本申请涉及一种植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)菌株，其具有产生呈现高稠度和/或高粘性和/或高口中稠度的发酵奶的能力。本申请还涉及一种植物乳杆菌菌株，其具有产生呈现高稠度和/或高粘性和/或高口中稠度的发酵奶的能力，进一步在发酵温度下是低后酸化菌株。本申请还涉及一种制造发酵产品，具体为发酵乳产品的方法，所述方法使用本发明的植物乳杆菌菌株，或使用包含本发明的植物乳杆菌菌株的细菌组合物、组合物或套装盒(kit-ofpart)。
背景技术：
用于发酵奶的传统的起子培养物主要针对西方国家(欧洲、北美)而开发。发酵途径典型地通过两种不同的细菌进行：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus，st)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbruekiisubsp.bulgaricus.)。
质地是用于发酵奶的非常重要的质量参数，并且消费者不断要求发酵奶产品具有新口味和/或新质地。在用于发酵产品的重要的质地描述语中，高口感、长质地和顺滑度深受众多消费者的喜爱。因此，需要改善发酵奶的流变特性。
通过使用增稠剂(如藻酸盐)可以获得发酵奶的流变特性的改善。然而，存在如下趋势，即消费者认为含有最少添加成分的更天然的产品(无添加剂的酸奶)是健康的。
wo2011/000879和wo2011/000883申请描述了分别包含嗜热链球菌和发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)菌株，以及嗜热链球菌和约氏乳杆菌(lactobacillusjohnsonii)菌株的培养物，及其在制造低脂发酵奶产品中的用途。根据这些申请，通过发酵乳杆菌或约氏乳杆菌与一种或多种嗜热链球菌菌株组合来替代常规使用的德氏乳杆菌保加利亚亚种将导致具有改善的流变特性(更高的黏度)和更低的后酸化的低脂发酵奶产品。
仍然需要新的方法来制造具有不同质地，具体为高口腔稠度和汤匙稠度以及高粘度的发酵产品，同时在限制发酵产品中添加剂存在。
技术实现要素：
本发明的第一方面涉及一种植物乳杆菌菌株，其当接种到奶中时，产生呈现高稠度和/或高粘性和/或高口中稠度，具体为呈现如通过测试a测定的以下流变特征中的一种、两种或三种的发酵奶：a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa；b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa；c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12。
本发明的第二方面涉及一种植物乳杆菌菌株，其当接种到奶中时，产生呈现高稠度和/或高粘性和/或高口中稠度的发酵奶，并且其进一步特征在于在发酵温度下是低后酸化菌株。
本发明的第三方面涉及一种细菌组合物，其包含本发明的植物乳杆菌菌株，具体为与至少另一种乳酸菌组合的植物乳杆菌菌株，或由其组成。
本发明的第四方面涉及一种组合物，其包含本发明的植物乳杆菌菌株或本发明的细菌组合物以及增强剂，或由其组成。
本发明的第五方面涉及一种套装盒，其包含本发明的植物乳杆菌菌株或本发明的细菌组合物以及增强剂，或由其组成。
本发明的第六方面涉及一种用于制造发酵产品的方法，所述方法包括用本发明的植物乳杆菌菌株、本发明的细菌组合物、本发明的组合物或本发明的套装盒接种基质，并且发酵所述接种的基质，以获得发酵产品。
本发明的第七方面涉及一种发酵产品，其包含本发明的植物乳杆菌菌株或者通过本发明的方法获得或是可获得的。
本发明的第八方面涉及本发明的植物乳杆菌菌株、本发明的细菌组合物、本发明的组合物或本发明的套装盒在制造发酵乳产品中的用途。
附图说明
图1表示在琼脂板上进行的对植物乳杆菌菌株粘性测定的照片。(a)无可检测的粘性；(b)低粘性；(c)中粘性；(d)高粘性。
图2显示使用4种不同的植物乳杆菌菌株获得的发酵奶的流动曲线。
图3是使用4种不同的植物乳杆菌菌株获得的发酵奶的感官特性的示意图。
图4表示显示使用4种不同的植物乳杆菌菌株获得的发酵奶的外观的照片。
图5显示与使用传统的起子培养物获得的发酵奶的流动曲线相比，使用本发明的植物乳杆菌菌株获得的发酵奶的流动曲线。
图6表示显示与使用传统的起子培养物获得的发酵奶相比，使用本发明的植物乳杆菌菌株获得的发酵奶的长质地描述语的照片。
图7显示用两种不同的本发明的植物乳杆菌菌株发酵的奶的酸化曲线(ph随时间的变化)。
图8显示测试a中用于发酵的容器和用于流变学测量的搅拌桨。
具体实施方式
出乎意料地，发明人已经鉴定出可用于获得具有独特质地和流变特性的发酵奶的乳酸菌。这种乳酸菌是植物乳杆菌菌株，并且可以用于提供具有高稠度和/或高粘性和/或高口中稠度的发酵奶。
本发明涉及一种植物乳杆菌菌株，其当接种到奶中时，产生呈现如通过测试a测定的以下流变特征中的一种、两种或三种的发酵奶：
a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa；
b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa；
c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12。
为了避免疑问，如文献中所述，具体为在skermanvbd，mcgowanv和sneathph；int.j.syst.bacteriol[国际系统细菌学杂志]，30(1980)，225-420中，本文定义了植物乳杆菌菌株。
本文所述的流变参数已使用以下测试a(也在实例2中描述)进行了测定。如本文所定义的在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力值和如本文所定义的在剪切速率200s-1下测得的剪切应力值——如通过测试a计算——在相同实验内重复之间的标准偏差为±1pa。如本文所定义的在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值——如通过测试a计算——在相同实验内重复之间的标准偏差为±1。
因此，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生发酵奶的能力，所述发酵奶呈现如本文所定义的在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力和/或如本文所定义的在剪切速率200s-1下测得的剪切应力和/或如本文所定义的在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值，这些是在以下条件下测得的：
测试a
将添加有6％蔗糖和来自oxoidtm的0.1％酵母提取物粉(lp0021)的2luht奶(3.2％蛋白质，3.5％脂肪)在85℃下热处理15min并冷却至室温。将待测的每种菌株的培养物以1.107cfu/ml接种到奶中。然后将接种的奶在30℃下发酵至达到ph4.5(典型地约22h至24h)。发酵后，将样品通过旋转器(rzr2051控制器，海道尔夫公司(heidolph))以100rpm搅拌1.5min并在4℃下储存过夜，然后通过流变仪进行测量。使用的罐和囊是如图8所公开的。使用同轴圆筒c-cc27-t200/ss和bob杯(安东帕公司(antonpaar)mcr302，cc27-sn27450，奥地利)，通过流变仪来评估所述样品。在测量期间，将流变仪设置为10℃的恒定温度。设置如下：
-保持时间(某种程度上重建原始结构)：10分钟，没有任何物理应力应用于所述样品。
-500s内的25个测量点(每20s一个)
-旋转步骤(测量在11.6l/s下的剪切应力，在200l/s下的剪切应力，以及在146l/s下的剪切应力减去在41.1l/s下的剪切应力的差值)
设计两个步骤：
剪切速率：d(γ)/dt＝[0.1-200]l/slog和[200-0.1]l/slog
每个步骤包含500s内的25个测量点(每20s一个)
在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力表示所述发酵奶的稠度。根据本发明，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa(如通过本文描述的测试a测定的)的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于32pa的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于35pa的发酵奶的能力。在一个实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力为30pa至45pa的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力为32pa至40pa的发酵奶的能力。将如本文描述的在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力的值或范围单独公开或者与本文描述的在剪切速率200s-1下测得的剪切应力的任何值或范围和/或本文描述的在146s-1下测得的剪切应力-在41.1s-1下测得的剪切应力的δ的任何值或范围组合公开。这些值和范围通过本文描述的测试a进行测定。
在剪切速率200s-1下测得的剪切应力表示所述发酵奶的涂层或口腔稠度(也称作口中稠度)。根据本发明，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa(如通过本文描述的测试a测定的)的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于65pa的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于70pa的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于75pa的发酵奶的能力。在一个实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现在剪切速率200s-1下测得的剪切应力为60pa至85pa的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现在剪切速率200s-1下测得的剪切应力为65pa至85pa的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现在剪切速率200s-1下测得的剪切应力为70pa至82pa的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现在剪切速率200s-1下测得的剪切应力为75pa至80pa的发酵奶的能力。将本文描述的在剪切速率200s-1下测得的剪切应力的值或范围单独公开或者与本文描述的在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力的任何值或范围和/或本文描述的在146s-1下测得的剪切应力-在41.1s-1下测得的剪切应力的δ的任何值或范围组合公开。这些值和范围通过本文描述的测试a进行测定。
在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值(δ剪切应力146s-1-41.1s-1)表示发酵奶的粘性或粘度。根据本发明，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现δ剪切应力146s-1-41.1s-1高于12的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现δ剪切应力146s-1-41.1s-1高于13的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现δ剪切应力146s-1-41.1s-1高于14的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现δ剪切应力146s-1-41.1s-1高于15的发酵奶的能力。在一个实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现δ剪切应力146s-1-41.1s-1为12至18的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现δ剪切应力146s-1-41.1s-1为13至17的发酵奶的能力。在一个具体实施例中，所述要求保护的植物乳杆菌菌株具有产生呈现δ剪切应力146s-1-41.1s-1为14至16的发酵奶的能力。将本文描述的δ剪切应力146s-1-41.1s-1的值或范围单独公开或与如本文描述的在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力的任何值或范围和/或本文描述的在剪切速率200s-1下测得的剪切应力的任何值或范围组合公开。这些值和范围通过本文描述的测试a进行测定。
表述“[以下]流变特征中的一种、两种或三种”(在所述植物乳杆菌菌株、方法、发酵产品或用途的上下文中)意指如下：
-选自下组的一种流变特征，该组由以下组成：a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa，b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa，以及c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12，或者
-选自以下组合的两种流变特征：1)a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa，和b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa，2)a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa，和c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12，或3)b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa，和c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12；或者
-三种流变特征，即，a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa，b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa，和c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12的组合。
因此，在一个实施例中，本发明涉及一种植物乳杆菌菌株，其当接种到奶中时，产生呈现a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa，具体为高于32pa，具体为高于35pa，或为30pa至45pa，具体为32pa至40pa的发酵奶。
在一个实施例中，本发明涉及一种植物乳杆菌菌株，其当接种到奶中时，产生呈现b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa，具体为高于65pa，具体为高于70pa，具体为高于75pa，或为60pa至85pa，具体为65pa至85pa，具体为70pa至82pa，具体为75pa至80pa的发酵奶。
在一个实施例中，本发明涉及一种植物乳杆菌菌株，其当接种到奶中时，产生呈现c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12，具体为高于13，具体为高于14，具体为高于15，或为12至19，具体为13至18，具体为14至17的发酵奶。
在一个实施例中，本发明涉及一种植物乳杆菌菌株，其当接种到奶中时产生发酵奶，所述发酵奶呈现a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa，具体为高于32pa，具体为高于35pa，或为30pa至45pa，具体为32pa至40pa；和b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa，具体为高于65pa，具体为高于70pa，具体为高于75pa，或为60pa至85pa，具体为65pa至85pa，具体为70pa至82pa，具体为75pa至80pa。在一个具体实施例中，所述植物乳杆菌菌株当接种到奶中时，产生呈现a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于32pa，和b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于70pa的发酵奶。在另一个具体实施例中，所述植物乳杆菌菌株当接种到奶中时，产生呈现a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力为32pa至40pa，和b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力为70pa至82pa的发酵奶。
在一个实施例中，本发明涉及一种植物乳杆菌菌株，其当接种到奶中时产生发酵奶，所述发酵奶呈现a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa，具体为高于32pa，具体为高于35pa，或为30pa至45pa，具体为32pa至40pa；和c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12，具体为高于13，具体为高于14，具体为高于15，或为12至19，具体为13至18，具体为14至17。在一个具体实施例中，所述植物乳杆菌菌株当接种到奶中时，产生呈现a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于32pa；和c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于14的发酵奶。在另一个具体实施例中，所述植物乳杆菌菌株当接种到奶中时，产生呈现a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力为32pa至40pa；和c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值为14至17的发酵奶。
在一个实施例中，本发明涉及一种植物乳杆菌菌株，其当接种到奶中时，产生呈现b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa，具体为高于65pa，具体为高于70pa，具体为高于75pa或为60pa至85pa，具体为65pa至85pa，具体为70pa至82pa，具体为75pa至80pa；和c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12，具体为高于13，具体为高于14，具体为高于15，或为12至19，具体为13至18，具体为14至17的发酵奶。在一个具体实施例中，所述植物乳杆菌菌株当接种到奶中时，产生呈现b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于70pa；和c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于14的发酵奶。在另一个具体实施例中，所述植物乳杆菌菌株当接种到奶中时，产生呈现b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力为70pa至82pa；和c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值为14至17的发酵奶。
在一个实施例中，本发明涉及一种植物乳杆菌菌株，其当接种到奶中时，产生呈现a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa，具体为高于32pa，具体为高于35pa，或为30pa至45pa，具体为32pa至40pa；b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa，具体为高于65pa，具体为高于70pa，具体为高于75pa，或为60pa至85pa，具体为65pa至85pa，具体为70pa至82pa，具体为75pa至80pa；以及c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12，具体为高于13，具体为高于14，具体为高于15，或为12至19，具体为13至18，具体为14至17的发酵奶。在一个具体实施例中，所述植物乳杆菌菌株当接种到奶中时，产生呈现a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于32pa；b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于70pa；以及c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于14的发酵奶。在另一个具体实施例中，所述植物乳杆菌菌株当接种到奶中时，产生呈现a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力为32pa至40pa；b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力为70pa至82pa；以及c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值为14至17的发酵奶。
满足本文所定义的流变特征中的一种、两种或三种的任何植物乳杆菌菌株是本发明的一部分。本发明已用保藏在dsmz的dsm32493菌株进行了举例说明。没有理由怀疑的是，存在与dsm32493菌株共享本文所定义的流变特性的一种、两种或三种的其他植物乳杆菌菌株，其中有可能使用dsm32493菌株作为阳性对照。
在一个具体实施例中，本发明涉及于2017年4月26日保藏在dsmz的植物乳杆菌菌株dsm32493。
在一个具体实施例中，本发明还涉及dsm32493的变体。“dsm32493菌株的变体”意指一种源自dsm32493菌株的植物乳杆菌菌株，并且其产生呈现本文描述的流变特征(如通过测试a测定的)的一种、两种或三种的发酵奶，即，以下流变特征中的一种、两种或三种：a)如本文所定义的在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力和/或b)如本文所定义的在剪切速率200s-1下测得的剪切应力和/或c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值。在一个具体实施例中，如本文所定义的dsm32493菌株变体能够产生呈现(如通过测试a测定的)a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力(稠度)高于30pa；b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力(涂层/口腔稠度)高于60pa；以及c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值(粘性/粘度)高于12的发酵奶。在一个具体实施例中，如本文所定义的dsm32493菌株变体能够产生呈现(如通过测试a测定的)a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力(稠度)高于32pa；b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力(涂层/口腔稠度)高于70pa；以及c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值(粘性/粘度)高于14的发酵奶。在一个具体实施例中，关于产生呈现三种流变特征(如通过测试a测定的)：a)如本文所定义的在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力，b)如本文所定义的在剪切速率200s-1下测得的剪切应力，以及c)如本文所定义的在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值的发酵奶，所述dsm32493菌株变体保持dsm32493菌株的特性。“保持特性”意指使用dsm32493变体获得的流变特征的值至少是使用dsm32493菌株获得的值。用于详细说明在植物乳杆菌菌株表征下的流变特征的定义和具体实施例类似地适用于dsm32493菌株的任何变体的上下文中，具体说明了但不限于如下：在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力的最小值和范围，在剪切速率200s-1下测得的剪切应力的最小值和范围，在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的最小值和范围，以及任何单独的流变特征或这些流变特征的组合。
dsm32493的变体在本文定义为与dsm32493菌株相比，呈现至少一个突变(如在其基因组中至少一个核苷酸的添加、缺失、插入和/或取代)的植物乳杆菌菌株。在一个具体实施例中，所述变体的基因组序列具有相对于所述dsm32493菌株的基因组序列，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、至少99.92％、至少99.94％、至少99.96％、至少99.98％、或至少99.99％的同一性。这种变体可以是例如：
-在选择培养基中孵育后从dsm32493菌株自发获得的天然变体。因此，天然变体是在没有任何遗传操作，而仅仅通过在适当的培养基中所述菌株的自发突变以及菌株的选择获得的；用于选择dsm32493菌株的具体突变体的方案的实例公开于实例5中；或者
-其基因组中包含至少一个突变的变体，所述突变是通过基因工程诱导的，例如通过定向诱变或随机诱变。可以用uv辐射或诱变化合物(如亚硝酸、甲磺酸乙酯、n甲基-n’-硝基-n-亚硝基胍、n-乙基-n-亚硝基脲、吖啶橙、原黄素)进行随机诱变。
本发明还涉及一种如本文所定义的植物乳杆菌(包括dsm32493菌株的变体)，其除了提供呈现以下流变特征(如通过测试a测定的)的一种、两种或三种的发酵奶，a)如本文所定义的在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa；b)如本文所定义的在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa；c)如本文所定义的在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12，进一步特征在于在发酵温度下是低后酸化菌株。
“在发酵温度下是低后酸化菌株”意指本发明的植物乳杆菌菌株当接种到奶中时产生发酵奶，当所述发酵奶保持在发酵温度下时，其在发酵后的ph波动不超过0.3个单位，具体为如通过测试b测定的(见下文)。酸化动力学是通过连续记录ph作为时间的函数来确定的，例如使用cinac系统(cinac，anautomatedsystemforcontroloflacticstarters[一种用于控制乳酸起子的自动化系统]；corrieug，picqued，perretb，quemenerp；processmagazine[工艺期刊]；1992∶1068；p.24-27)。
用本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株接种的并在发酵温度下的奶的酸化动力学遵照两相曲线，所述曲线包含s形ph下降至ph值为4.0和5.0之间的初始时间段(以产生发酵奶)，随后是第二时间段，其中ph值波动不超过0.3个单位(当发酵奶保持在发酵温度下时)。为表征本发明的植物乳杆菌菌株的低后酸化特征，一旦发酵步骤终止(初始时间段结束时)就测量ph，将所述发酵奶保持在发酵温度下，至少48小时后测量ph，并测量ph的演变(差异)。在一个具体实施例中，发酵温度是37℃。
在一个实施例中，在初始时间段结束时获得的ph包含在4.0和5.0之间。在一个具体实施例中，在初始时间段结束时获得的ph包含在4.2和4.8之间。在一个具体实施例中，在初始时间段结束时获得的ph包含在4.3和4.7之间。在一个具体实施例中，在初始时间段结束时获得的ph包含在4.4和4.6之间。
在一个具体实施例中，本发明的低后酸化菌株能够产生发酵奶，当所述发酵奶在初始时间段结束后保持在发酵温度下持续48小时时，其ph波动不超过0.3个单位，具体为不超过0.2个单位，具体为不超过0.1个单位。
在一个具体实施例中，通过测定下面描述的测试b进行低后酸化特征表征(也参见实例5)：
测试b
将添加有6％蔗糖和来自oxoidtm的0.1％酵母提取物粉(lp0021)的uht奶(3.2％蛋白质，3.5％脂肪)在85℃下热处理15min并冷却至室温。将待测的每种菌株的培养物以1.107cfu/ml接种到奶中，并将接种的奶放置在37℃(t＝0)下。将接种的奶发酵直至ph达到4.5(tph4.5)并保持在37℃下至少48小时，并且持续监测所述奶的ph。使用δph(δph＝在(tph4.5 48h)下的ph-ph4.5)表示在发酵温度下的后酸化。
在一个具体实施例中，本发明的低后酸化菌株是在其atp合酶操纵子中具有至少一个突变(例如点突变、缺失、插入，......)的植物乳杆菌菌株，使得所述菌株具有降低的h -atp酶活性。atp合酶操纵子的野生型序列是如在seqidno：1中所示的。本领域技术人员知道如何确定该操纵子是否发生突变，以及如何测量细菌的h -atp酶活性[参见例如，jaichumjai等人，2010；foodmicrobiology[食品微生物学]27(2010)741-748]。在一个具体实施例中，如本文所定义的本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株在atp合酶操纵子的atp合酶α亚基基因(在本文中被称为“atp合酶α亚基基因”)中具有至少一个突变。在一个具体实施例中，如本文所定义的本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株在如seqidno：2中所定义的atp合酶操纵子的atp合酶α亚基基因中具有至少一个突变。在一个具体实施例中，结合或者不结合前面关于seqidno：2的实施例，如本文所定义的本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株的atp合酶α亚基基因编码在位置169处具有天冬氨酸残基的atp合酶α亚基蛋白。在一个具体实施例中，如本文所定义的本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株的atp合酶α亚基蛋白是如在seqidno：5中所定义的。在一个具体实施例中，结合或者不结合前面关于seqidno：2的实施例，如本文所定义的本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株的atp合酶α亚基基因携带在其位置506处g到a的突变(用天冬氨酸残基改变在位置169处的甘氨酸残基)。在一个具体实施例中，如本文所定义的本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株的atp合酶α亚基基因是如在seqidno：4中所定义的(其中在位置505至507处的密码子ggt变为gat)。
在一个实施例中，本发明涉及如本文所定义的低后酸化变体，所述变体是于2017年4月26日保藏在dsmz的植物乳杆菌菌株dsm32493的变体。在一个具体实施例中，本发明涉及植物乳杆菌菌株dsm32493的低后酸化变体，其中所述变体携带在atp合酶α亚基基因中的突变(与dsm32493菌株相比)，具体为携带在位置506处g到a的突变。
用于详细说明在植物乳杆菌菌株表征(包括dsm32493菌株的变体)下的流变特征的定义和具体实施例类似地适用于低后酸化变体的上下文中，具体说明了但不限于如下：在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力的最小值和范围，在剪切速率200s-1下测得的剪切应力的最小值和范围，在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的最小值和范围，以及任何单独的流变特征或这些流变特征的组合。
本发明还涉及一种细菌组合物，其包含本发明的植物乳杆菌菌株(具体为本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株)，或由其组成。在一个具体实施例中，所述细菌组合物是纯培养物，即包含单个细菌菌株或由其组成。在另一个实施例中，所述细菌组合物是混合培养物，即包含本发明的植物乳杆菌菌株和至少一种其他细菌菌株，或由其组成。因此，在一个实施例中，本发明的细菌组合物包含本发明的植物乳杆菌菌株和至少一种乳酸菌，具体为至少另一种植物乳杆菌菌株和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，或由其组成。“至少”(涉及细菌菌株、乳酸菌或另一种植物乳杆菌菌株)意指1种或多种，具体为1种、2种、3种、4种或5种菌株。因此，在一个实施例中，本发明的组合物还包含(除本发明的植物乳杆菌菌株之外)1种、2种、3种、4种或5种菌株，具体为1种、2种、3种、4种或5种乳酸菌菌株，或由其组成。在一个具体实施例中，本发明的细菌组合物不包含一种或多种嗜热链球菌菌株。
在一个具体实施例中，如本文所定义的细菌组合物(无论是作为如上所定义的纯培养物或混合培养物)在冷冻、干燥、冷冻干燥、液体或固体形式下，处于球粒或冷冻球粒的形式，或以粉末或干粉形式。在一个具体实施例中，本发明的细菌组合物是以冷冻形式或处于球粒或冷冻球粒的形式，具体是包含在一个或多个盒或小袋中。在另一个实施例中，如本文所定义的细菌组合物是在粉末形式下，如干燥或冷冻干燥的粉末，具体是包含在一个或多个盒或小袋中。
在一个具体实施例中，本发明的细菌组合物(无论是作为如上所定义的纯培养物或混合培养物，并且无论以何种形式(冷冻、干燥、冷冻干燥、液体或固体形式，处于球粒或冷冻球粒的形式，或以粉末或干粉形式))包含本发明的植物乳杆菌菌株，其浓度包含在105至1012cfu(菌落形成单位)/克细菌组合物内。在一个具体实施例中，在本发明的细菌组合物内的植物乳杆菌的浓度为107至1012cfu/克细菌组合物，并且具体为至少107、至少108、至少109、至少1010或至少1011cfu/g细菌组合物。在一个具体实施例中，当处于冷冻或干燥浓缩物的形式时，在细菌组合物内的植物乳杆菌菌株(作为纯培养物或作为混合培养物)的浓度为108至1012cfu/g冷冻浓缩物或干燥浓缩物，并且更优选至少108、至少109、至少1010、至少1011或至少1012cfu/g冷冻浓缩物或干燥浓缩物。
本发明还涉及一种组合物或一种套装盒，其包含本发明的植物乳杆菌菌株(具体为本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株)或如本文所定义的细菌组合物(如纯培养物或混合培养物)以及增强剂，或由其组成。在一个具体实施例中，所述增强剂是酵母提取物或含有氨基酸的组合物。在一个具体实施例中，所述增强剂是酵母提取物，如酵母提取物粉。可以使用任何酵母提取物(或粉)，例如但不限于来自oxoidtm的酵母提取物粉lp0021。
表述“一种组合物，其包含本发明的植物乳杆菌菌株或本发明的细菌组合物以及增强剂，或由其组成”意指所述植物乳杆菌或所述细菌组合物以及所述增强剂在物理上混合在一起。在组合物内的增强剂的量是这样的以致于将所述增强剂以0.001％至2％接种到奶中。在一个实施例中，所述组合物是在冷冻形式下或处于冷冻球粒的形式。在另一个实施例中，所述组合物是在干燥或冷冻干燥形式下或者处于粉末或干粉形式。相反，表述“一种套装盒，其包含本发明的植物乳杆菌菌株或本发明的细菌组合物以及增强剂，或由其组成”意指所述植物乳杆菌或所述细菌组合物以及所述增强剂在物理上分开但旨在一起使用。因此，所述植物乳杆菌或所述细菌组合物以及所述增强剂是在不同的盒或小袋中。在一个实施例中，所述植物乳杆菌或所述细菌组合物以及所述增强剂都是在冷冻形式下或处于冷冻球粒的形式。在另一个实施例中，所述植物乳杆菌或所述细菌组合物以及所述增强剂都是在干燥或冷冻干燥形式下或者处于粉末或干粉形式。
本发明还涉及一种用于制造发酵产品的方法，所述方法包括a)用本发明的植物乳杆菌菌株(具体为本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株)接种基质，和b)发酵所述接种的基质，以获得发酵产品。在一个具体实施例中，将本发明的植物乳杆菌菌株作为如本文所定义的细菌组合物(如纯培养物或混合培养物)接种。在一个实施例中，将本发明的植物乳杆菌菌株作为如本文所定义的组合物接种，即步骤a)包括接种如本文所定义的细菌组合物或由其组成。在另一个实施例中，将本发明的植物乳杆菌菌株作为如本文所定义的套装盒接种，即步骤a)包括a1)接种所述植物乳杆菌菌株(或所述细菌组合物)和a2)接种所述增强剂，或由其组成，其中所述植物乳杆菌菌株(或所述细菌组合物)和所述增强剂同时接种，或其中所述植物乳杆菌菌株(或所述细菌组合物)在所述增强剂之前接种，或其中所述增强剂在所述植物乳杆菌菌株(或所述细菌组合物)之前接种。在一个具体实施例中，本发明的方法不包括接种一种或多种嗜热链球菌菌株。在一个具体和优选的实施例中，在步骤a)中用本发明的植物乳杆菌菌株的纯培养物接种基质。
当使用增强剂时，将所述增强剂以0.001％至2％接种到奶中。在一个具体实施例中，将所述增强剂以0.01％至1％接种到奶中。在一个具体实施例中，将所述增强剂以0.05％至0.5％接种到奶中。
发酵时间和温度是取决于所希望的最终发酵产品的参数。在一个实施例中，所述发酵温度包含在30℃和45℃之间，具体为在32℃和42℃之间，具体为在35℃和39℃之间。发酵时间是根据发酵结束时所需的最终ph确定的，并且包含在6到75小时之间，具体为12到20小时之间。因此，在一个实施例中，进行所述发酵直至获得包含在4.0和5.0之间，具体为在4.2和4.8之间，具体为在4.3和4.7之间，具体为在4.4和4.6之间的ph。
本发明的方法中可以使用任何基质。因此，在一个具体实施例中，所述基质选自下组，该组由以下组成：奶、植物来源的奶(如豆奶)或谷物粉。
在一个具体实施例中，用于本发明的方法中的所述基质是奶基质。因此，在一个实施例中，本发明涉及一种用于制造发酵奶产品的方法，所述方法包括a)用本发明的植物乳杆菌菌株(具体为本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株)或如本文所定义的细菌组合物或如本文所定义的组合物或如本文所定义的套装盒接种奶基质；和b)发酵所述接种的奶基质，以获得发酵奶产品。“奶基质”意指动物来源的奶。在一个具体实施例中，所述奶基质来源于奶牛、山羊、绵羊、水牛、斑马、马、驴或骆驼等。所述奶可以处于天然状态、重构奶或脱脂奶。
在另一个实施例中，所述基质来源于植物，并且可从植物材料的提取物中获得。在一个具体实施例中，所述基质是大豆，如豆奶。在另一个实施例中，所述基质是谷物粉。
本发明还涉及一种发酵产品，其是使用本发明的植物乳杆菌菌株(具体为本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株)或本发明的细菌组合物或本发明的组合物或本发明的套装盒获得的，具体为通过本发明的方法获得的或可获得的。因此，本发明涉及一种发酵产品，其包含本发明的植物乳杆菌菌株(具体为本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株)。在一个具体实施例中，本发明的植物乳杆菌是在本发明的发酵产品中发现的唯一细菌。在一个具体实施例中，本发明的植物乳杆菌是在本发明发酵产品中发现的唯一酸化细菌。
在一个具体实施例中，本发明的发酵产品是发酵乳产品，具体为发酵乳食物产品或发酵乳饲料产品。在一个具体实施例中，本发明的发酵乳食物产品是新鲜发酵奶。
在一个具体实施例中，本发明的发酵产品是发酵豆产品。在一个具体实施例中，本发明的发酵产品是发酵谷物产品。
在一个具体实施例中，本发明的发酵产品(具体为如本文所定义的发酵乳食物产品)含有如本文所定义的于2017年4月26日保藏在dsmz的dsm32493菌株或其任何变体。在一个具体实施例中，本发明的发酵产品(具体为如本文所定义的发酵乳食物产品)含有dsm32493菌株的任何植物乳杆菌变体，所述变体能够产生呈现(如通过测试a测定的)a)如本文所定义的在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa；b)如本文所定义的在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa；以及c)如本文所定义的在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12的发酵奶。在一个具体实施例中，本发明的发酵产品(具体为如本文所定义的发酵乳食物产品)含有dsm32493菌株的任何植物乳杆菌变体，所述变体保持dsm32493菌株的流变特征中的1种、2种或3种。在一个具体实施例中，本发明的发酵产品(具体为如本文所定义的发酵乳食物产品)含有dsm32493菌株的任何植物乳杆菌变体，所述变体保持dsm32493菌株的流变特征。在一个具体实施例中，本发明的发酵产品(具体为如本文所定义的发酵乳食物产品)含有植物乳杆菌菌株dsm32493的如本文所定义的低后酸化变体。在一个具体实施例中，本发明的发酵产品(具体为如本文所定义的发酵乳食物产品)含有于2017年4月26日保藏在dsmz的植物乳杆菌菌株dsm32493的低后酸化变体，其中所述变体携带在atp合酶α亚基基因中的突变(与dsm32493菌株相比)，具体为携带在其位置506处g到a的突变，具体为其中其atp合酶α亚基基因是如在seqidno：4中所定义的。
用于详细说明在植物乳杆菌菌株表征下的流变特征的定义和具体实施例类似地适用于本发明的发酵乳产品的上下文中，具体说明了但不限于如下：在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力的最小值和范围，在剪切速率200s-1下测得的剪切应力的最小值和范围，在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的最小值和范围，以及任何单独的流变特征或这些流变特征的组合。类似地，用于详细说明植物乳杆菌菌株表征的定义和具体实施例类似地适用于本发明的发酵乳产品的上下文中，具体说明了但不限于如下：dsm32493变体、低后酸化变体和atp合酶α亚基基因的突变，具体为在其位置506处g到a的突变，具体为如在seqidno：4中所定义的atp合酶α亚基基因。
本发明还涉及本发明的植物乳杆菌菌株(具体为本发明的低后酸化植物乳杆菌菌株)或本发明的细菌组合物或本发明的组合物或套装盒在制造发酵乳产品中的用途。
在一个具体实施例中，所述植物乳杆菌菌株是如本文所定义的于2017年4月26日保藏在dsmz的dsm32493菌株或其任何变体，具体为如本文所定义的植物乳杆菌菌株dsm32493的低后酸化变体，具体为植物乳杆菌菌株dsm32493的携带在atp合酶α亚基基因中的突变的低后酸化变体。用于详细说明植物乳杆菌菌株表征的定义和具体实施例类似地适用于本发明的用途的上下文中，具体说明了但不限于如下：dsm32493变体、低后酸化植物乳杆菌和atp合酶α亚基基因的突变，具体为在其位置506处g到a的突变，具体为如在seqidno：4中所定义的atp合酶α亚基基因。
序列
seqidno：1：植物乳杆菌atp合酶操纵子
seqidno：2：dsm32493菌株的atp合酶α亚基基因
seqidno：3：dsm32493菌株的atp合酶α亚基蛋白
seqidno：4：dsm32493菌株的低后酸化突变体的atp合酶α亚基基因
seqidno：5：dsm32493菌株的低后酸化突变体的atp合酶α亚基蛋白
seqidno：6：正向引物
seqidno：7：反向引物
保藏和专业解决方案
以下保藏是根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约进行的。
-于2017年4月26日保藏在登录号为dsm32493下的dsmz的植物乳杆菌菌株(dgcc12411)[德国微生物及细胞培养物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh)，德国不伦瑞克市，英豪丰大街7b号，邮编d-38124(inhoffenstrasse7b，d-38124braunschweig-germany)]。
要求生物材料只能通过向请求者指定的专家发放的样品来提供。就寻求欧洲专利保护的那些指定而言，在提及授予欧洲专利的公告之前或在所述申请被驳回或撤回、或被视为撤回之日之前可获得保藏的微生物的样品，且此样品的发放仅限于由请求获得所述样品的请求人指定的专家，且视情况需征得i)申请人和/或ii)欧洲专利局同意(欧洲专利公约细则第32条)。
现在，通过非限制性实例的方式来描述本发明的各种优选特征和实施例。
实例
实例1：在mrs上选择具有高粘性的植物乳杆菌
使用以下方法筛选杜邦保藏中心(dupontcollection)的植物乳杆菌菌株。因此，将从不同来源分离的214种植物乳杆菌筛选如下：
-将每种植物乳杆菌的单菌落接种到mrs琼脂板上，并于30℃孵育2天；
-根据以下分类，基于通过接种环接触菌落时形成的长丝的强度对粘性进行人工评分：无可检测的粘性(无长丝形成)、低粘性、中粘性或高粘性(分别参见图1a至1d)。
从所述214种测试菌株中，获得以下分类：
-1种菌株被归类为高粘性
-2种菌株被归类为中粘性
-17种菌株被归类为低粘性
-194种菌株被归类为无可检测的粘性
然后对代表每一类的一种植物乳杆菌菌株进行测定用于流变学和感官分析。
实例2：用dsm32493发酵的奶的流变特性以及与3个其他植物乳杆菌菌株的比较
将选自实例1的4个植物乳杆菌菌株用于发酵奶，并确定所获得的发酵奶的流变特性。
菌株：使用以下菌株：
-在实例1中显示出高粘性的dsm32493菌株；
-在实例1中显示出中粘性的lp12111菌株；
-在实例1中显示出低粘性的lp12428菌株；
-在实例1中显示出无可检测的粘性的植物乳杆菌115菌株(也称为dgcc4715，在专利ep2245943b1中以dsm22266保藏)。
进行了以下测试a：
奶：将添加有6％蔗糖和来自oxoidtm的0.1％酵母提取物粉(lp0021)的2luht奶(3.2％蛋白质，3.5％脂肪)在85℃下热处理15min并冷却至室温。
发酵：对于每种菌株，将冷冻培养物以1.107cfu/ml接种到奶中。然后将接种的奶在30℃下发酵至达到ph4.5(典型地约22h至24h)。
流变测量：发酵后，将样品通过旋转器(rzr2051控制器，海道尔夫公司)以100rpm搅拌1.5min并在4℃下储存过夜，然后通过流变仪进行测量。使用的罐和囊是如图8所公开的。使用同轴圆筒c-cc27-t200/ss和bob杯(安东帕公司mcr302，cc27-sn27450，奥地利)，通过流变仪来评估所述样品。在测量期间，将流变仪设置为10℃的恒定温度。设置如下：
-保持时间(某种程度上重建原始结构)：10分钟，没有任何物理应力应用于所述样品。
-500s内的25个测量点(每20s一个)
-旋转步骤(测量在11.6l/s下的剪切应力，在200l/s下的剪切应力，以及在146l/s下的剪切应力减去在41.1l/s下的剪切应力的差值)
设计两个步骤：
剪切速率：d(γ)/dt＝[0.1-200]l/slog和[200-0.1]l/slog
每个步骤包含500s内的25个测量点(每20s一个)
获得了使用dsm32493菌株、lp12111菌株、lp12428菌株或lp115菌株获得的发酵奶的流动曲线(图2)。如图2中所示，与有着相近流动曲线的lp12111、lp12428和lp115菌株相比，由于其显著更高的稠度和粘性，dsm32493菌株的流动曲线是非典型的。
然后计算了每种发酵奶在11.6l/s下的剪切应力、在200l/s下的剪切应力以及在146l/s下的剪切应力和在41.1l/s下的剪切应力之间的差值(表1)。在11.6l/s下的剪切应力与感官稠度相关、在200l/s下的剪切应力与口腔稠度相关以及在146l/s下的剪切应力和在41.1l/s下的剪切应力之间的差值与粘性相关。
表1：用dsm324931菌株、lp12111菌株、lp12428菌株、或lp115菌株获得的发酵奶在11.6l/s下的剪切应力、在200l/s下的剪切应力以及在146l/s下的剪切应力和在41.1l/s下的剪切应力之间的差值。
如在表1中详细说明的，使用dsm32493获得的发酵奶显示出高稠度、口腔稠度和粘性值，几乎是使用lp12111、lp12428和lp115菌株获得的那些的两倍。
因此，这些结果表明，使用本发明的植物乳杆菌(具体为dsm32493菌株)可以获得具有高稠度、口腔稠度和粘性值(如本文所定义的)的发酵奶。
有趣的是且作为本发明的优点，这些结果还表明，使用本发明的植物乳杆菌的纯培养物(具体为dsm32493菌株的纯培养物)可以获得具有高稠度、口腔稠度和粘性值(如本文所定义的)的发酵奶。这与用文献中描述的组合物获得的发酵奶形成对比，所述组合物包含若干个菌株(其中至少一个嗜热链球菌菌株)。
实例3：用dsm32493发酵的奶的感官分析以及与3个其他植物乳杆菌菌株的比较
由五名培养物/乳应用专家组成的专家小组评估了使用dsm32493菌株、lp12111菌株、lp12428菌株或lp115菌株获得的每种发酵奶的感官特性。在蛛网图上评估并报告了七种风味和质地描述语(图3)。使用lp12111、lp12428和lp115菌株获得的发酵奶显示出相当的图表，而使用dsm32493菌株获得的发酵奶显示出在这些描述语的若干个中的显著差异。因此，使用lp12111、lp12428和lp115菌株之一获得的发酵奶显示出粒状质地(因此外观无光泽)、低粘性和顺滑度、以及低至中的口中稠度和汤匙稠度。相反，使用dsm32493菌株获得的发酵奶显示出非常高的口中稠度和汤匙稠度、非常长的质地、高粘性和顺滑度并且具有光泽的外观。使用dsm32493菌株、lp12111菌株、lp12428菌株或lp115菌株获得的发酵奶的外观示于图4中。
实例4：用dsm32493菌株发酵的奶的流变特性以及与传统起子的比较
然后，将使用dsm32493获得的发酵奶的流变特性与使用由嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的组合组成的、具有强质地特性的商业酸奶起子培养物(丹尼斯科公司(danisco)；
表2：用dsm324931菌株或
如图5中所示和表2中详细说明的，单独的dsm32493菌株足以制造具有与使用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌(l.bulgaricus)的传统培养物获得的发酵奶的稠度和粘性一样好的发酵奶。此外，这个对比实例证实了dsm32493菌株提供具有高口腔稠度的发酵奶的独特性。
由dsm32493菌株提供的这一高口腔稠度值通过图6左侧照片上清晰可见的长质地(与右侧照片[使用
这些结果证实，dsm32493对获得呈现高稠度、高粘性和高口腔稠度的发酵奶具有工业意义。
实例5：dsm32493菌株的低后酸化植物乳杆菌变体的选择
将dsm32493菌株在mrs琼脂板上划线并在30℃下厌氧孵育2天。挑取单菌落，并使其在30℃、10mlmrs液体培养基中生长过夜。将200μl新鲜培养物(o.d＝0.8)接种到10ml的含有700μg/ml新霉素的0.5xmrs中，然后在30℃下孵育2天。制备新鲜培养物的连续稀释液，并将其铺板到含有700μg/ml新霉素的0.5xmrs琼脂板上，并在30℃下孵育2天。挑取单菌落，并将每个菌落接种到96孔板中的0.5xmrs(ph6.3)和0.5xmrs(ph调节至ph4.5)中，并在30℃下孵育2天。选择在0.5xmrs(ph6.3)而非0.5xmrs(ph4.5)中生长的菌落。使用icinac监测在30℃下mrs中的每个选定菌落的酸化曲线，持续4天。选择具有显著更高的终点ph的菌落(并且在发酵温度下被认为是低后酸化突变体)并测定其dna序列。
通过上述方案选择的一个突变体(lp12733)显示含有在atp合酶操纵子的atp合酶α亚基基因的位置506处g到a的突变，从而导致位置169处的甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代。可以通过使用如在seqidno：6和7中定义的引物进行pcr，然后使用如在seqidno：6中定义的引物进行dna测序来检查该突变的存在。
将dsm32493菌株及其低后酸化突变体lp12733用于发酵奶，并使用本文所述的测试b记录随时间推移的ph。获得了cinac曲线，并将其示于图7中。
测试b：
奶：将添加有6％蔗糖和来自oxoidtm的0.1％酵母提取物粉(lp0021)的uht奶(3.2％蛋白质，3.5％脂肪)在85℃下热处理15min并冷却至室温。
发酵：对于每种菌株，将冷冻干燥的培养物以1.107cfu/ml接种到奶中，并将接种的奶放置在37℃(t＝0)下。将接种的奶发酵直至ph达到4.5(tph4.5)并保持在37℃下至少48小时，并且持续监测所述奶的ph。
后酸化测量：使用δph(δph＝在(tph4.5 48h)下的ph-ph4.5)表示在发酵温度下的后酸化。
如图7中显示的，使用dsm32493菌株在tph4.5 48h小时获得的发酵奶的ph为4.1，而使用lp12733菌株(dsm32493菌株的低后酸化突变体)获得的发酵奶的ph为4.5(即所述发酵奶的ph在ph4.5下是稳定的)。因此，dsm32493菌株的δph为约0.4，而lp12733菌株的δph为0。
这些结果证实了lp12733菌株(dsm32493的低后酸化突变体)对获得不仅呈现出高稠度、高粘性和高口腔稠度，而且在发酵温度下具有低后酸化的发酵奶具有工业意义。
pct
仅用于受理局
仅用于国际局
1.一种植物乳杆菌菌株，其当接种到奶中时，产生呈现如通过测试a测定的以下流变特征中的一种、两种或三种的发酵奶：
a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa；
b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa；
c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌菌株，所述植物乳杆菌菌株是：于2017年4月26日保藏在dsmz的菌株dsm32493或dsm32493菌株的变体，所述菌株dsm32493或dsm32493菌株的变体产生呈现如通过测试a测定的以下流变特征中的一种、两种或三种的发酵奶：a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa；b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa；c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12；或dsm32493菌株的保持dsm32493菌株的流变特征中的1种、2种或3种的变体。
3.根据权利要求1或2所述的植物乳杆菌菌株，其进一步特征在于在发酵温度下是低后酸化菌株。
4.根据权利要求3所述的植物乳杆菌菌株，其在atp合酶操纵子内突变。
5.根据权利要求4所述的植物乳杆菌菌株，其携带在atp合酶操纵子的atp合酶α亚基基因中的突变，具体为其携带在atp合酶α亚基基因的位置506处的g到a的突变。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的植物乳杆菌菌株，其是于2017年4月26日保藏在dsmz的菌株dsm32493的变体。
7.一种细菌组合物，所述细菌组合物：包含根据权利要求1至6中任一项所述的菌株，其特别是与至少另一种乳酸菌，特别是与德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株或与另一种植物乳杆菌菌株组合；或由其组成。
8.一种组合物或套装盒，所述组合物或套装盒包含根据权利要求1至6中任一项所述的植物乳杆菌菌株、或根据权利要求7所述的细菌组合物、以及增强剂如酵母提取物或含有氨基酸的组合物，或由其组成。
9.一种用于制造发酵产品的方法，所述方法包括a)用根据权利要求1至6中任一项所述的植物乳杆菌菌株或根据权利要求7所述的细菌组合物或根据权利要求8所述的组合物或套装盒接种基质，和b)发酵所述接种的基质，以获得发酵产品。
10.根据权利要求9所述的用于制造发酵产品的方法，其中所述植物乳杆菌菌株与增强剂如酵母提取物或含有氨基酸的组合物一起接种。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述基质是奶并且所述发酵产品是发酵乳产品。
12.一种发酵产品，所述发酵产品包含根据权利要求1至6中任一项所述的植物乳杆菌菌株或者所述发酵产品是通过根据权利要求9至11中任一项所述的方法获得的或可获得的。
13.根据权利要求12所述的发酵产品，其是发酵乳产品如新鲜发酵奶。
14.根据权利要求12至13中任一项所述的发酵产品，所述发酵产品包含：于2017年4月26日保藏在dsmz的植物乳杆菌菌株dsm32493或dsm32493菌株的变体，所述菌株dsm32493或dsm32493菌株的变体产生呈现如通过测试a测定的以下流变特征中的一种、两种或三种的发酵奶：a)在剪切速率11.6s-1下测得的剪切应力高于30pa；b)在剪切速率200s-1下测得的剪切应力高于60pa；c)在146s-1下测得的剪切应力减去在41.1s-1下测得的剪切应力的差值高于12；或dsm32493菌株的保持dsm32493菌株的流变特征中的1种、2种或3种的变体。
15.根据权利要求1至6中任一项所述的植物乳杆菌菌株或根据权利要求7所述的细菌组合物或根据权利要求8所述的组合物或套装盒在制造发酵乳产品中的用途。
技术总结