂量是20至60mg/kg。在一些实施方案中，抗cd47抗体的治疗有效剂量是20至67.5mg/kg。
达到和/或维持所施用组合物的特定血清水平所需的剂量与剂量之间的时间量成正比，并且与所施用的剂量数成反比。因此，随着给药频率增加，所需剂量减少。本领域普通技术人员将容易地理解和实践剂量策略的优化。示例性治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。通常多次施用本发明的治疗性实体。单个剂量之间的间隔可为每周、每月或每年。间隔也可以是无规律的，如通过在患者中测量治疗性实体的血液水平所指示。或者，本发明的治疗性实体可作为缓释制剂施用，在此情况下要求不太频繁的施用。剂量和频率取决于患者中多肽的半衰期而变化。
“维持剂量”是意图为治疗有效剂量的剂量。例如，在确定治疗有效剂量的实验中，可向不同的受试者施用多种不同的维持剂量。如此，一些维持剂量可以是治疗有效剂量，并且其他可以是亚治疗剂量。
在预防性应用中，可在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生继续接受治疗。在其他治疗性应用中，有时要求相对较短间隔下的相对较高剂量直到疾病进展减少或终止为止，并且优选地直到患者显示疾病症状的部分或完全改善为止。此后，可以预防性的方式施用本专利品。
在仍然其他实施方案中，本发明的方法包括治疗、减少或预防癌症的肿瘤生长、肿瘤转移或肿瘤侵袭，所述癌症包括癌、血液癌症、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤等。用于预防性应用，将药物组合物或药物以足以消除或降低风险、减轻疾病的严重程度或延迟疾病的发作(包括所述疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在所述疾病的发展期间存在的中间病理学表型)的量施用于易患或否则处于疾病风险中的患者。
可通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中，例如通过确定ld50(对50％群体致死的剂量)或ld100(对100％群体致死的剂量)来确定本文所述的组合剂的毒性。毒性与治疗作用之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养物测定和动物研究中获得的数据可用于配制对于在人种使用五毒的剂量范围。本文所述的蛋白质的剂量优选处于包括具有极小或无毒性的有效剂量的循环浓度的范围内。所述剂量可根据所采用的剂型和利用的施用途径而在此范围内变化。可由个体医师鉴于患者的病状来选择确切制剂、施用途径以及剂量。
初免剂和初免剂量
在本文所述方法的一些实施方案中，在向个体施用治疗有效剂量的抗cd47抗体之前施用初免剂。适合的初免剂包括促红细胞生成剂(esa)和/或初免剂量的抗cd47抗体。在施用初免剂并允许有效增加网织红细胞产生的时间段后，施用治疗剂量的抗cd47抗体。可根据在共同待决的专利申请ussn14/769,069中描述的方法进行施用，所述专利明确地以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，将本发明的剂的组合的施用与有效剂量的增加患者血细胞比容的剂，例如促红细胞生成素刺激剂(esa)组合。此类剂在本领域中是已知的并且在本领域中使用，包括例如aranesp→(阿法达贝泊汀)，epogen→nf/procrit→nf(阿法依伯汀)，omontys→(培尼沙肽)，procrit→等。
术语“初免剂量”或如本文所用是指使受试者对于施用治疗有效剂量的抗cd47剂致敏、以使得所述治疗有效剂量不会导致严重的rbc损失(血细胞比容降低或血红蛋白减少)的抗cd47剂的剂量。抗cd47剂的具体适当的初免剂量可根据所用剂的性质和许多受试者特异性因素(例如年龄、体重等)而变化。抗cd47剂的适合的初免剂量的实例包括约0.5mg/kg至约5mg/kg、约0.5mg/kg至约4mg/kg、约0.5mg/kg至约3mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约4mg/kg、约1mg/kg至约3mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg。在一些实施方案中，初免剂量优选是1mg/kg。
在本文所述的方法的一些实施方案中，以约0.5至约5mg/kg抗体范围内，任选地为1mg/kg抗体的初免剂量向所述受试者施用抗cd47抗体。在一些实施方案中，以约20至约67.5mg/kg抗体范围内，任选地为20mg/kg抗体、30mg/kg抗体、45mg/kg抗体、60mg/kg抗体或67.5mg/kg抗体的剂量向所述受试者施用抗cd47抗体。
在本发明的一些实施方案中，在向个体施用治疗有效剂量的抗cd47剂之前施用初免剂。适合的初免剂包括促红细胞生成剂(esa)和/或初免剂量的抗cd47剂。在施用初免剂并允许有效增加网织红细胞产生的时间段后，施用治疗剂量的抗cd47剂。所述治疗剂量可以多种不同方式施用。在一些实施方案中，在施用初免剂之后施用两个或更多个治疗有效剂量。在一些实施方案中，治疗有效剂量的抗cd47剂以浓度递增的两个或更多个剂量施用，在其他实施方案中剂量是相等的。
在本发明的一些实施方案中，提供hu-5f9g4的有效初免剂量，其中对于人所述有效初免剂量是约1mg/kg，例如至少约0.5mg/kg至不超过约5mg/kg；至少约0.75mg/kg至不超过约1.25mg/kg；至少约0.95mg/kg至不超过约1.05mg/kg；并且可以是约1mg/kg。
在本发明的一些实施方案中，在至少约2小时、至少约2.5小时、至少约3小时、至少约3.5小时、至少约4小时、至少约4.5小时、至少约5小时、至少约6小时或更长的时间段内输注初始剂量的cd47结合剂。在一些实施方案中，在约2.5小时至约6小时、例如约3小时至约4小时的时间段内输注初始剂量。在一些此类实施方案中，输注液中剂的剂量是约0.05mg/ml至约0.5mg/ml；例如约0.1mg/ml至约0.25mg/ml。
在一些实施方案中，可通过皮下途径，通过注射、贴剂、渗透泵等来递送初免剂量，如本领域中所已知的。
在施用初免剂并允许有效增加网织红细胞产生的时间段后，施用治疗剂量的抗cd47剂。所述治疗剂量可以多种不同方式施用。在一些实施方案中，在施用初免剂后，例如以每周给药时间表施用两个或更多个治疗有效剂量。在一些实施方案中，治疗有效剂量的抗cd47剂以浓度递增的两个或更多个剂量施用，在其他实施方案中剂量是相等的。
在其他实施方案中，通过连续输注，例如作为渗透泵、递送贴剂等施用初始剂量的cd47结合剂(例如初免剂量)，其中在至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天的时间段内施用所述剂量。许多此类系统是本领域中已知的。例如，duros技术提供了由活塞隔开的双隔室系统。所述隔室中的一个包括专门用过量的固体nacl配制的渗透引擎，以使得它在整个递送时间段中保持存在，并且产生恒定的渗透梯度。它在一端还包括半透膜，水通过所述半透膜被吸入渗透引擎中并在组织水与渗透引擎之间建立大且恒定的渗透梯度。另一隔室包括具有孔口的药物溶液，药物由于渗透梯度而从所述孔口释放出来。当植入人体内时，这有助于提供部位特异性和全身性药物递送。植入的优选部位是皮下放置在上臂内侧。
在施用初免剂并允许有效增加网织红细胞产生的时间段后，施用治疗剂量的抗cd47抗体。所述治疗剂量可以多种不同方式施用。在一些实施方案中，在施用初免剂后，例如以每周给药时间表施用两个或更多个治疗有效剂量。在一些实施方案中，治疗有效剂量的抗cd47抗体以浓度递增的两个或更多个剂量施用，在其他实施方案中剂量是相等的。初免剂量后血凝减轻，并且因此不需要延长的输注时间。
施用
在本文所述的方法中，将组合物例如抗cd47抗体和任选的另外的剂施用至受试者。所述组合物可通过胃肠外、局部、静脉内、腹腔内、肿瘤内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内方式施用。典型施用途径是静脉内或肿瘤内，但其他途径可同样有效。
在一些实施方案中，腹腔内施用所述抗cd47抗体和/或另外的剂。在一些实施方案中，静脉内施用所述抗cd47抗体和/或另外的剂。在一些实施方案中，肿瘤内施用所述抗cd47抗体和/或另外的剂。在一个实施方案中，施用初免剂量的抗cd47抗体，并且皮下递送所述初免剂量。在一些实施方案中，同时施用抗cd47抗体和另外的剂。在一些实施方案中，依序施用抗cd47抗体和另外的剂。
在一段时间内施用活性剂以对宿主中癌细胞的耗竭产生累加或协同作用。施用方法包括但不限于全身施用、肿瘤内施用等。通常，在约45天、约30天、约21天、约14天、约10天、约8天、约7天、约6天、约5天、约4天、约3天、约2天、约1天的时间段内或与另外的剂基本上同一天施用抗cd47抗体。在一些实施方案中，在另外的剂之前施用抗cd47抗体。在一些实施方案中，在另外的剂之后施用抗cd47抗体。如果施用计划使得两种剂的血清水平在同时处于治疗水平，则可认为所述剂是组合的。可根据需要重复施用以耗尽癌细胞群体。
药物组合物
本文所述的方法包括施用包含抗cd47抗体和/或另外的剂的药物组合物。
通常，所述组合物被制备为呈液体溶液或悬浮液形式的可注射物；也可制备适于在注射之前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。制剂也可乳化或包封在脂质体或微粒如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物中以增强佐剂作用，如上文所论述。langer,science249:1527,1990和hanes,advanceddrugdeliveryreviews28:97-119,1997。本发明的剂可呈可允许活性成分持续或脉动释放的方式配制的储库注射液或植入制剂的形式施用。药物组合物通常被配制为无菌、大致上等渗并且完全遵循美国食品药品管理局的所有药品生产质量管理规范(gmp)条例。
所述药物组合物可取决于施用方法以各种单位剂型施用。例如，适用于口服施用的固体剂型包括但不限于粉末、片剂、丸剂、胶囊和锭剂。应认识到，当口服施用时，应保护本发明的组合物免于消化。这通常通过将分子与组合物络合以使所述分子对酸性和酶水解具有抗性，或通过将分子包装在适当的抗性载体(如脂质体或保护屏障)中来实现。保护蛋白质免于消化的方法在本领域中是熟知的。
用于施用的组合物通常将包含溶解于药学上可接受的载体，优选水性载体中的抗体或其他清除剂。可使用多种水性载体，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不合需要的物质。这些组合物可通过常规的、众所周知的灭菌技术进行灭菌。所述组合物可含有接近生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质，如ph调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的活性剂的浓度可广泛地变化，并且将根据所选的特定施用模式和患者的需求主要基于流体体积、粘度、患者体重等来选择(例如，remington'spharmaceuticalscience(第15版,1980)和goodman&gillman,thepharmacologicalbasisoftherapeutics(hardman等人,编辑,1996))。
“药学上可接受的赋形剂”是指适用于制备药物组合物的通常安全、无毒且合乎需要的赋形剂，并且包括可为兽医学用途以及人医药用途所接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或在气雾剂组合物的情况下可为气体。
“药学上可接受的盐和酯”是指药学上可接受的并具有所需药理学特性的盐和酯。此类盐包括可以形成的盐，其中存在于化合物中的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应。适合的无机盐包括用碱金属形成的那些，所述碱金属例如钠和钾、镁、钙以及铝。适合的有机盐包括用有机碱形成的那些，所述有机碱诸如胺碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、n甲基葡糖胺等。此类盐还包括用无机酸(例如，盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、马来酸、以及烷烃-和芳烃-磺酸诸如甲烷磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由存在于化合物中的羧基、磺酰基和膦酰基形成的酯，例如，c1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯或二盐或酯；并且类似地在存在超过两个酸性基团时，一些或所有此类基团可以被盐化或酸化。本发明中命名的化合物可以未盐化或未酯化形式、或以盐化和/或酯化形式存在，并且此类化合物的命名意图包括初始(未盐化和未酯化)化合物及其药学上可接受的盐和酯。此外，本发明中命名的某些化合物可以超过一种立体异构形式存在，并且此类化合物的命名意图包括所有单一立体异构体和此类立体异构体的所有混合物(外消旋的或其他的)。
术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”以及其语法变型当是指组合物、载体、稀释剂和试剂时可互换使用并且表示材料能够施用至或施用于人类而不会产生将禁止施用该组合物的程度的不期望的生理作用。
药盒
本文还描述了药盒，所述药盒包括活性剂(例如抗cd47抗体和任选的另外的剂)及其制剂以及使用说明书。所述药盒还可含有至少一种另外的试剂，例如化学治疗药物、esa等。药盒通常包括指示所述药盒的内容物的预期用途的标签。术语标签包括在药盒上或与药盒一起或另外伴随药盒提供的任何书面或记录材料。
还提供了用于本文公开的各种方法的药盒。主题药盒包括初免剂和抗cd47剂。在一些实施方案中，药盒包括两种或更多种初免剂。在一些实施方案中，药盒包括两种或更多种抗cd47剂。在一些实施方案中，以剂型(例如初免型)提供初免剂。在一些实施方案中，以两种或更多种不同的剂型(例如，两种或更多种不同的初免剂型)提供初免剂。在一些实施方案中，以剂型(例如治疗有效剂型)提供抗cd47剂。在一些实施方案中，以两种或更多种不同的剂型(例如，两种或更多种不同的治疗有效剂型)提供抗cd47剂。在药盒的情况下，可以液体或固体形式以任何方便的包装(例如棒状包装、剂量包装等)提供初免剂和/或抗cd47剂。
除了以上组分之外，本发明的药盒还可包括(在某些实施方案中)用于实践主题方法的说明书。这些说明书可以多种形式存在于主题药盒中，所述形式中的一种或多种可存在于所述药盒中。这些说明书可存在的一种形式是在药盒的包装、包装插入物等中在适合的介质或基底上的打印信息，例如，上面打印了信息的一张或多张纸。这些说明书的又另一种形式是其上记录有信息的计算机可读介质，例如软盘、压缩盘(cd)、闪存驱动器等。这些说明书可存在的又另一种形式是可在远离的地方通过因特网来获取信息而使用的网址。
序列
在一些实施方案中，本文描述的方法包括施用具有本文所述的序列；例如，本文所述的重链、轻链和/或cdr序列的抗体。所施用的抗体的序列可例如与本文所述的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，术语百分比“同一性”是指，如使用下文所述的序列比较算法(例如，blastp和blastn或技术人员可用的其他算法)之一或通过视觉检查所测量，在针对最大一致性进行比较和比对时两个或多个序列或子序列具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基。取决于应用，百分比“同一性”可存在于所比较的序列的区域上，例如在功能结构域上，或者可替代地，存在于待比较的两个序列的全长上。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与所述参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，把测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。序列比较算法然后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳比对可例如通过以下方法进行：smith和waterman，adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源性算法；needleman和wunsch，j.mol.biol.48:443(1970)的同源性比对算法；pearson和lipman，proc.nat'l.acad.sci.usa85:2444(1988)的对于相似性方法的探索；这些算法的计算机化实现(在wisconsingeneticssoftwarepackage中的gap、bestfit、fasta和tfasta，geneticscomputergroup,575sciencedr.,madison,wis.)；或视觉检查(通常参见ausubel等人，下文)。
适合用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是blast算法，其在altschul等人，j.mol.biol.215:403-410(1990)中描述。用于执行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心研究中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)(<www.ncbi.nlm.nih.gov/>)公开获得。
实施例
以下为用于进行本发明的特定实施方案的实施例。所述实施例仅出于说明性目的提供，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。对于所使用的数字(例如，量、温度等)，已尽力确保精确度，但是当然应该允许一些实验误差和偏差。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组dna技术和药理学的常规方法。此类技术在文献中被充分解释。参见例如，t.e.creighton,proteins:structuresandmolecularproperties(w.h.freeman和company,1993)；a.l.lehninger,biochemistry(worthpublishers,inc.,现行版n)；sambrook,等人,molecularcloning:alaboratorymanual(第2版,1989)；methodsinenzymology(s.colowick和n.kaplan编著,academicpress,inc.)；remington'spharmaceuticalsciences,第18版(easton,pennsylvania:mackpublishingcompany,1990)；carey和sundbergadvancedorganicchemistry第3版(plenumpress)a卷和b卷(1992)。
实施例1：抗cd47抗体的初免剂量的确定。
在i期临床试验中，以0.1mg/kg(n＝1)、0.3mg/kg(n＝2)、1.0mg/kg(n＝6)和3.0mg/kg(n＝2)向人癌症患者施用不同初免剂量的hu-5f9-g4。
在3.0mg/kg组中观察到两种剂量限制性毒性(dlt)(3级腹痛；血凝)。在1.0mg/kg下未观察到dlt。
选择1.0mg/kg作为初免剂量，以用于人受试者中的未来研究。
实施例2：用抗cd47抗体进行的卵巢癌治疗。
用hu-5f9-g4作为单一疗法治疗五名患有卵巢癌的女性癌症患者。表a中总结截至2017年7月的各自的给药方案和应答。
特别地，在5名患有卵巢/输卵管癌的患者中，有4名显示出ca125降低。参见图1，显示基线ca125的变化百分比(％)。
01-312：每周剂量20mg/kg
11-305和11-308：20mg/kg的负载剂量
13-311和13-312：30mg/kg的负载剂量
11-305和01-312还对基线和8周的扫描进行了分析。扫描在图2-8中示出。所述图表明，在每个患者中，肿瘤质量从基线至8周显著降低。值得注意的是，患有其他实体瘤类型(包括胰腺癌)的患者已以相似的剂量进行治疗，但迄今为止未达到治疗的客观应答。
实施例3：用抗cd47抗体治疗卵巢癌亚型。
选择卵巢癌患者以施用抗cd47抗体。
卵巢癌可包括浆液性肿瘤、粘液性肿瘤、透明细胞肿瘤、子宫内膜样肿瘤、移行细胞肿瘤、布伦纳瘤、癌肉瘤肿瘤、混合性上皮肿瘤、交界性上皮肿瘤、未分化癌肿瘤、输卵管肿瘤或原发性腹膜肿瘤。
向每个患者施用1mg/kg初免剂量的hu-5f9-g4。在7天后，施用治疗剂量(例如，20、30、45、60或67.5mg/kg)的hu-5f9-g4。在原始治疗剂量后以治疗剂量定期(例如每1、2、3或4周)重新施用hu-5f9-g4。定期监测每个患者的安全性和功效。
发现hu-5f9-g4在治疗人女性患者的卵巢癌方面有效。发现相对于基线，ca125在某些患者中降低。发现相对于基线，肿瘤质量在某些患者中降低。
实施例4：用抗cd47抗体和另外的剂治疗卵巢癌。
选择卵巢癌患者以施用抗cd47抗体。
卵巢癌可包括浆液性肿瘤、粘液性肿瘤、透明细胞肿瘤、子宫内膜样肿瘤、移行细胞肿瘤、布伦纳瘤、癌肉瘤肿瘤、混合性上皮肿瘤、交界性上皮肿瘤、未分化癌肿瘤、输卵管肿瘤或原发性腹膜肿瘤。
向每个患者施用1mg/kg初免剂量的hu-5f9-g4。在7天后，施用治疗剂量(例如，20、30、45、60或67.5mg/kg)的hu-5f9-g4。在原始治疗剂量后以治疗剂量定期(例如每1、2、3或4周)重新施用hu-5f9-g4。
还向每个患者施用另外的剂。
所述另外的剂可以是化学治疗剂、vegf抑制剂、parp抑制剂、免疫检查点抑制剂、免疫肿瘤学剂和/或叶酸抑制剂。
化学治疗剂可以是铂(顺铂/卡铂)。化学治疗剂可以是紫杉烷(紫杉醇
vegf抑制剂可以是贝伐单抗
parp抑制剂可以是鲁卡帕尼
免疫检查点抑制剂可抑制ctla4、pd1和pdl1中的至少一者。
叶酸抑制剂可抑制叶酸代谢或靶向叶酸受体。
hu-5f9-g4和另外的剂可同时或依序施用。
定期监测每个患者的安全性和功效。
发现hu-5f9-g4与另外的剂的组合在治疗人女性患者的卵巢癌方面有效。发现相对于基线，ca125在某些患者中降低。发现相对于基线，肿瘤质量在某些患者中降低。
虽然已经尤其参考优选实施方案和多种替代实施方案示出和描述了本发明，但相关领域的技术人员应理解，可在其中进行形式和细节的多种改变而不偏离本发明的精神和范围。
在本说明书的主体内引用的所有参考文献、授权专利和专利申请特此出于所有目的以引用的方式整体并入。
1.一种治疗患有上皮性卵巢癌的人受试者或减小所述人受试者的所述上皮性卵巢癌的大小的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗cd47抗体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
a.向所述受试者施用初免剂量的所述抗cd47抗体，其中所述初免剂量是约0.5至约5mg/kg的抗体；以及
b.向所述受试者施用治疗有效剂量的所述抗cd47抗体，其中步骤(b)在开始步骤(a)后至少约3至14天之后、任选地在(a)之后7天进行。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述方法包括(a)在第1天以1mg/kg抗体的剂量向所述受试者施用所述初免剂量的抗cd47抗体；以及(b)在第8天以20mg/kg抗体、30mg/kg抗体、45mg/kg抗体、60mg/kg抗体或67.5mg/kg抗体的剂量向所述受试者施用所述治疗有效剂量的所述抗cd47抗体。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述上皮性卵巢癌是浆液性肿瘤、粘液性肿瘤、透明细胞肿瘤、子宫内膜样肿瘤、移行细胞肿瘤、布伦纳瘤、癌肉瘤肿瘤、混合性上皮肿瘤、交界性上皮肿瘤、未分化癌肿瘤、输卵管肿瘤或原发性腹膜肿瘤。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述上皮性卵巢癌是浆液性肿瘤。
6.如权利要求5所述的方法，其中如通过组织学分析亚分型所确定，所述浆液性卵巢癌是低级别或高级别型。
7.如以上权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述人受试者施用至少一种另外的剂。
8.一种治疗患有卵巢癌的人受试者或减小所述人受试者的所述上皮性卵巢癌的大小的方法，所述方法包括向所述人受试者施用抗cd47抗体；并且向所述人受试者施用至少一种另外的剂。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述另外的剂包括化学治疗剂、vegf抑制剂、parp抑制剂、免疫检查点抑制剂、免疫肿瘤学剂和叶酸抑制剂中的至少一者。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述另外的剂是化学治疗剂。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述化学治疗剂是铂(顺铂/卡铂)。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述化学治疗剂是紫杉烷(紫杉醇
13.如权利要求9所述的方法，其中所述另外的剂是vegf抑制剂，任选地是贝伐单抗
14.如权利要求9所述的方法，其中所述另外的剂是parp抑制剂，任选地所述parp抑制剂是鲁卡帕尼
15.如权利要求9所述的方法，其中所述另外的剂是免疫检查点抑制剂，任选地其中所述另外的剂抑制ctla4、pd1和pdl1中的至少一者。
16.如权利要求9所述的方法，其中所述另外的剂是抑制叶酸代谢或靶向叶酸受体的叶酸抑制剂。
17.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中同时或依序施用所述抗cd47抗体和所述另外的剂。
18.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗cd47抗体包含igg4fc。
19.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗cd47抗体与hu5f9-g4竞争结合至cd47。
20.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗cd47结合至与hu5f9-g4相同的cd47表位。
21.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗cd47抗体是hu5f9-g4。
22.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体与药学上可接受的赋形剂一起配制在药物组合物中。
23.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述人受试者为铂敏感型。
24.如以上权利要求中除权利要求21外任一项所述的方法，其中所述人受试者为铂耐药型。
25.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述抗体。
26.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中腹腔内施用所述抗体。
27.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中肿瘤内施用所述抗体。
28.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中与基线相比，所述抗体的施用降低所述受试者中的ca125水平，任选地其中约每月一次测量所述ca125水平。
29.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中与基线相比，所述抗体的施用使所述受试者中的所述ca125水平降低至少30％-90％、40％-80％、50％-70％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
30.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中与基线相比，所述抗体的施用减小所述癌症或其转移的大小，任选地如通过成像所测量，任选地其中所述成像是ct/pet/ct或mri，任选地包括最初相比基线增加、但随后大小减小的疾病。
31.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中与基线相比，所述抗体的施用降低ca125、he4(人附睾蛋白4)、ca-72-4、ca-19-9和cea中的至少一者的水平。
32.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述卵巢癌是上皮性卵巢癌，任选地是浆液性肿瘤、粘液性肿瘤、透明细胞肿瘤、子宫内膜样肿瘤、移行细胞肿瘤、布伦纳瘤、癌肉瘤肿瘤、混合性上皮肿瘤、交界性上皮肿瘤、未分化癌肿瘤、输卵管肿瘤或原发性腹膜肿瘤。
33.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述卵巢癌是浆液性肿瘤。
34.如权利要求33所述的方法，其中如通过组织学分析所确定，所述浆液性肿瘤是低级别或高级别型。
35.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中通过组织学分析来确定所述肿瘤类型。
36.如以上权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括施用初免剂量的所述抗cd47抗体。
37.如以上权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括施用初免剂量的促红细胞生成素刺激剂。
38.如权利要求36所述的方法，其中以约0.5至约5mg/kg抗体范围内，任选地为1mg/kg抗体的初免剂量向所述受试者施用所述抗cd47抗体。
39.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中以约20至约67.5mg/kg抗体范围内，任选地为20mg/kg抗体、30mg/kg抗体、45mg/kg抗体、60mg/kg抗体或67.5mg/kg抗体的剂量向所述受试者施用所述抗cd47抗体。
40.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中每周、每2周或每3周向所述受试者施用所述抗cd47抗体。
41.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
a.向所述受试者施用初免剂量的所述抗cd47抗体，其中所述初免剂量是约0.5至约5mg/kg的抗体；以及
b.向所述受试者施用治疗有效剂量的所述抗cd47抗体，其中步骤(b)在开始步骤(a)后至少约3至14天之后、任选地在(a)之后7天进行。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述方法包括(a)在第1天以1mg/kg抗体的剂量向所述受试者施用所述初免剂量的抗cd47抗体；以及(b)在第8天以20mg/kg抗体、30mg/kg抗体、45mg/kg抗体、60mg/kg抗体或67.5mg/kg抗体的剂量向所述受试者施用所述治疗有效剂量的所述抗cd47抗体。
43.如权利要求36-42中任一项所述的方法，其中基于施用所述初免剂量后所述受试者的贫血状况确定所述初免剂量的有效性。
44.如权利要求36-42中任一项所述的方法，其中在以下情况下认为所述初免剂量有效：所述受试者的血红蛋白水平的下降不小于8.0g/dl；和/或所述受试者的血红蛋白水平的绝对下降小于3.0至3.75g/dl。
45.如权利要求41所述的方法，所述方法还包括在步骤(a)之后且在步骤(b)之前：确定所述初免剂量的施用是否有效的步骤。
46.如权利要求42所述的方法，其中所述确定步骤包括进行网织红细胞计数，其中如果所述网织红细胞计数为每l约100x109个网织红细胞至每l约–1000x109个网织红细胞，则确定所述初免剂量的施用已经有效。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述确定步骤包括进行网织红细胞计数，其中如果血液中的网织红细胞的百分比大于约1.5％，则确定所述初免剂量的施用已经有效。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述确定步骤包括进行网织红细胞计数，其中如果网织红细胞指数大于约2％，则确定所述初免剂的施用已经有效。
49.如权利要求41-48中任一项所述的方法，其中以具有约0.05mg/ml至约0.5mg/ml浓度的抗cd47抗体的输注液的形式向所述人受试者施用所述初免剂量。
50.如权利要求49所述的方法，其中在至少约1-3、8-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时的时间段内递送所述输注液。
51.如权利要求49所述的方法，其中在至少约3小时的时间段内递送所述输注液。
52.如权利要求49所述的方法，其中在约2.5小时至约6小时的时间段内递送所述输注液。
53.如权利要求41-48中任一项所述的方法，其中在约6小时至约3天的时间段内通过连续泵递送所述初免剂量。
54.如权利要求41-53中任一项所述的方法，其中皮下递送所述初免剂量。
55.如权利要求41-54中任一项所述的方法，其中所述初免剂量使红细胞上至少约50％至100％的cd47位点、任选地红细胞上100％的cd47位点饱和。
56.如权利要求55所述的方法，其中通过受体占用测定来确定所述剂量，其中在向所述受试者施用一定剂量的未标记的抗cd47剂后，获得血液样品并将所述血液样品与饱和剂量的可检测标记的抗cd47抗体合并；并且确定结合的水平。
57.如权利要求41-56中任一项所述的方法，其中(b)的所述治疗有效剂量足以实现大于100、250、500或1000μg/ml的所述抗cd47抗体的循环水平持续一段持续的时间段，任选地其中所述持续的时间段是至少1-28、7-28、7-21、14-28或21-28天。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述持续的时间段是约1、2、3或4周。
59.如权利要求41-58所述的方法，其中所述初免剂量是1mg/kg的抗体。
60.如权利要求41-58所述的方法，其中所述治疗有效剂量是20mg/kg的抗体。
61.如权利要求41-58所述的方法，其中所述治疗有效剂量是30mg/kg的抗体。
62.如权利要求41-58所述的方法，其中所述治疗有效剂量是45mg/kg的抗体。
63.如权利要求41-58所述的方法，其中所述治疗有效剂量是60mg/kg的抗体。
64.如权利要求41-58所述的方法，其中所述治疗有效剂量是67.5mg/kg的抗体。
65.如权利要求41-64中任一项所述的方法，其中约每7、14、21或28天施用所述治疗有效剂量。
66.如权利要求41-65中任一项所述的方法，其中每7天施用所述治疗有效剂量。
67.一种治疗患有非上皮性卵巢癌的人受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗cd47抗体，任选地其中所述非上皮性卵巢癌是恶性性索肿瘤或恶性生殖细胞肿瘤。
68.一种组合物，所述组合物包含抗cd47抗体和至少一种另外的剂，任选地其中所述另外的剂是化学治疗剂、vegf抑制剂、parp抑制剂、免疫检查点抑制剂、免疫肿瘤学剂或叶酸抑制剂。
69.一种药盒，所述药盒包括抗cd47抗体、至少一种另外的剂和使用说明书，任选地其中所述另外的剂是化学治疗剂、vegf抑制剂、parp抑制剂、免疫检查点抑制剂、免疫肿瘤学剂或叶酸抑制剂。
技术总结