本发明涉及一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶及其制备和应用方法，属于3d凝胶技术领域。
背景技术：
细胞的体外三维培养或者四维培养是组织工程和再生医学领域的重要技术手段。通过使用不同的生物材料及技术方法，构建出接近于体内生长环境并利用细胞群体内在的固有自组织属性，使细胞呈现出立体生长状态，并通过调节细胞外基质材料的内部结构或者物理化学属性，可以引导细胞的粘附、伸展及增殖和分化能力及特性的改变。构建性质优良且调控灵活的细胞三维外基质是3d或4d培养的其中一项关键点，而目前采用较多的材料是各类天然或者合成的水凝胶，但通常的水凝胶中的各成分都是匀质的且水凝胶的刚度和粘附位点的分布是均匀的。当水凝胶内粘附位点的分布非均匀时，细胞各伪足黏附点能承受的应力值不同，这会影响细胞在黏附点选择、以及伸展时的形态特征。另一方面，当水凝胶内的局部刚度值不同时，有利于改变凝胶整体的材料学属性，如果能在显著小于细胞的尺度上形成非均匀的交联分子分布状态，则可影响细胞的粘附、伸展、迁移甚至分化规律。因而，如果能够灵活调控水凝胶的内在结构，使其交联分子和粘附分子的分布都可定量调控，则会进一步提升控制细胞在三维凝胶内生长和自组织的途径。
技术实现要素：
目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶及其制备和应用方法。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤s1.将凝胶主干大分子溶液与粘附肽链混合，孵育得到接枝肽链的凝胶主干大分子溶液，将接枝肽链的凝胶主干大分子溶液分成n部分，得到n份第一产物，分别为第一产物a1、第一产物a2、…、第一产物an，对应的各第一产物的体积为va1、va2、…、van；n为大于或等于2的正整数；
步骤s2.分别在步骤s1的n份第一产物中加入不同物质的量的硫代甘油分子溶液，得到n份第二产物，分别是第二产物b1、第二产物b2、…、第二产物bn，对应的各第二产物的体积为vb1、vb2、…、vbn；
步骤s3.将步骤s2得到的n份第二产物在室温下孵育5-10分钟，然后再混合在一起，得到混合物三；
步骤s4.将细胞悬液加入混合物三中，搅拌均匀，得到包含细胞的前体溶液；
步骤s5.在容器内底面添加交联分子溶液，然后将步骤s4中包含细胞的前体溶液加入容器与交联分子溶液混合，即得到交联密度非均匀且粘附肽链非均匀的凝胶。
进一步地，所述步骤s1中的粘附肽链在最终形成的凝胶内的浓度为5μm-600μm之间，且n的值大于或者等于2。
进一步地，所述步骤s1中凝胶主干大分子溶液的制备步骤如下：
步骤s11.取出于-80℃温度条件冷冻的无菌蒸馏水和缓冲液，在室温下融解为液态，得到液态蒸馏水和液态缓冲液；
步骤s12.取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的马来酰亚胺-葡萄糖聚合物并加入蒸馏水进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到马来酰亚胺-葡萄糖聚合物溶液；
步骤s13.将所述步骤s11中的得到的无菌液态蒸馏水和液态缓冲液与所述步骤s12得到的马来酰亚胺-葡萄糖聚合物溶液于离心管中混匀，得到凝胶主干大分子溶液。
进一步地，所述缓冲液中含有hepes缓冲液和磷酸盐缓冲液；所述缓冲液的ph值在5到7.5之间。
进一步地，所述步骤s2的具体过程如下：
步骤s21.取出于-80℃温度条件冷冻的硫代甘油加蒸馏水进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到位点封闭分子溶液；
步骤s22.在所述步骤s1中的n份第一产物中分别添加步骤s21中得到的硫代甘油分子溶液，吹打混匀后，室温静置时间t0，得到n份第二产物。
进一步地，所述时间t0为4-15min。
进一步地，所述步骤s2中得到的n份第二产物的空置交联位点各不相同。
进一步地，当步骤s1中各第一产物的体积va1、va2、…、van全部相等时，步骤s2中的各第二产物的的体积vb1、vb2、…、vbn中至少存在两个彼此互不相等的值。
一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶，利用上述制备方法制得。
一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶的应用方法，其特征在于：包括如下过程：
在培养板上采用新鲜培养基覆盖所述3d凝胶，然后将培养板移至培养箱用于组织培养；培养过程中每2天更换一次培养基。
有益效果：本发明提供的一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶，所述非匀质为纳米尺度内的某成分或某几种成分分子的非均匀分布，本发明凝胶的制备方法操作简单易行，通过将多份具有不同成分含量的产物根据设计值进行定量混合，能够在纳米尺度同时实现粘附分子和交联分子的成簇聚集，进而实现凝胶材料微观上的非均匀态。该工艺和制备方法适于模块化的自动化生产方式，避免了复杂非匀质凝胶的定量成型工艺。所制备凝胶材料中各成分的微观非均匀程度均可定量控制，其对定量研究特定组分在不同微观非均匀度下的细胞响应特点，调控细胞与材料之间的相互作用，以及促进细胞伸展迁移等方面可起到积极作用。
附图说明
图1为本发明的制备方法流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
实施例
在ph值为5.5下制备三维可降解的微观成簇交联型的马来酰亚胺的葡聚糖水凝胶。制备流程如图1所示。
s1.将从-80℃冷冻状态融解获得的马来酰亚胺-葡聚糖f1（质量分数0.8-1.1%，4µl）、无菌蒸馏水（4µl）、10倍浓缩缓冲液（2.5µl）和arg-gly-asp(rgd)肽f2(0.1µl)按上述体积量加入反应管中，充分混合，室温下孵育5-10分钟，得到已接枝rgd的马来酰亚胺-葡聚糖的前体溶液a。所述rgd肽在最终形成的凝胶里的浓度是10μm。将前体溶液等体积分为两部分，形成第一产物a1和第一产物a2。
s2.分别在第一产物a1和第一产物a2中加入不同体积的硫代甘油分子溶液，吹打混匀后，室温静置10min；在第一产物a1中加入较多的硫代甘油分子d，使得马来酰亚胺-葡聚糖后续交联率相对降低，在第一产物a2中加入较少的硫代甘油分子d（这里d的物质的量可以为0），使得马来酰亚胺-葡聚糖后续交联率相对提高。因为含硫醇的硫代甘油能占据马来酰亚胺-葡聚糖的交联位点，所以加入不同物质的量的硫代甘油，则会留下不同量的空置交联位点，即得到空置交联位点较少的第二产物b1和空置交联位点较多的第二产物b2。
s3.第二产物b1和第二产物b2分别在室温下孵育5-10分钟，然后混合在一起，得到混合物三。
s4.将细胞悬液（占凝胶最终总体积的15%-40%）加入混合物三c中，搅拌均匀。
s5.在96孔板的孔内底面添加交联分子溶液，所述交联分子溶液为细胞可降解交联剂溶液，然后将含有细胞e1的混合物三c与交联分子e2在96孔板中混合，室温下3-5分钟内即可完全形成交联密度非均匀的凝胶g。所得凝胶分子在不同的微观区域内存在不同的交联分子密度，如图1中，g1部分交联分子密度较低，g2部分交联分子密度较高。
本实施例所制备的凝胶的应用过程如下：
在培养板上采用120-150µl新鲜培养基覆盖凝胶样品，然后将培养板移至培养箱。培养过程中每2天更换一次培养基。凝胶样品的体积维持在30μl。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤s1.将凝胶主干大分子溶液与粘附肽链混合，孵育得到接枝肽链的凝胶主干大分子溶液，将接枝肽链的凝胶主干大分子溶液分成n部分，得到n份第一产物，分别为第一产物11、第一产物12、…、第一产物1n，对应的各第一产物的体积为v11、v12、…、v1n；n为大于或等于2的正整数；
步骤s2.分别在步骤s1的n份第一产物中加入不同物质的量的硫代甘油分子溶液，得到n份第二产物，分别是第二产物21、第二产物22、…、第二产物2n，对应的各第二产物的体积为v21、v22、…、v2n；
步骤s3.将步骤s2得到的n份第二产物在室温下孵育5-10分钟，然后再混合在一起，得到混合物三；
步骤s4.将细胞悬液加入混合物三中，搅拌均匀，得到包含细胞的前体溶液；
步骤s5.在容器内底面添加交联分子溶液，然后将步骤s4中包含细胞的前体溶液加入容器与交联分子溶液混合，即得到交联密度非均匀且粘附肽链非均匀的凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中的粘附肽链在最终凝胶内的浓度在5μm-600μm之间。
3.根据权利要求1所述的一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中凝胶主干大分子溶液的制备步骤如下：
步骤s11.取出于-80℃温度条件冷冻的无菌蒸馏水和缓冲液，在室温下融解为液态，得到液态蒸馏水和液态缓冲液；
步骤s12.取出于-80℃温度条件冷冻而呈固态的马来酰亚胺-葡萄糖聚合物并加入蒸馏水进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到马来酰亚胺-葡萄糖聚合物溶液；
步骤s13.将所述步骤s11中的得到的液态无菌蒸馏水和液态缓冲液与所述步骤s12得到的马来酰亚胺-葡萄糖聚合物溶液于离心管中混匀，得到凝胶主干大分子溶液。
4.根据权利要求3所述的一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶的制备方法，其特征在于：所述缓冲液中含有hepes缓冲液和磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s2的具体过程如下：
步骤s21.取出于-80℃温度条件冷冻的硫代甘油加蒸馏水进行溶解，溶解时通过漩涡振荡器进行振荡，得到位点封闭分子溶液；
步骤s22.在所述步骤s1中的n份第一产物中分别添加步骤s21中得到的硫代甘油分子溶液，吹打混匀后，室温静置时间t0，得到n份第二产物。
6.根据权利要求5所述的一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶的制备方法，其特征在于：所述时间t0为4-15min。
7.根据权利要求1所述的一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s2中得到的n份第二产物的空置交联位点数目各不相同。
8.根据权利要求1所述的一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶的制备方法，其特征在于：当步骤s1中各第一产物的体积va1、va2、…、van全部相等时，步骤s2中的各第二产物的的体积vb1、vb2、…、vbn中至少存在两个彼此互不相等的值。
9.一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶，其特征在于：利用权利要求1-8任一项所述制备方法制得。
10.基于权利要求9所述的一种局部交联密度可调控非匀质3d凝胶的应用方法，其特征在于：包括如下过程：
在培养板上采用新鲜培养基覆盖所述3d凝胶，然后将培养板移至培养箱用于组织培养；培养过程中每2天更换一次培养基。
技术总结