相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年9月15日提交的美国临时申请第62/559,391号和于2018年8月31日提交的美国临时申请第62/725,376号的权益。前述申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
允许用于增加如细胞分裂等的细胞特性速率的方法具有改善生物产物和治疗干预的潜力，尤其是在从个体中移除细胞，进行培养然后再引入此个体的情况下。
t细胞识别与例如各种癌症或感染性生物相关的通用抗原的能力由t细胞抗原受体(tcr)赋予，所述受体由α(alpha)链和β(beta)链或γ(gamma)和δ(delta)链组成。t细胞和各种亚群在癌症、自身免疫性病症、炎症性疾病、过敏性疾病和感染性疾病的治疗中具有广泛的治疗意义。长期以来，一直需要一种可靠、有效和快速的方式来扩充t细胞以及其它细胞。
技术实现要素：
提供了用于培养和/或扩充细胞(例如，人细胞)的组合物和方法，其中细胞产生一种或多种产物(例如，一种或多种蛋白质(例如，一种或多种异源蛋白质)、一种或多种核酸分子(例如，一种或多种异源蛋白质)、一种或多种病毒和/或一种或多种vlp)。本文进一步尤其提供了用于培养和/或扩充细胞(例如，t细胞)的组合物、系统、试剂盒和方法，以及用细胞(例如t细胞)治疗病症的方法。
一方面，本文提供了包括环糊精和至少一种脂质的培养基组合物(例如，无血清细胞培养基组合物)。在一些实施例中，组合物包括亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇和甲基化环糊精。
一方面，本文包含了包括环糊精和至少一种脂质的培养补充剂组合物(例如，无血清细胞培养补充剂组合物)。在一些实施例中，组合物包括亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇和甲基化环糊精。
本文进一步提供了包括亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇和至少一种环糊精的细胞培养基组合物(例如，无血清细胞培养基组合物)和包括亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇和至少一种环糊精的细胞培养补充剂组合物(例如，无血清细胞培养补充剂组合物)。在许多实例中，环糊精是甲基化环糊精。在许多实例中，环糊精以约50μm到约200μm的水平存在。在许多实例中，胆固醇是合成性胆固醇，并且胆固醇以约5μm到约30μm的浓度存在。另外地，在一些实例中，所述至少一种其它ω-6脂肪酸是多不饱和ω-6脂肪酸。在一些实例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是或包含花生四烯酸。在一些实例中，多不饱和ω-6脂肪酸是选自由以下组成的群组中的一种或多种脂肪酸：花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸。在一些实例中，细胞培养补充剂组合物的有效稀释度为约1∶10到约1∶5000。
本文所提供的细胞培养基组合物(例如，无血清细胞培养基组合物)和/或本文所提供的细胞培养基补充剂(例如，无血清细胞培养基补充剂)组合物能够用于培养可以产生蛋白质(例如，异源蛋白质)、核酸分子(例如，异源蛋白质)、疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段的细胞。
可以使用本文所提供的细胞培养基组合物培养的细胞包含真菌细胞(例如，酵母细胞，如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae))、植物细胞和动物细胞(例如，昆虫细胞，如sf9细胞以及哺乳动物细胞，如人细胞、鸡细胞、猴细胞等)。在一些实例中，动物细胞是牛细胞、犬细胞、猫细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、灵长类细胞或人细胞。另外，如本文所述的培养的细胞可以是二倍体细胞。
在一些实例中，本文所提供的细胞培养基组合物用于培养细胞，其中细胞选自由以下组成的群组：mrc-5、mrc-5rcb、mrc-9、wi-38、2bs、walvax-2、imr-90、imr-91、kmb-17、hut系列细胞、张氏肝细胞(changliver)、u937、mdck、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero和前述细胞的任何克隆。
在一些实例中，本文所提供的细胞培养基组合物进一步包括2-脱氧-d-葡萄糖。
在一些实例中，本文所提供的细胞培养基组合物可以用于增加细胞的生长(例如，与省略一种或多种组分的细胞培养基组合物相比的生长速率)、细胞的活细胞密度、由感染的细胞产生的病毒的病毒滴度或其组合。
在一些实例中，使用本文所提供的细胞培养基组合物培养的细胞被病毒(例如，动物病毒、植物病毒、噬菌体等)感染或含有编码期望产生的一种或多种表达产物(例如，一种或多种蛋白质，如一种或多种细胞因子、促红细胞生成素、抗体等)的异源核酸。在一些实例中，此类病毒是选自由以下组成的群组中的一种或多种病毒：水痘带状疱疹病毒(vzv)、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、甲型肝炎病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、天花病毒、水痘病毒、黄热病病毒、乳头瘤病毒、埃博拉病毒、hiv、狂犬病病毒风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、甲型肝炎病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、天花病毒、水痘病毒、黄热病病毒、乳头瘤病毒、埃博拉病毒、hiv、狂犬病病毒或水疱性口炎病毒(vsv)和登革热病毒。在一些实例中，使用在本文所提供的细胞培养基组合物中培养的细胞产生的病毒粒子源自细小病毒科(parvoviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、黄病毒科(flaviviridae)或噬菌体。
可以将本文所提供的细胞培养补充剂组合物添加到基础培养基，以培养可以产生蛋白质、疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸和/或病毒片段的细胞(例如二倍体细胞)。在一些实例中，此类细胞在无血清条件下培养。
本文进一步提供了用于培养细胞群体(例如，二倍体细胞群体)的方法，所述方法包括在包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基中温育细胞群体。在一些实例中，此类方法包括产生疫苗的细胞(例如，二倍体细胞)，其中所述方法包括在无血清细胞培养基中温育细胞群体，所述无血清细胞培养基包括：(i)环糊精(例如，甲基化环糊精)、亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸(例如，一种或多种多不饱和ω-6脂肪酸，如以下中的一种或多种：花生四烯酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸)和胆固醇，或适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂；其中与没有环糊精的含血清培养基中的活细胞密度相比，所述培养使所述无血清细胞培养基中的活细胞密度增加。
在一些实例中，用于培养细胞群体(例如，二倍体细胞群体)的方法包含以下实例：(i)培养基或补充物增加了：细胞的生长、细胞的活细胞密度、病毒感染的细胞的病毒滴度或其组合；和/或(ii)细胞(例如，二倍体细胞)能够在无血清条件下产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或其病毒片段；和/或(iii)细胞被病毒感染。另外，在一些实例中：(i)病毒是动物病毒、植物病毒或噬菌体；和/或(ii)病毒选自由以下组成的群组：水痘带状疱疹病毒(vzv)、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、甲型肝炎病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、天花病毒、水痘病毒、黄热病病毒、乳头瘤病毒、埃博拉病毒、hiv、狂犬病病毒风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、甲型肝炎病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、天花病毒、水痘病毒、黄热病病毒、乳头瘤病毒、埃博拉病毒、hiv、狂犬病病毒或水疱性口炎病毒(vsv)和登革热病毒；和/或(iii)病毒粒子源自细小病毒科、逆转录病毒科、黄病毒科或噬菌体。
在一些实例中，使用本文所提供的组合物和方法培养的细胞群体选自由以下组成的群组：mrc-5细胞、mrc-5rcb细胞、mrc-9细胞、wi-38细胞、2bs细胞、walvax-2细胞、imr-90细胞、imr-91细胞、kmb-17细胞、hut系列细胞、张氏肝细胞、u937细胞、mdck细胞、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero细胞和这些细胞的任何克隆。
本文进一步提供的组合包括：(a)(i)细胞群体；(ii)包括环糊精和至少一种脂质的无血清细胞培养基，或(b)(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)包括环糊精和至少一种脂质的补充剂，或(c)(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂。在此类组合的一些实例中(i)细胞是动物细胞；和/或(ii)动物细胞是牛细胞、猫细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、灵长类细胞或人细胞；和/或(iii)动物细胞是二倍体细胞；和/或(iv)细胞选自由以下组成的群组：mrc-5细胞、mrc-5rcb细胞、mrc-9细胞、wi-38细胞、2bs细胞、walvax-2细胞、imr-90细胞、imr-91细胞、kmb-17细胞、hut系列细胞、张氏肝细胞、u937细胞、mdck细胞、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero细胞和这些细胞的任何克隆。在一些实例中，细胞(例如，二倍体细胞)在无血清条件下产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段。
本文进一步提供了产生细胞培养基(例如，无血清培养基、无血清二倍体细胞培养基等)的方法，所述方法包括混和(i)基础培养基；以及(ii)包括环糊精和至少一种脂质的补充剂；或(ii)适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂。在一些实例中，补充剂进一步包括一种或多种生长因子。
本文进一步提供了用于补充细胞培养基(例如，二倍体细胞培养基)的系统，所述系统包括(i)一种或多种不同的环糊精，其中每种环糊精在单独的容器中；以及(ii)两种或更多种不同的脂肪酸，其中每种脂肪酸在单独的容器中。
本文进一步提供了用于培养细胞或细胞系的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)细胞群体；(ii)包括环糊精和至少一种脂质的无血清细胞培养基，和/或(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)包括环糊精和至少一种脂质的补充剂，和/或(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂。本文所提供的试剂盒包含这些，其中：(i)细胞是动物细胞；或(ii)动物细胞是牛细胞、猫细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、灵长类细胞或人细胞；或(iii)动物细胞是二倍体细胞；或(iv)细胞选自由以下组成的群组：mrc-5细胞、mrc-5rcb细胞、mrc-9细胞、wi-38细胞、2bs细胞、walvax-2细胞、imr-90细胞、imr-91细胞、kmb-17细胞、hut系列细胞、张氏肝细胞、u937细胞、mdck细胞、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero细胞和这些细胞的任何克隆。本文所提供的试剂盒还包含这些，其中所述细胞在无血清条件下产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段。
一方面，本文提供了用于培养细胞群体(例如，t细胞群体)的方法。此类方法包含在包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基中温育群体。
一方面，本文提供了培养包括cd8 t细胞和cd4 t细胞的t细胞群体同时最小化群体内cd8 t细胞对cd4 t细胞比率的变化的方法。此类方法包含在包括环糊精和至少一种脂质(例如，多不饱和脂肪酸)的培养基中温育群体。
一方面，本文提供了用于优先扩充细胞亚群(例如，t细胞亚群)的成员的方法。此类方法包括使混合的细胞群体(例如，t细胞)暴露于：(i)环糊精；和(ii)脂肪酸。在一些实施例中，调整两种或更多种脂肪酸的摩尔比以诱导细胞亚群(例如，t细胞亚群)的成员相较于其它t细胞亚群(例如，其它t细胞亚群中的一个或多个)的成员优先扩充。
一方面，本文提供了培养包括cd8 t细胞和cd4 t细胞的t细胞群体同时增加群体内cd8 t细胞对cd4 t细胞比率的方法。此类方法包括在包括2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)的细胞培养基中温育群体。
本发明进一步包含用于调整和/或维持群体内cd8 t细胞对cd4 t细胞比率的组合物和方法。此类方法包含那些方法，其中使cd8 t细胞与cd4 t细胞的混合群的细胞与(1)本文所述的环糊精/脂质组合物、(2)2-dg和/或(1)和(2)的组合接触。在一些实例中，期望生成或维持其中cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率为1∶1或接近1∶1的t细胞群体。在这种比率“接近1∶1”情况下指小于10％的变化。因此，cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率为1∶0.95将接近1∶1。
在一些实例中，可以期望生成和/或维持其中cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率不为1∶1或不接近1∶1的t细胞群体。在此类实例中，cd8 t细胞或cd4 t细胞可以在群中占主导。作为一个实例，在一些实例中，可以期望具有其中cd4 t细胞的数量是cd8 t细胞的数量的两倍(cd4 t细胞对cd8 t细胞的比率为1∶0.5)的t细胞群体。因此，本发明提供了用于生成和/或维持t细胞群体的组合物和方法，其中cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率或其中cd4 t细胞对cd8 t细胞的比率为约1∶1到约1∶0.1(例如，约1∶1到约1∶0.2、约1∶1到约1∶0.3、约1∶1到约1∶0.4、约1∶1到约1∶0.5、约1∶1到约1∶0.7等)。
一方面，本文提供了用于治疗有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向受试者施用使用本文所提供的方法、组合物、试剂盒或系统获得的t细胞。
一方面，本文提供了一种组合，其包括(i)细胞群体(例如，t细胞)，(ii)包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基，和/或(iii)包括2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)的细胞培养基。
一方面，本文提供了一种生物发酵罐，其包括本文所提供的培养基和/或补充剂与细胞(例如，t细胞)群的组合。一方面，本文提供了一种细胞培养板或烧瓶，其包括本文所提供的培养基和/或补充剂与细胞(例如，t细胞)群的组合。
一方面，提供了一种用于补充细胞培养基(例如，t细胞培养基)的系统。系统包含(i)两种或多种不同的环糊精，其中每种环糊精在单独的容器中；(ii)两种或更多种不同的脂肪酸，其中每种脂肪酸在单独的容器中；以及(iii)2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)。
一方面，提供了一种用于培养细胞(例如，t细胞)的试剂盒。试剂盒可以包含以下中的一种或多种：培养基(例如，无血清培养基)、环糊精、一种或多种脂质和/或2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)。
本文还提供了包括(i)细胞(例如，二倍体细胞或非二倍体细胞)群体以及(ii)包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基的组合。在一些实例中，细胞(例如，二倍体细胞)产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段。在许多实例中，这些组合将是无血清的。
本文进一步提供了用于培养细胞群体(例如，二倍体细胞群体)的方法，所述方法包括在包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基中温育细胞群体。在许多实例中，细胞培养基将是无血清的。在一些实例中，细胞群体选自由以下组成的群组：mrc-5、mrc-5rcb、wi-38、2bs、walvax-2、imr-90、imr-91、kmb-17、vero细胞、张氏肝细胞、u937、mrc-9、mdck、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、hut(t细胞系)系列(例如，hut78、hut102等)或任何此类细胞的克隆。在一些实例中，细胞产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段。在许多实例中，此类产生将在无血清条件下进行。
本文还提供了用于补充细胞培养基(例如，二倍体细胞培养基)的系统，所述系统包括(i)一种或多种不同的环糊精，其中每种环糊精在单独的容器中；以及(ii)两种或更多种不同的脂肪酸，其中每种脂肪酸在单独的容器中。此类系统可以进一步包括生长因子。
本文进一步提供了用于补充二倍体细胞培养基的系统，所述系统包括(i)环糊精；以及(ii)两种或更多种不同的脂肪酸，其中每种脂肪酸在单独的容器中。
还提供了用于培养产生疫苗的细胞或细胞系的试剂盒，所述试剂盒包括基础培养基和无血清生长补充剂。在一些实例中，此类试剂盒中的无血清生长补充剂将包括环糊精和一种或多种脂质。另外，试剂盒可以含有或适合于培养产生疫苗的细胞或细胞系。在一些实例中，产生疫苗的细胞是二倍体细胞(例如，人细胞)或非二倍体细胞。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体地阐述。通过参考阐述了说明性实施例的以下详细说明以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述实施例中利用了本发明的原理，在所述附图中：
图1描绘了表4中呈现的数据。结果表明，与脂质浓缩物(1∶100)和无脂质补充剂的培养基相比，cd补充剂1、2和3(1∶500)增加了表达为累积群体倍增数随时间的变化的t细胞扩充。cd补充剂1、2和3的滴定表明，高浓度(1∶250)会引起毒性，而低浓度(1∶1000、1∶1250)会产生较少的群体倍增数并且因此产生减少的t细胞扩充。
图2描绘了表5中呈现的数据，突显了从图1的扩充中选择的条件。结果表明，cd补充剂1、2和3(1∶500)产生了比脂质浓缩物和无脂质补充剂的培养基更大的群体倍增数。
图3描绘了表6中呈现的数据，所述数据是与图1(表4)中相同的生长数据，但以累积活t细胞随时间的变化表示。结果表明，cd补充剂1、2和3(1∶500)到第12天会产生最多活t细胞。cd补充剂1、2和3的滴定表明，高浓度(1∶250)会引起毒性，而低浓度(1∶1000、1∶1250)会产生较少的活t细胞并且因此产生减少的t细胞扩充。cd补充剂1、2和3之间的性能差异在以累积细胞数随时间的变化表示时比在以累积群体倍增数随时间的变化表示时更明显。
图4描绘了表7中呈现的数据，突显了从图3的扩充中选择的条件。结果表明，cd补充剂1、2和3(1∶500)产生了比脂质浓缩物和无脂质补充剂的培养基更多的累积活t细胞。
图5描绘了表8中呈现的数据，所述数据表示在图1和图3所表示的扩充期间的t细胞存活率。结果表明，与其它cd补充剂浓度、脂质浓缩物和无脂质补充相比，cd补充剂1、2和3(1∶500)在整个扩充过程中维持增加的细胞存活率。cd补充剂1、2和3的滴定表明，高浓度(1∶250)会引起毒性，而低浓度(1∶1000、1∶1250)可能无法提供足够的脂质来维持增加的细胞存活率。
图6描绘了表9中呈现的数据，突显了从图5的扩充中选择的条件。结果表明，与脂质浓缩物和无脂质补充剂的培养基相比，cd补充剂1、2和3(1∶500)在整个扩充过程中维持增加的细胞存活率。
图7描绘了用于分化表型分析的门控策略。用针对cd3、cd4、cd8、ccr7和cd62l的抗体对扩充了10天的t细胞进行染色。使用顺序门控将t细胞表征为中央记忆(tcm：ccr7 /cd62l )、中间(ccr7-/cd62l )和效应记忆(tem：ccr7-/cd62l-)。在beckman-coultergallios分析仪中进行流式细胞术分析。
图8描绘了表10中呈现的门控cd3 群中cd4 和cd8 t细胞的平均百分比。第0天表示两个群在扩充之前的平均频率。结果表明，与用5％人ab血清和cd补充剂2和3补充的培养基相比，用cd补充剂1补充的培养基中的cd8 t细胞优先扩充。误差条表示三个复制品之间的标准偏差。在不受任何理论束缚的情况下，由于cd补充剂1含有所有多不饱和脂肪酸并且产生了最有利的cd4 /cd8 比率，因此可以预期多不饱和脂肪酸会产生更多的cd8 细胞生长。具体来说，由于cd补充剂1主要含有ω-6多不饱和脂肪酸并且基本上含有脂肪酸，这些特定脂肪酸可以有助于增加cd8 细胞扩充。
图9描绘了在5％人ab血清和cd补充剂1、2和3中扩充的cd4 t细胞的分化状态。用5％人ab血清培养的cd4 t细胞失去ccr7 /cd62l 表型并且累积ccr7-/cd62l-表型，表明了细胞应激和营养缺乏。可替代地，用cd补充剂1、2和3培养的cd4 t细胞避免了ccr7-/cd62l-累积。
图10描绘了在5％人ab血清和cd补充剂1、2和3中扩充的cd8 t细胞的分化状态。用5％人ab血清培养的cd8 t细胞失去ccr7 /cd62l 表型并且累积ccr7-/cd62l-表型，表明了细胞应激和营养缺乏。可替代地，用cd补充剂1、2和3培养的cd8 t细胞避免了ccr7-/cd62l-累积。
图11比较了在含有5％人ab血清或cd补充剂1的培养基中生长的t细胞之间的th1细胞因子谱。用
图12示出了用pancd3 t细胞从2-dg的滴定获得的数据(表12)。使用补充有5％人ab血清的x-vivotm15培养基作为阳性对照组。简而言之，在无菌过滤水中以100mm的原液浓度制备2-dg。用
图13和图14表示了表13中示出的数据，所述数据描绘了用于分化表型分析的门控策略。用针对cd3、cd4和cd8的抗体对扩充10天的t细胞进行染色。在beckman-coultergallios分析仪中进行流式细胞术分析。结果表明，用0.25mm2-dg或0.5mm2-dg补充细胞会导致cd8 对cd4 的比率增加约3倍。
图15和图16表示了用4mm2-dg培养的原初和非原初t细胞的生长曲线。数据表示于表14和表15中。使用untouched人cd8 和cd4 t细胞试剂盒通过阴性选择从pbmc中分离出cd8 和cd4 t细胞。使用cd45ra纳米珠(美天旎公司(miltenyi))通过阳性选择从富集的t细胞中分离出原初和非原初t细胞。纯化来自pancd3 t细胞的原初和非原初t细胞是为了确定2-dg是否对终末或非终末分化型供体(非原初t细胞)有影响。两种细胞类型均用2-dg生长。
图17和图18描绘了表16和表17中示出的数据，所述数据示出了用于分化表型分析的门控策略。用针对cd3、cd4和cd8的抗体对扩充10天的t细胞进行染色。结果突显2-dg对原初t细胞(cd8 对cd4 t细胞的比率增加3.2倍)的影响比对非原初t细胞要强很多。
图19和图20表示了2-dg在以设定比率(分别为5∶1和10∶1)混合的cd4 t细胞和cd8 t细胞中的生长曲线。两种细胞的比率均类似地增加。(参见表18和表19。)
图21和图22描绘了表20和表21中呈现的门控cd3 群中cd4 和cd8 t细胞的平均百分比。第0天表示两个群在扩充之前的平均频率。这些结果表明，与第0天相比，2-dh能够修正cd8 t细胞中的实质缺陷。
图23展示了用于将t细胞培养12天的方案。用
图24和图25示出了在存在或不存在2-dg的情况下培养并且在所示的不同时间点在扩充期间引入的t细胞的生长曲线。在第0天、第3天、第5天、第7天开始用补充剂进行处理，并用随后的进料来维持。将t细胞在无血清t细胞培养基和补充有5％人ab血清的x-vivotm15培养基中培养12天。
图26表示了表24中示出的数据，所述数据突显了在不同时间点存在或不存在2-dg的情况下以及用随后的进料培养的t细胞的cd8 对cd4 的比率的增加倍数。结果表明，仅在第7天以及每次向细胞进料时用0.25mm2-dg培养t细胞会导致cd8 t细胞同样增加3倍。
图27表示了t细胞扩充12天并用
图28描述了在pancd3 t细胞中2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)的滴定(0、1mm、2mm和4mm)(表25)。添加补充有5％人ab血清的x-vivotm作为阳性对照组。简而言之，在无菌过滤水中以100mm的原液浓度制备2-dg。用
图29和图30表示了表26中示出的数据，所述数据描绘了用于分化表型分析的门控策略。用针对cd3、cd4和cd8的抗体对扩充10天的t细胞进行染色。在beckman-coultergalliostm分析仪中进行流式细胞术分析。结果表明，用4mm2-dg补充细胞会导致cd8 对cd4 的比率增加约4.1倍。
图31和图32表示了用4mm2-dg培养的原初和非原初t细胞的生长曲线。数据表示于表27和表28中。使用untouched人cd8 和cd4 t细胞试剂盒通过阴性选择从pbmc中分离出cd8 和cd4 t细胞。使用cd45ra纳米珠(美天旎公司)通过阳性选择从富集的t细胞中分离出原初和非原初t细胞。从pancd3 t细胞纯化原初和非原初t细胞的原因是为了看2-dg是否将对终末或非终末分化型供体(非原初t细胞)有任何影响。两种细胞类型均用2-dg生长。
图33和图34描绘了表29和表30中示出的数据，所述数据示出了用于分化表型分析的门控策略。用针对cd3、cd4和cd8的抗体对扩充10天的t细胞进行染色。结果突显2-dg对原初t细胞(cd8对cd4的比率增加2.4倍)的影响比对非原初t细胞要强很多。
图35表示了表31中示出的数据，所述数据描述了在pancd3 t细胞中2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)的滴定(0mm、0.25mm和0.5mm)。添加补充有5％人ab血清的x-vivotm作为阳性对照组。用
图36和图37表示了表32中示出的数据，所述数据描绘了用于分化表型分析的门控策略。用针对cd3、cd4和cd8的抗体对扩充10天的t细胞进行染色。在beckman-coultergallios分析仪中进行流式细胞术分析。结果表明，0.25mm2-dg或0.5mm2-dg均会导致cd8 对cd4 的比率增加约3倍。图36的数据是来自单个供体的代表。图37是来自3个不同供体的代表。
图38和图39示出了表33和表34中示出的数据，所述数据表示了2-dg在以设定比率(分别为5∶1和10∶1)混合的cd4 t细胞和cd8 t细胞中的生长曲线。两种细胞的比率均类似地增加。
图40和图41描绘了表35和表36中呈现的门控cd3 群中cd4 和cd8 t细胞的平均百分比。第0天表示两个群在扩充之前的平均频率。结果表明，与第0天相比，2-dg能够修正cd8 t细胞中的较大缺陷。
图42展示了将t细胞培养12天。用
图43和图44示出了在不同时间点用2-dg培养的t细胞的生长曲线。在第0天、第3天、第5天、第7天将2-dg与细胞一起培养，并用随后的进料来维持。将t细胞在无血清t细胞培养基和具有5％人ab血清的培养基中培养12天。表37和表38.
图45表示了表39中示出的数据，所述数据突显了在不同时间点以及每次向细胞进料时用2-dg培养的t细胞的cd8 对cd4 的比率的增加倍数。结果表明，仅在第7天以及每次向细胞进料时用0.25mm2-dg培养t细胞会导致cd8∶cd4比率同样增加3倍。
图46和图47表示了表40和表41中示出的分别用不同浓度的cd脂质浓缩物1和2以及在5％人ab血清中作为阳性对照组培养的2-dg的生长曲线。将细胞扩充12天。结果表明，具有2-dg的1∶1000clc1和clc2展现出最佳的细胞扩充。
图48和图49表示了来自表42和表43的数据，所述数据描绘了用于分化表型分析的门控策略。用针对cd3、cd4和cd8的抗体对扩充10天的t细胞进行染色。在beckman-coultergallios分析仪中进行流式细胞术分析。结果表明，与第0天扩充前相比，当添加2-dg与clc1时，cd8∶cd4比率增加1.6倍，并且当添加2-dg与clc2时，cd8∶cd4比率增加1.4倍。
图50：二倍体活细胞密度(vcd)表达为每毫升的活细胞。此图中的结果表明，二倍体sfm在疫苗生产中常用的各种二倍体细胞系(例如，mrc-5、wi-38、imr-90等)中产生了细胞生长。此处示出了示例性二倍体细胞(例如，mrc-5)的结果，并且代表至少3个独立实验。
图51：此图中的结果表明，与脂浓缩物(1∶100和1∶1000)相比，cd补充剂1和2增加了mrc-5vcd。另外，cd补充剂1和2分别以1∶500和1∶2000的浓度产生了与含血清的培养基相当的vcd。
图52：此图中的结果表明，在二倍体生长sfm中生长的mrc-5细胞产生的水痘带状疱疹病毒产量与在含血清的培养基中生长的细胞相当。
具体实施方式
定义
除非另外特别说明，否则本文所使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域(例如，在细胞培养、免疫学、分子遗传学和生物化学)的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
为了理解本主题和构造所附的专利权利要求，包含了以下定义。本文所使用的缩写在化学和生物学领域具有其常规含义。
除非上下文清楚地另外指明，本文所使用的单数形式“一个”、“一种”以及“所述”包含复数指示物。因此，例如，对“环糊精”、“脂质”或“脂肪酸”的引用是对一个或多个此类实施方案的引用，并且包含本领域的技术人员已知的等同物。
本文所使用的“治疗”涵盖病症进展的例如抑制、消退或停滞。治疗还涵盖预防或改善病症的任何一种或多种症状。应理解的是，尽管不排除，治疗病症或病状并不要求完全消除所述病症、病状或与其相关的症状。本文所使用的对受试者中疾病进展或疾病并发症的“抑制”意指预防或减少受试者中疾病进展和/或疾病并发症。本文所使用的与病症相关的“症状”包含与病症相关的任何临床或实验室表现，并且不限于受试者可以感觉或观察到的。
如本文所使用的，当指治疗化合物的量时，“有效”是指当以本公开的方式使用时足以产生期望的治疗反应而无与合理的益处/风险比相称的过度不良副作用(例如毒性、刺激性或过敏反应)的化合物的量。
与“包含(including)”、“含有(containing)”或“特征在于(characterizedby)”同义的过渡术语“包括(comprising)”是包含性的或开放性的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由……组成”不包括权利要求中未指定的元素、步骤、或成分。过渡短语“基本上由……组成(consistingessentiallyof)”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤，加上不会实质影响所要求保护的发明的一个或多个基础特征和新颖特征的那些材料或步骤。
除非上下文要求更有限的范围，本文所使用的数值或范围的术语“约”在上下文中意指所列举或要求保护的数值或范围的±10％。
在本文的描述中，如“至少一个”或“一个或多个”的短语可以出现在元素或特征的组合列表之前。术语“和/或”还可以出现在两个或多个元素或特征的列表中。除非另有隐含或明确地与使用其的上下文相矛盾，否则此短语旨在意指单独列出的任何元素或特征，或与其它列举的元素或特征相结合的任何元素或特征。例如，短语“a和b中的至少一个”；“a和b中的一个或多个”；和“a和/或b”分别旨在意指“单独a、单独b或a和b一起”。类似的解释还适用于包含三个或更多项目的列表。例如，短语“a、b和c中的至少一个”；“a、b和c中的一个或多个”；“a、b和/或c”分别旨在意指“单独的a、单独的b、单独的c、a和b一起、a和c一起、b和c一起或a和b和c一起”。另外，在以上和权利要求书中使用术语“基于”旨在意指“至少部分地基于”，从而也允许未列举的特征或要素。
应当理解，在提供参数范围的情况下，本发明还提供所述范围内的所有整数和其十分之一。例如，“0.2-5mg”是对0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg等直到5.0mg(包含5.0mg)的公开。
小分子是质量小于2000道尔顿的化合物。小分子的分子量优选小于1000道尔顿，更优选小于600道尔顿，例如，化合物小于500道尔顿、400道尔顿、300道尔顿、200道尔顿或100道尔顿。
本文所使用的术语“脂质”包含蜡、脂肪、油、脂肪酸、甾醇、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂和其它。在实施例中，脂质是溶于醇但不溶于水的物质，如蜡、脂肪、油、脂肪酸、甾醇、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯或磷脂。在实施例中，脂质是脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂和鞘脂、多聚异戊二烯醇(prenollipid)、糖脂(saccharolipid)或聚酮化合物。在实施例中，脂质包括酮乙基或异戊二烯基团。在实施例中，脂质是蜡酯。在实施例中，脂质是类二十烷酸(例如，前列腺素、血栓素、白三烯、脂氧素类、消退素或eoxin)。在实施例中，脂质是甾醇脂质。在实施例中，甾醇脂质是胆固醇或其衍生物。在实施例中，胆固醇是nat-胆固醇和/或ent-胆固醇。
本文所使用的术语“脂肪酸”是指通常具有长的饱和或不饱和脂肪族尾的羧酸(或有机酸)。在实施例中，脂肪酸具有至少4个碳原子长度的碳-碳键合链。在实施例中，脂肪酸具有至少8个碳原子长度的碳-碳键合链。在实施例中，脂肪酸具有至少12个碳原子长度的碳-碳键合链。在实施例中，脂肪酸具有4到24个碳原子长度的碳-碳键合链。在实施例中，脂肪酸是天然存在的脂肪酸。在实施例中，脂肪酸是人造的(例如，不是天然产生的)。在实施例中，天然存在的脂肪酸具有偶数个碳原子。在实施例中，天然存在的脂肪酸的生物合成涉及具有两个碳原子的乙酸酯。在实施例中，脂肪酸可以处于游离态(未酯化)或呈酯化形式，如甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、酰基-coa(硫代酸酯)键合或其它键合形式的一部分。在实施例中，脂肪酸可以酯化为磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或双磷脂酰甘油形式。在实施例中，本文所公开的脂肪酸或脂肪酸衍生物是游离脂肪酸、酯(例如，甲基、乙基、丙基等)、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯(例如，甘油酯)或脂肪酸的醛、酰胺或磷脂版。“饱和脂肪酸”不含有任何双键或沿链的其它官能团。术语“饱和的”是指氢，因为所有碳(除羧酸[-cooh]基团之外)都含有尽可能多的氢。换言之，ω末端含有3个氢(ch3-)，链中的每个碳均含有2个氢(-ch2-)。在“不饱和脂肪酸”中，一个或多个烯烃官能团沿链存在，每个烯烃都用双键“-ch＝ch-”部分取代链中单键“-ch2-ch2-”部分(即，与另一个碳双键合的碳)。链中与双键合的任一侧键合的两个相邻碳原子可以以顺式或反式构型出现。脂肪酸的非限制性实例的表格如下：
环糊精(有时称为大环糊精)是由在环中键合在一起的糖分子组成的化合物(环状寡糖)。在实施例中，环糊精包括5个或更多个1-4键合的α-d-吡喃葡萄糖苷单元[例如，α(1-4)键合]。在实施例中，环糊精是具有通过α(1-4)键合连接的至少五个吡喃葡萄糖单元的环麦芽寡糖(cyclomalto-oligosaccharide)。在实施例中，环糊精是在外表面上具有羟基并且在中心具有空隙的环状寡糖。在实施例中，环糊精通过具有特定体积的中空内部或孔(例如，腔)的刚性的、截短的圆锥形分子结构表征。环糊精能够通过将整个分子或其一部分吸收到其中心(例如，腔)中而与多种疏水性分子形成复合物。在实施例中，形成的复合物的稳定性取决于客体分子与环糊精腔的拟合程度。环糊精的非限制性实例包含α-、β-或γ-环糊精，其中α-环糊精具有六个葡萄糖残基；β-环糊精具有七个葡萄糖残基，并且β-环糊精具有八个葡萄糖残基。环糊精包含环糊精衍生物(例如，α-、β-和γ-环糊精的衍生物)，或一种或多种环糊精和/或环糊精衍生物的混合物。常见的环糊精衍生物是通过烷基化(例如，甲基-和乙基-β-环糊精)或羟基的羟烷基化(例如，α-、β-和γ-环糊精的羟丙基和羟乙基衍生物)或通过取代含糖的伯羟基(例如，葡糖基和麦芽糖基-β-环糊精)而形成。
在实施例中，环糊精包括6-8个吡喃葡萄糖苷单元，并且可以在拓扑学上表示为环形体，其中环形体的较大和较小的开口分别暴露于溶剂仲羟基和伯羟基。在实施例中，环形体的内部不是疏水的，但是比水性环境亲水性低得多，因此能够容纳其它疏水性分子。相反，外部具有足够的亲水性以赋予环糊精(或其复合物)在水溶液中的可溶性。
本文所使用的术语“单不饱和脂肪酸”是指在链中仅包括一个烯径基团(碳-碳双键)的脂肪酸。本文所使用的术语“多不饱和脂肪酸”和“pufa”是指包括至少两个烯径基团(碳-碳双键)的脂肪酸。
本文所使用的术语“长链多不饱和脂肪酸”和“lc-pufa”是指包括在其碳链中的至少20个碳原子和至少两个碳-碳双键的脂肪酸，因此包含vlc-pufa。本文所使用的术语“超长链多不饱和脂肪酸”和“vlc-pufa”是指包括在其碳链中的至少22个碳原子和至少两个或三个碳-碳双键的脂肪酸。通常，脂肪酸的碳链中的碳原子数是指非支链碳链。如果碳链为支链，则碳原子数不包含侧基中的那些碳原子数。
在实施例中，脂肪酸是在来自脂肪酸的甲基末端的第三碳-碳键中具有去饱和作用(碳-碳双键)的ω-3脂肪酸。在实施例中，脂肪酸是在来自脂肪酸的甲基末端的第六碳-碳键中具有去饱和作用(碳-碳双键)的ω-6脂肪酸。在实施例中，脂肪酸是在来自脂肪酸的甲基末端的第九碳-碳键中具有去饱和作用(碳-碳双键)的ω-9脂肪酸。
本文所使用的术语“异源的”当相对于细胞使用时，是指通常与细胞不相关的材料(例如，蛋白质、核酸、蛋白或蛋白核酸复合物、病毒等)。出于清楚的目的，天然感染细胞的病毒将被视为与该细胞“异源”，因为在细胞的天然状态下，病毒不是通常与细胞相关的组分。因此，引入细胞中的表达载体也将被视为是“异源的”。
术语“疾病”是指与哺乳动物正常健康的任何偏离，并且包含当出现疾病症状时的状态以及已经发生偏离(例如，感染、基因突变、遗传缺陷等)的病状，但症状尚未显现。在实施例中，本文所公开的方法适合用于例如哺乳动物等脊椎动物类成员的患者，包含但不限于灵长类、啮齿动物、家畜和家养宠物(例如，伴侣动物)。通常，患者将是人类患者。
本文所使用的术语“受试者(subject)”、“患者(patient)”、“个体(individual)”等不旨在是限制性的，并且总体上可以互换。换言之，被描述为“患者”的个体不一定患有给定的疾病，而可能仅在寻求医疗建议。
本文所使用的术语“受试者”包含可能患有所指示的病症的动物界的所有成员。在实施例中，受试者是哺乳动物。在实施例中，受试者是灵长类动物、非灵长类动物或啮齿动物。在实施例中，受试者是人。在实施例中，受试者是研究动物。在实施例中，受试者是工作动物(例如，警察或军犬或马)、服务动物或家养宠物。在实施例中，受试者是狗、猫、马、牛、猪、小鼠、大鼠、骆驼、美洲驼、山羊、兔子、绵羊、仓鼠或豚鼠。在实施例中，受试者是非人类灵长类动物，如例如猴子、黑猩猩、大猩猩、猩猩或长臂猿。
根据上下文，术语“细胞培养补充剂”和“细胞培养补充剂组合物”可以互换使用。
根据上下文，术语“细胞培养基”和“细胞培养基组合物”可以互换使用。
术语“氧化磷酸化”(oxphos)是指在其中细胞使用酶来氧化营养素，以释放用于重新形成atp的能量的代谢途径。这发生在线粒体内。几乎所有有氧生物都进行氧化磷酸化。与可替代发酵过程(如无氧酵解)相比，此途径是释放能量的高效方式。在氧化磷酸化期间，电子在氧化还原反应中从电子供体转移到电子受体(如氧)。这些氧化还原反应释放用于形成atp能量。这些氧化还原反应是由细胞的线粒体的内膜内的一系列蛋白复合物来执行的。这些连接的蛋白质组被称为电子传递链。使用流经此电子传递链的电子释放的能量在跨线粒体内膜的过程中传输质子，这一过程被称为电子传递。
本文所使用的术语“活化”是指在足够的细胞表面部分连接之后以诱导可测量的形态、表型和/或功能改变的细胞状态。在t细胞的上下文中，此类激活可能是已经被充分刺激以诱导细胞增殖的t细胞的状态。t细胞的活化还可以诱导细胞因子的产生和/或分泌，以及细胞表面分子(如受体或粘附分子)的表达的上调或下调、或某些分子的分泌的上调或下调和调节或细胞溶解的因子效应子功能的性能。在其它细胞的上下文中，此术语可以推断特定物理化学过程的上调或下调。
在实施例中，刺激包括由细胞表面部分的连接诱导的主要反应。例如，在受体的上下文中，这种刺激可能需要受体的连接和随后的信号传导事件。在实施例中，培养t细胞包括刺激t细胞。关于t细胞的刺激，这种刺激可以指在实施例中随后诱导信号传导事件(如结合tcr/cd3复合物)的t细胞表面部分的连接。在实施例中，刺激事件可以激活细胞并上调或下调细胞表面分子(如受体或粘附分子)的表达，或上调或下调分子的分泌，如下调肿瘤生长因子β(tgf-β)或上调il-2、ifn-γ等。在实施例中，即使不存在直接信号传导事件，细胞表面部分的连接也可能导致细胞骨架结构的重组或细胞表面部分的聚结，每个表面部分都可以用来增强、修饰或改变随后的细胞应答。
本文所使用的术语“配体”或“刺激剂”是指与一个或多个限定的细胞群体(例如，t细胞亚群的成员)结合并诱导细胞应答的分子。药剂可以结合靶细胞群体上存在的任何细胞表面部分，如受体、抗原决定簇或其它结合位点。药剂可以是蛋白质、肽、抗体及其抗体片段、融合蛋白、合成分子、有机分子(例如，小分子)等。在实施例中，在t细胞刺激的上下文中，抗体用作这种药剂的原型实例。
用于本发明方法的抗体可以是任何种类、类别或亚型的，只要此类抗体可以与感兴趣的靶标(例如，cd3、tcr或cd28)适当地反应。
因此，用于本发明的“抗体”包含：
(a)免疫球蛋白的各种类别或亚类中的任何一种(例如，衍生自任何动物的igg、iga、igm、igd或ige，例如，常规使用的动物中的任何动物，例如，绵羊、兔子、山羊、小鼠、骆驼或蛋黄)，
(b)单克隆或多克隆抗体，
(c)完整的抗体或单克隆或多克隆抗体片段，所述片段是含有抗体结合区的那些片段，例如，不含fc部分(例如，fab、fab′、f(ab′)2、scfv、vhh或其它单域抗体)的片段，即通过连接完整抗体中的重链组分的二硫键的还原裂解而获得的所谓的“半分子”片段，fv可以定义为含有轻链的可变区和重链的可变区并表达为两条链的片段；
(d)通过重组dna或其它合成技术产生或修饰的抗体，其包含单克隆抗体、抗体片段、“人源化抗体”、嵌合抗体或合成制备或改变的抗体样结构。
还包含抗体的功能性衍生物或“等同物”，例如，单链抗体、cdr-移植的抗体等。单链抗体(sca)可以定义为一种含有轻链的可变区和重链的可变区并由合适的多肽连接剂连接成融合的单链分子的基因工程化分子。
抗体片段以及合成的和衍生的抗体的制备方法在本领域中是众所周知的，并且在文献中有广泛的描述，在此不再赘述。
本文所使用的术语“分化”是指细胞生命周期发育的阶段。t细胞来源于骨髓中的造血干细胞，并生成大量未成熟胸腺细胞。胸腺细胞(或t细胞)从双阴性细胞发育为双阳性胸腺细胞(cd4 cd8 )，最后成熟为单阳性胸腺细胞(cd4 cd8-或cd4-cd8 )。在t细胞分化期间，原初t细胞变成通过克隆扩充增殖并分化为记忆t细胞和效应t细胞的母细胞。辅助t细胞(th细胞)的许多亚群在t细胞分化期间产生，并为免疫系统执行不同的功能。在一些实施例中，可以通过标志物的存在或不存在来评估t细胞的分化阶段，所述标志物包含但不限于cd3、cd4、cd5、cd8、cd11c、cd14、cd19、cd20、cd25、cd27、cd33、cd34、cd45、cd45ra、cd45rb、cd56、cd62l、cd123、cd127、cd278、cd335、cd11a、cd45ro、cd57、cd58、cd69、cd95、cd103、cd161、ccr7以及转录因子foxp3、rorγ、t-bet、c-rel、gata3等。
本文所使用的术语“荧光活化细胞分选(facs)”是指专门类型的流式细胞术。facs提供了一种用于基于每个细胞的特定光散射和荧光特性按一次一个细胞将生物细胞的异质混合物分选到两个或多个容器中的方法。facs提供了来自单个细胞的荧光信号的快速、客观和定量记录，以及特定感兴趣的细胞的物理分离。
本文所使用的术语“增殖”是指通过产生新细胞而生长或繁殖。
本文所使用的术语“无血清培养基”是指确实含有血清的细胞培养基。“低血清培养基”是指具有低百分比血清补充剂(0.5-2％血清)的细胞培养基。
本文所使用的“共刺激信号”是指与如tcr/cd3连接等初级信号组合导致t细胞增殖和/或活化和/或极化的信号。
本文所使用的“分离”包含从另一种组分中基本上纯化出一种组分的任何方式(例如，通过过滤、亲和力、浮力密度或磁性吸引力)。
本文所使用的术语“cd8 t细胞”是指在其表面上呈递共受体cd8的t细胞。cd8是一种作为t细胞受体(tcr)的共受体的可以识别特异性抗原的跨膜糖蛋白。与tcr类似，cd8与主要的组织相容性复合体i(mhci)分子结合。在实施例中，cd8 t细胞是细胞毒性cd8 t细胞(也称为细胞毒性t淋巴细胞、t-杀伤细胞、细胞溶解t细胞或杀伤t细胞)。在实施例中，cd8 t细胞是调节性cd8 t细胞，也称为cd8 t细胞抑制剂。
本文所使用的术语“cd4 t细胞”是指在其表面上呈递共受体cd4的t细胞。cd4是一种作为t细胞受体(tcr)的共受体的可以识别特异性抗原的跨膜糖蛋白。在实施例中，cd4 t细胞是t辅助细胞。t辅助细胞(th细胞)在免疫过程中协助其它白细胞，包含使b细胞成熟为浆细胞和记忆b细胞，以及细胞毒性t细胞和巨噬细胞的活化。当辅助t细胞由mhc类ii分子呈递抗原肽时，所述辅助t细胞被活化，在抗原呈递细胞(apc)的表面上表达抗原肽。一旦活化，它们就会快速分开并分泌称为细胞因子(调节或协助活化的免疫应答)的小蛋白。这些细胞可以分化为几种亚型之一，其包含分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答的th1、th2、th3、th17、th9或tfh。来自apc的信号引导t细胞进入特定亚型。在实施例中，cd4 t细胞是调节性t细胞。
本文包含用于有效生成调节性t细胞(或“t调节性细胞”或“treg”)的方法，以及这些方法在生成可以应用于例如免疫疗法的t细胞群体中的使用。treg细胞可以通过标志物表征，如cd4 、cd25 、foxp3 、cd127neg/low。在实施例中，使用本文所提供的组合物和方法扩充的treg细胞是cd4 、cd25 、foxp3-。用于生成foxp3-调节性t细胞的组合物和方法的非限制性实例在aarvak等人的美国专利第9,119,807号中提出。
不受任何科学理论的束缚，天然存在的调节性t(treg)细胞会负调节其它t细胞(包含效应t细胞)以及先天免疫系统细胞的活化，并且可以用于针对自身免疫疾病的免疫疗法并提供移植耐受性。已经描述了各种treg细胞群体，并且其包含天然存在的cd4 cd25 foxp3 细胞和诱导的分别分泌il-10和tgf-β的tr1和th3细胞。
treg细胞通过效应t细胞应答的持续抑制来表征。可以在例如脾脏或淋巴结或循环中发现传统或常规的treg细胞。treg被证明在小鼠模型中对预防gvhd和自身免疫高度有效。treg在移植、糖尿病治疗和其它适应症中的过继转移的临床试验正在进行中。treg在外周血中的相对频率为总淋巴细胞的约1-2％，这意味着对于大多数临床应用，在过继转移之前，需要对treg进行体外扩充。在体外扩充期间产生足够的treg一直是将treg疗法应用于人类的主要挑战。
t辅助17细胞(或“th17细胞”或“th17辅助细胞”)是调节宿主防御的cd4 t辅助细胞的炎性亚群，并且涉及组织炎症和各种自身免疫疾病。已经在各种人类肿瘤中发现了th17细胞，但是它们在癌症免疫中的功能尚不清楚。当过继转移到荷瘤小鼠中时，已经发现th17细胞在根除黑色素瘤方面比th1或非极化(th0)t细胞更有效(muranski等人，《血液(blood)》2008)。th17细胞与th1和th2谱系在发育上不同。th17细胞是响应于il-1r1和il-23r信号传导并且产生细胞因子il-17a、il-17f、il-17af、il-21、il-22、il-26(人类)、gm-csf、mip-3α和tnfα的cd4 细胞。th17细胞的表型是有争议的，但目前定义为cd3 、cd4 、ccr4 、ccr6 或cd3 、cd4 、ccr6 、cxcr3 。使用th17细胞进行过继细胞转移的一个障碍一直是鉴定可以扩充th17细胞亚群的稳健培养条件。
本文包含用于生成t细胞亚型的组合物和方法。可以使用本发明的组合物和方法产生的一种t细胞亚型是th17细胞。
t辅助9细胞(或“th9细胞”或“th9辅助细胞”)是调节宿主防御的cd4 t辅助细胞的炎性亚群，并且涉及过敏症、炎症和各种自身免疫疾病。通过分泌特征性细胞因子il-9来鉴定th9细胞。尽管th9细胞与th2细胞有一些相同的功能性作用，包含促进过敏性炎症和驱虫寄生虫免疫，但th9细胞还可以在通常被表征为依赖th1或th17细胞的应答中促进自身免疫。th9细胞在含有il-4和转化生长因子β(tgfβ)的细胞因子环境下分化，这诱导了il-9的表达所需的转录网络。th9亚群由其产生大量特征性细胞因子il-9的能力定义。th9细胞发育所需的转录因子包含信号传导子和转录激活因子-6(stat6)、干扰素调节因子4(irf4)，b-细胞活化转录因子样(batf)、gata3、pu.1和smads。th9细胞表达高水平的il-25受体(il17rb)，这是将th9细胞与其它t辅助亚群区分开的潜在表面标志物。th9细胞介导的免疫应答有助于对肠道寄生虫感染的保护性免疫和抗肿瘤免疫。
本文提供用于生成t细胞亚型的组合物和方法。可以使用本发明的组合物和方法产生的一种t细胞亚型的非限制性实例是th9细胞。
记忆t细胞或经历过抗原处理的细胞之前经历过遇到抗原。这些t细胞寿命长，可以识别抗原，并且可以快速、强烈地影响对它们之前暴露过的抗原的免疫反应。记忆t细胞可以涵盖：干记忆细胞(tscm)、中央记忆细胞(tcm)、效应记忆(tem-)。tscm细胞具有表型cd45ro-、ccr7 、cd45ra 、cd62l (l-选择素)、cd27 、cd28 和il-7rα ，但它们也表达大量的il-2rβ、cxcr3和lfa-1。tcm细胞表达l-选择素和ccr7并且分泌il-2。tem细胞不表达l-选择素或ccr7，但会产生效应细胞因子，如ifn-γ和il-4。
本文包含用于扩充t细胞群体的方法和组合物。
本文所使用的“嵌合抗原受体”或“car”或“cars”是指将抗原特异性移植到细胞(例如，t细胞，如原初t细胞、中央记忆t细胞、效应记忆t细胞或其任何组合)的工程化受体。car也被称为人造t细胞受体、嵌合t细胞受体或嵌合免疫受体。在实施例中，car包括一个或多个抗原特异性靶向结构域、细胞外结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和细胞内信号传导结构域。在实施例中，如果car靶向两种不同的抗原，那么抗原特异性靶向结构域可以串联布置。在实施例中，如果car靶向两种不同的抗原，那么抗原特异性靶向结构域可以串联布置并通过接头序列分离。
car是将任意特异性移植到免疫效应细胞(t细胞)上的工程化受体。这些受体用于使用逆转录病毒载体促进其编码序列的转移来将单克隆抗体的特异性移植到t细胞上。受体之所以称为嵌合体，是因为它们由不同来源的部分构成。car可以通过过继性细胞转移用作治疗癌症。将t细胞从患者中去除并进行修饰，以便它们表达对患者的特定癌症具有特异性的受体。将识别并杀死癌细胞的t细胞重新引入到患者体内。在实施例中，源自患者以外的供体的t细胞的修饰可以用于治疗患者。
使用表达嵌合抗原受体的t细胞的过继转移，可以使car-修饰的t细胞工程化，以靶向任何与肿瘤相关的抗原。在收集患者的t细胞之后，使细胞基因工程化，以表达专门针对患者的肿瘤细胞上的抗原的car，然后再注入患者体内。
一种用于癌症免疫疗法的用于使cart细胞工程化的方法是使用将转基因整合到宿主细胞基因组中的病毒载体，如逆转录病毒、慢病毒或转座子。可替代地，可以使用非整合载体，如质粒或mrna，但是这些类型的游离dna/rna在重复细胞分裂后可能丢失。因此，工程化cart细胞可能最终会失去其car表达。在另一种方法中，使用在t细胞中稳定维持而无需整合到其基因组中的载体。已经发现此策略能够长期转基因表达而没有插入突变或遗传毒性的风险。
意图是，本说明书中给出的每个最大数值限制包含每个较低的数值限制，如同这种较低的数值限制在本文中明确写出一样。整个说明书中给出的每一小数值限度将包含每一较高数值限度，就像这样的较高数值限度在此明确写出。整个说明书中给出的每一数值范围将包含落在这样的较宽数值范围内的每一较窄数值范围，就像这样的较窄数值范围在此明确写出。
培养基和培养基补充剂
一方面，本文提供了包含环糊精和至少一种脂质(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20种脂质)的细胞培养基(例如，用于t细胞)。在实施例中，细胞培养基包含(1)环糊精和(2)至少2种脂质、至少3种脂质、至少4种脂质、至少5种脂质、至少6种脂质、至少7种脂质、至少8种脂质、至少9种脂质、至少10种脂质、至少15种脂质或至少20种脂质(例如，约3种到约20种、约4种到约20种、约5种到约20种、约6种到约20种、约7种到约20种、约3种到约15种、约3种到约12种、约3种到约10种、约3种约8种、约5种到约20种、约5种到约15种、约5种到约12种、约5种到约9种等脂肪酸)。)。另一方面，细胞培养基包含环糊精和至少一种脂质(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20种脂质)和/或2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)。
一方面，本文提供了用于细胞(例如，用于t细胞)的包含环糊精、至少一种脂质(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20种脂质)和/或2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)的细胞培养基补充剂。在实施例中，细胞培养基补充剂包含(1)环糊精和(2)至少2种脂质、至少3种脂质、至少4种脂质、至少5种脂质、至少6种脂质、至少7种脂质、至少8种脂质、至少9种脂质、至少10种脂质、至少15种脂质或至少20种脂质(例如，约3到约20、约4到约20、约5到约20、约6到约20、约7到约20、约3到约15、约3到约12、约3到约10、约3的约8、约5到约20、约5到约15、约5到约12、约5到约9等脂肪酸)和/或2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)。
在实施例中，至少一种脂质(1)或(2)选自由以下组成的群组：胆固醇、脂肪酸、脂肪酸酯、磷脂和/或甘油脂。在实施例中，所述至少一种脂质是胆固醇。在实施例中，所述至少一种脂质是脂肪酸。在实施例中，所述至少一种脂质是脂肪酸酯。在实施例中，所述至少一种脂质是磷脂。在实施例中，所述至少一种脂质是甘油脂。在一些实施例中，至少一种、两种或更多种脂质选自由以下组成的群组：胆固醇、脂肪酸、脂肪酸酯、磷脂和/或甘油脂。
在实施例中，所述脂肪酸是饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是单不饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是多不饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是单不饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是多不饱和脂肪酸。在一些实施例中，脂肪酸是选自由以下组成的群组中的一种或多种脂肪酸类型：(1)饱和脂肪酸，(2)单不饱和脂肪酸，和(1)多不饱和脂肪酸，以及这些脂肪酸的组合(例如，两种多不饱和脂肪酸、三种单不饱和脂肪酸和一种饱和脂肪酸)。
在实施例中，脂肪酸是ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸或ω9脂肪酸，或ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸或ω-9脂肪酸中的一种或多种(例如，两种或多种或三种)的组合。在实施例中，所述脂肪酸是长链多不饱和脂肪酸(lc-pufa)。在实施例中，所述脂肪酸是饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是单不饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是多不饱和脂肪酸。
在一些实施例中，培养基或补充剂包括亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇、甲基化环糊精。在其它实施例中，培养基或补充剂包括：(i)亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇、甲基化环糊精和/或(ii)2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)。
在一些实施例中，细胞培养基还包含选自由以下组成的群组中的一种或多种脂肪酸：(1)亚油酸、(2)亚麻酸、(3)花生四烯酸、(4)肉豆蔻酸、(5)油酸、(6)棕榈酸、(7)棕榈油酸、(8)硬脂酸、(9)油酸和(10)棕榈酸。在具体实施例中，细胞培养基还包含选自由以下组成的群组中的一种或多种脂肪酸：(1)亚油酸和/或(2)亚麻酸。在一些实施例中，所述亚麻酸是α-亚麻酸、γ-亚麻酸和/或α-亚麻酸和γ-亚麻酸。在一些实施例中，所述亚麻酸是α-亚麻酸。在实施例中，所述亚麻酸是γ-亚麻酸。在实施例中，所述亚麻酸是α-亚麻酸和γ-亚麻酸。
在实施例中，细胞培养基进一步包含花生四烯酸。在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含花生四烯酸。
在实施例中，细胞培养基进一步包含肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和/或硬脂酸。在实施例中，细胞培养基进一步包含肉豆蔻酸。在实施例中，细胞培养基进一步包含油酸。在实施例中，细胞培养基进一步包含棕榈酸。在实施例中，细胞培养基进一步包含棕榈油酸。在实施例中，细胞培养基进一步包含硬脂酸。
在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和/或硬脂酸。在实施例中，细胞培养补充剂进一步包含肉豆蔻酸。在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含油酸。在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含棕榈酸。在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含棕榈油酸。在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含硬脂酸。
在实施例中，至少一种脂质是(a)亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸或硬脂酸中的任何一种；(b)亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸中的任何2种、3种、4种、5种、6种或7种；(c)亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸的混合物；(d)饱和脂肪酸，并且所述饱和脂肪酸是丁酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸或蜡酸；(e)单不饱和脂肪酸，其中所述单不饱和脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸或神经酸；(f)多不饱和脂肪酸，并且所述多不饱和脂肪酸是十六碳三烯酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、米德酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十一碳五烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳四烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳五烯酸或二十四碳六烯酸；(g)ω-3脂肪酸，并且ω-3脂肪酸为十六碳三烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸，二十一碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳六烯酸；(h)ω-6脂肪酸，并且ω-6脂肪酸是亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十四碳四烯酸或二十四碳五烯酸；或(i)ω-9脂肪酸，并且ω-9脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸或米德酸。在实施例中，至少一种脂质是亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸或硬脂酸中的任何一种。在实施例中，至少一种脂质是亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸中的2种、3种、4种、5种、6种或7种。在实施例中，至少一种脂质是亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸。在实施例中，至少一种脂质是饱和脂肪酸，并且所述饱和脂肪酸为丁酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸或蜡酸。在实施例中，至少一种脂质是单不饱和脂肪酸，并且所述单不饱和脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸或神经酸。在实施例中，至少一种脂质是多不饱和脂肪酸，并且所述多不饱和脂肪酸是十六碳三烯酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、米德酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十一碳五烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳四烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳五烯酸或二十四碳六烯酸。在实施例中，至少一种脂质是ω-3脂肪酸，并且ω-3脂肪酸为十六碳三烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸，二十一碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸或二十四碳六烯酸。在实施例中，至少一种脂质是ω-6脂肪酸，并且ω-6脂肪酸为亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十四碳四烯酸或二十四碳五烯酸。在实施例中，至少一种脂质是ω-9脂肪酸，并且ω-9脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸或米德酸。
在实施例中，所述至少一种脂质是胆固醇。在实施例中，所述胆固醇是合成性胆固醇。在实施例中，所述胆固醇是游离胆固醇。
在一些实施例中，所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精和/或γ-环糊精。在实施例中，所述环糊精是α-环糊精。在实施例中，所述环糊精是β-环糊精。在实施例中，所述环糊精是γ-环糊精。在实施例中，所述环糊精是甲基化的。在实施例中，所述环糊精是甲基-β-环糊精。
在实施例中，所述环糊精是以下中的一种或多种：2-羟丙基-β-环糊精、磺基丁基醚-β-环糊精、2-羟丙基-γ-环糊精、2，6-二甲基-α-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、羟乙基-β-环糊精、β-环糊精多硫酸酯、三甲基β-环糊精和/或γ-环糊精多硫酸酯。在实施例中，所述环糊精是2-羟丙基-β-环糊精、磺基丁基醚-β-环糊精、2-羟丙基-γ-环糊精、2，6-二甲基-α-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、羟乙基-β-环糊精、β-环糊精多硫酸酯、三甲基β-环糊精和/或γ-环糊精多硫酸酯。
在实施例中，组合物包含多种不同的环糊精，其中多种环糊精包含至少两种环糊精(例如，约或至少约2、3、4、5、6、7、8、9或10种环糊精)。在实施例中，组合物包含不同的环糊精，其范围为约两种到约十种(例如，约两种到约十种、约三种到约十种、约四种到约十种、约五种到约十种、约两种到约八种、约三种到约八种、约四种到约八种、约两种到约十种等)。
在实施例中，多种环糊精包含至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)α-环糊精、至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)β-环糊精和/或至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)γ-环糊精。在实施例中，多种环糊精包含至少2种α-环糊精、至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)β-环糊精和/或至少一种(例如，约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)γ-环糊精。在实施例中，多种环糊精包含至少3种α-环糊精、至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)β-环糊精和/或至少一种(例如，约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)γ-环糊精。在实施例中，多种环糊精包含至少4种α-环糊精、至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)β-环糊精和/或至少一种(例如，约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)γ-环糊精。在实施例中，多种环糊精包含至少5种α-环糊精、至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)β-环糊精和/或至少一种(例如，约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)γ-环糊精。
在实施例中，细胞培养基包含亚油酸、胆固醇和环糊精。在实施例中，细胞培养基补充剂包含亚油酸、胆固醇和环糊精。
在实施例中，组合物或组合中的胆固醇分子的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、98％(例如，约5％到约50％、约5％到约50％、约5％到约50％、约5％到约98％、约5％到约85％、约5％到约75％、约5％到约60％、约10％到约98％、约15％到约95％、约20％到约95％、约40％到约80％、约65％到约99％等)在环糊精分子的环内(例如，其至少一部分在环糊精分子的环内部)。
在实施例中，组合物或组合中的脂肪酸分子的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、98％(例如，约5％到约50％、约5％到约50％、约5％到约50％、约5％到约98％、约5％到约85％、约5％到约75％、约5％到约60％、约10％到约98％、约15％到约95％、约20％到约95％、约40％到约80％、约65％到约99％等)在环糊精分子的环内(例如，其至少一部分在环糊精分子的环内部)。
一方面，本文提供的主题涉及具有限定比率(如环糊精/脂肪酸比率)的调配物。许多因素将决定此类调配物的组分的比率，如环糊精毒性、所使用的一种或多种特定环糊精的脂肪酸“携带能力”、以及结合使用的环糊精/脂肪酸调配物对特定细胞群体的期望影响。另一方面，本文提供的主题涉及具有限定比率(如环糊精/脂肪酸/2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)比率或环糊精/脂质/2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)比率)的调配物。
可以用于描述调配物中一种化合物(或一组化合物)与另一种化合物(或一组化合物)的相对量(即，比率)的公式为x∶x，其中每个x分别为具体命名的一种化合物或一类化合物。例如，每个x可以分别是(1)调配物中存在的环糊精、调配物中存在的具体命名的环糊精或调配物中存在的一类环糊精的总量(tc)；(2)调配物中存在的脂肪酸、调配物中存在的具体命名的脂肪酸或调配物中存在的一类脂肪酸的总量(tfa)；或(3)调配物中存在的胆固醇、调配物中存在的具体命名的胆固醇或调配物中存在的一类胆固醇的总量(tcol)。
任选地，可以用于描述调配物(如细胞培养基或细胞培养补充剂)中一种或多种环糊精和一种或多种脂肪酸的相对量的公式为tc∶tfa，其中tc表示存在的一种或多种环糊精的总量，并且tfa表示存在的一种或多种脂肪酸的总量。可替代地，可以使用公式tfa∶tc。列出此类公式的值的一种方便的方式是使用摩尔量，尤其是摩尔比。在实施例中，tc∶tfa的合适的摩尔比的范围为1∶0.001到1∶0.5(例如，约1∶0.01到约1∶0.4、约1∶0.01到约1∶0.3、约1∶0.01到约1∶0.2、约1∶0.01到约1∶0.15、约1∶0.01到约1∶0.1、约1∶0.05到约1∶0.1、约1∶0.05到约1∶0.08、约1∶0.02到约1∶0.2、约1∶0.02到约1∶0.1、约1∶0.02到约1∶0.08、约1∶0.04到约1∶0.2等)。本文中公开了比率的另外的非限制性实例。
总环糊精(tc)的量可以由单个环糊精或两种或更多种环糊精表示。另外，当存在多于一种环糊精时，这些环糊精的量可以相同或不同。在实施例中，1种环糊精与1种或多种其它环糊精(例如，调配物中存在的所有其它环糊精)的摩尔比可以为例如1∶0.1到1∶10(例如，约1∶0.1到约1∶5、约1∶0.2到约1∶5、约1∶0.3到约1∶5、约1∶0.4到约1∶5、约1∶0.5到约1∶5、约1∶1到约1∶10、约1∶2到约1∶10、约1∶3到约1∶10、约1∶4到约1∶10、约1∶5到约1∶10等)。
在许多实例中，调配物(如细胞培养基或细胞培养补充剂)中将存在多于一种脂肪酸。另外，当本文所提供的调配物中存在多于一种脂肪酸时，这些脂肪酸可以以相同或不同的量存在。表1-3列出了本文所提供的示例性调配物和组分的示例性摩尔比。
在实施例中，本文所提供的调配物中存在的至少一些脂肪酸将以不同的量存在。
在实施例中，细胞培养基和/或细胞培养基补充剂包含环糊精和胆固醇，其中tc∶tcol的摩尔比小于10.5∶1、小于10∶1、小于9.5∶1、小于9∶1、小于8.5∶1、小于8∶1、小于7.5∶1、小于7∶1、小于6.5∶1、小于6∶1、小于5.5∶1、小于5∶1、小于4.5∶1、小于4∶1、小于3.5∶1、小于3∶1、小于2.5∶1、小于2∶1、小于1.5∶1、小于1∶1、小于0.5∶1、小于0.25∶1或小于0.1∶1。因此，tc∶tcol的摩尔比可以为约10.5∶1到约0.1∶1、约8∶1到约0.1∶1、约7∶1到约0.1∶1、约6∶1到约0.1∶1、约5∶1到约0.1∶1、约3∶1到约0.1∶1、约2∶1到约0.1∶1等。
在实施例中，细胞培养基和/或细胞培养基补充剂包含环糊精和至少一种脂肪酸，其中tc∶tfa的摩尔比小于11.5∶1、小于11∶1、小于10.5∶1、小于10∶1、小于9.5∶1、小于9∶1、小于8.5∶1、小于8∶1、小于7.5∶1、小于7∶1、小于6.5∶1、小于6∶1、小于5.5∶1、小于5∶1、小于4.5∶1、小于4∶1、小于3.5∶1、小于3∶1、小于2.5∶1、小于2∶1、小于1.5∶1、小于1∶1、小于0.5∶1、小于0.25∶1或小于0.1∶1。因此，环糊精与至少一种脂肪酸的摩尔比可以为约11.5∶1到约0.1∶1、约10.5∶1到约0.1∶1、约8∶1到约0.1∶1、约7∶1到约0.1∶1、约6∶1到约0.1∶1、约5∶1到约0.1∶1、约3∶1到约0.1∶1、约2∶1到约0.1∶1等。
在实施例中，细胞培养基和/或细胞培养基补充剂包含环糊精、胆固醇和至少一种脂肪酸，其中(1)tc∶(2)tcol和tfa(例如，tcol和tfa的摩尔值的和)的摩尔比小于7.5∶1、小于7∶1、小于6.5∶1、小于6∶1、小于5.5∶1、小于5∶1、小于4.5∶1、小于4∶1、小于3.5∶1、小于3∶1、小于2.5∶1、小于2∶1、小于1.5∶1、小于1∶1、小于0.5∶1、小于0.25∶1或小于0.1∶1。因此，(1)tc∶(2)tcol和tfa的摩尔比可以为约7∶1到约0.1∶1、约6∶1到约0.1∶1、约5∶1到约0.1∶1、约3∶1到约0.1∶1、约2∶1到约0.1∶1等。
在实施例中，基于摩尔的tc∶tcol的比率为10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15和90∶10(例如，约10∶90到约90∶10、约20∶80到约90∶10、约30∶70到约90∶10、约40∶60到约90∶10、约10∶90到约80∶20、约10∶90到约70∶30、约10∶90到约60∶40、约20∶80到约80∶20、约30∶70到约70∶30、约40∶60到约60∶40等)。
在实施例中，基于摩尔的tfa∶tc的比率为10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15和90∶10(例如，约10∶90到约90∶10、约20∶80到约90∶10、约30∶70到约90∶10、约40∶60到约90∶10、约10∶90到约80∶20、约10∶90到约70∶30、约10∶90到约60∶40、约20∶80到约80∶20、约30∶70到约70∶30、约40∶60到约60∶40等)。
在实施例中，基于摩尔的tfa∶tcol的比率为10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15和90∶10(例如，约10∶90到约90∶10、约20∶80到约90∶10、约30∶70到约90∶10、约40∶60到约90∶10、约10∶90到约80∶20、约10∶90到约70∶30、约10∶90到约60∶40、约20∶80到约80∶20、约30∶70到约70∶30、约40∶60到约60∶40等)。
在实施例中，基于摩尔的总多不饱和脂肪酸分子对其它脂肪酸分子的比率为10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15和90∶10(例如，约10∶90到约90∶10、约20∶80到约90∶10、约30∶70到约90∶10、约40∶60到约90∶10、约10∶90到约80∶20、约10∶90到约70∶30、约10∶90到约60∶40、约20∶80到约80∶20、约30∶70到约70∶30、约40∶60到约60∶40等)。
在实施例中，基于摩尔的总ω-3、ω-6和/或ω-9多不饱和脂肪酸分子对其它脂肪酸分子的比率为10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15和90∶10(例如，约10∶90到约90∶10、约20∶80到约90∶10、约30∶70到约90∶10、约40∶60到约90∶10、约10∶90到约80∶20、约10∶90到约70∶30、约10∶90到约60∶40、约20∶80到约80∶20、约30∶70到约70∶30、约40∶60到约60∶40等)。
在一些实施例中，将具有免疫活性的多种疏水性化合物(包含前列腺素、皮质类固醇、白三烯、脂氧素、保护素和消退素)掺入脂质补充剂中。同样，脂质药物，如依托莫司(etomoxir)和他汀。依托莫司是一种显示具有与不可逆的o-肉毒碱棕榈酰转移酶-1(cpt-1)抑制和pparα活化相关的活性的化学实体。可以存在于本发明的方法中并用于本发明的方法的另外的化合物是具有cpt-1抑制和/或pparα活化活性的化学实体。
在一些实施例中，寡核苷酸上样到环糊精中。对于环糊精在药物递送中的使用的非限制性综述，请参见chordiya和senthilkumaran(2012)《研究与评论：药学与药学科学杂志(researchandreviews：journalofpharmacyandpharmaceuticalsciences)》1(1)：19-29(尤其是表2，因为它描述了使用不同的环糊精(cycodextrin)作为载体)，其全部内容通过引用并入本文。
在实施例中，细胞培养基进一步包含前列腺素、皮质类固醇、白三烯、脂氧素、保护素、消退素、寡核苷酸或疏水性药物化合物。在实施例中，细胞培养基进一步包含前列腺素。在实施例中，细胞培养基进一步包含皮质类固醇。在实施例中，细胞培养基进一步包含白三烯。在实施例中，细胞培养基进一步包含脂氧素。在实施例中，细胞培养基进一步包含保护素。在实施例中，细胞培养基进一步包含消退素。在实施例中，细胞培养基进一步包含寡核苷酸。在实施例中，细胞培养基进一步包含疏水性药物化合物。
在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含前列腺素、皮质类固醇、白三烯、脂氧素、保护素、消退素、寡核苷酸或疏水性药物化合物。在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含前列腺素。在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含皮质类固醇。在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含白三烯。在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含脂氧素。在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含保护素。在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含消退素。在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含寡核苷酸。在实施例中，细胞培养基补充剂进一步包含疏水性药物化合物。
在实施例中，疏水性药物化合物是依托莫司或他汀。在实施例中，疏水性药物化合物是依托莫司。在实施例中，疏水性药物化合物是他汀。
在实施例中，细胞培养基包括2-dg。在实施例中，细胞培养基补充剂包括2-dg。
在实施方案中，细胞培养基包含的2-dg的水平为约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.5mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。在实施例中，细胞培养基包含的2-dg的水平为约0.1mm到约10mm、约0.1mm到约5mm、约0.1mm到约4mm、约0.1mm到约3mm、约0.1mm到约2mm、约0.1mm到约1mm、约0.25mm到约5mm、约0.25mm到约5mm、约0.25mm到约4mm、约0.25mm到约3mm、约0.25mm到约2mm或约0.25mm到约1mm。在实施例中，2-dg的水平小于5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm或0.25mm。在实施例中，2-dg的水平为约5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm或0.25mm。
在实施例中，细胞培养基包含的环糊精的水平为约200μm、150μm、140μm、130μm、120μm、110μm、100μm、90μm、80μm、70μm、60μm、50μm、40μm、30μm、20μm、10μm、5μm、1μm、0.5μm、0.25μm、0.1μm、0.05μm、0.025μm、0.001μm，小于200μm、小于150μm、小于140μm、小于130μm、小于120μm、小于110μm、小于100μm、小于90μm、小于80μm、小于70μm、小于60μm、小于50μm、小于40μm、小于30μm、小于20μm、小于10μm、小于5μm、小于1μm、小于0.5μm、小于0.25μm、小于0.1μm、小于0.05μm、小于0.025μm或小于0.01μm。
在实施例中，细胞培养基包含的环糊精的水平为约50μm到约200μm、约55μm到约195μm、约50μm到约190μm、约65μm到约185μm、约70μm到约180μm、约75μm到约175μm、约80μm到约170μm、约85μm到约165μm、约90μm到约160μm、约90μm到约155μm，约95μm到约150μm、约100μm到约145μm、约105μm到约140μm、约110μm到约135μm、约115μm到约130μm或约120μm到约125μm。
在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂质的水平为至少约5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂质的水平为约5μm、10μm、15μm到约20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂质的水平为约5μm到约50μm、约5μm到约40μm、约5μm到约30μm、约10μm到约30μm、约11μm到约29μm、约12μm到约28μm、约13μm到约27μm、约14μm到约26μm、约15μm到约25μm、约16μm到约24μm、约17μm到约23μm、约18μm到约22μm、约19μm到约21μm。在实施例中，细胞培养基中的至少一种脂质的水平为10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm。
在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂肪酸的水平为至少约5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂肪酸的水平为约5μm、10μm、15μm到约20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂肪酸的水平为约5μm到约50μm、约5μm到约40μm、约5μm到约30μm、约10μm到约30μm、约11μm到约29μm、约12μm到约28μm、约13μm到约27μm、约14μm到约26μm、约15μm到约25μm、约16μm到约24μm、约17μm到约23μm、约18μm到约22μm、约19μm到约21μm。在一些实施例中，细胞培养基中的至少一种脂肪酸的水平为10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm。
在实施例中，细胞培养基包含的至少一种多不饱和脂肪酸(例如，ω-6脂肪酸，如花生四烯酸、亚油酸和/或γ-亚麻酸)的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种多不饱和脂肪酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种多不饱和脂肪酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的花生四烯酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的花生四烯酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的花生四烯酸的水平为约0.05μm到约50μm、约5μm到约10μm、约0.5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的亚油酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的亚油酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的亚油酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的亚麻酸(例如，α-亚麻酸、γ-亚麻酸或其组合)的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的亚麻酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的亚麻酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的多不饱和脂肪酸之外的至少一种脂肪酸(例如，饱和脂肪酸，如肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸和/或单不饱和脂肪酸，如棕榈油酸或油酸)的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的一种或多种脂肪酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的一种或多种脂肪酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的肉豆蔻酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的肉豆蔻酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的肉豆蔻酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的棕榈酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的棕榈酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的棕榈酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的硬脂酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的硬脂酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的硬脂酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的棕榈油酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的棕榈油酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的棕榈油酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的油酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的油酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的油酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的胆固醇的水平为至少约5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的胆固醇的水平为约5μm、10μm或15μm到约20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的胆固醇的水平为约5μm到约50μm、约5μm到约40μm、约5μm到约30μm、约10μm到约30μm、约11μm到约29μm、约12μm到约28μm、约13μm到约27μm、约14μm到约26μm、约15μm到约25μm、约16μm到约24μm、约17μm到约23μm、约18μm到约22μm、约18μm到约21μm、约19μm到约20μm。在实施例中，细胞培养基包含的胆固醇的水平为10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm。
在实施例中，细胞培养基不包含药物化合物。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含药物化合物。
在实施例中，细胞培养基不包含前列地尔(alprostadil)、头孢替安酯hcl(cefotiamhexetilhcl)、贝奈克酯hcl(benexatehcl)、地塞米松(dexamethasone)、碘(iodine)、烟碱(nicotine)、尼美舒利(nimesulide)、硝酸甘油(nitroglycerin)、奥美拉唑(omeprazol)、pge2、吡罗昔康(piroxicam)、噻洛芬酸(tiaprofenicacid)、西沙必利(cisapride)、氢化可的松(hydrocortisone)、鲁康唑(ludomethacin)、伊曲康唑(itraconazole)、丝裂霉素(mitomycin)、17β-雌二醇(estradiol)、氯霉素(chloramphenicol)、伏立康唑(voriconazole)、马来酸齐拉西道(ziprasidouemaleate)、双氯芬酸钠(diclofenacsodium)、依托莫司(etomoxir)或他汀。在实施例中，细胞培养基不包含前列地尔。在实施例中，细胞培养基不包含头孢替安酯hcl。在实施例中，细胞培养基不包含贝奈克酯hcl。在实施例中，细胞培养基不包含地塞米松。在实施例中，细胞培养基不包含碘。在实施例中，细胞培养基不包含烟碱。在实施例中，细胞培养基不包含尼美舒利。在实施例中，细胞培养基不包含硝酸甘油。在实施例中，细胞培养基不包含硝酸甘油。在实施例中，细胞培养基不包含奥美拉唑。在实施例中，细胞培养基不包含pge2。在实施例中，细胞培养基不包含吡罗昔康。在实施例中，细胞培养基不包含噻洛芬酸。在实施例中，细胞培养基不包含西沙必利。在实施例中，细胞培养基不包含氢化可的松。在实施例中，细胞培养基不包含鲁康唑。在实施例中，细胞培养基不包含伊曲康唑。在实施例中，细胞培养基不包含丝裂霉素。在实施例中，细胞培养基不包含17β-雌二醇。在实施例中，细胞培养基不包含氯霉素。在实施例中，细胞培养基不包含伏立康唑。在实施例中，细胞培养基不包含马来酸齐拉西道。在实施例中，细胞培养基不包含双氯芬酸钠。在实施例中，细胞培养基不包含依托莫司。在实施例中，细胞培养基不包含他汀。
在实施例中，细胞培养基补充剂不包含前列地尔、头孢替安酯hcl、贝奈克酯hcl、地塞米松、碘、烟碱、尼美舒利、硝酸甘油、奥美拉唑、pge2、吡罗昔康、噻洛芬酸、西沙必利、氢化可的松、鲁康唑、伊曲康唑、丝裂霉素、17β-雌二醇、氯霉素、伏立康唑、马来酸齐拉西道、双氯芬酸钠、依托莫司或他汀。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含前列地尔。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含头孢替安酯hcl。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含贝奈克酯hcl。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含地塞米松。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含碘。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含烟碱。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含尼美舒利。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含硝酸甘油。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含硝酸甘油。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含奥美拉唑。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含pge2。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含吡罗昔康。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含噻洛芬酸。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含西沙必利。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含氢化可的松。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含鲁康唑。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含伊曲康唑。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含丝裂霉素。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含17β-雌二醇。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含氯霉素。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含伏立康唑。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含马来酸齐拉西道。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含双氯芬酸钠。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含依托莫司。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含他汀。
在实施例中，细胞培养基不包含疏水性药物化合物。在实施例中，细胞培养基补充剂不包含疏水性药物化合物。在实施例中，细胞培养基不包含白蛋白。在实施例中，细胞培养基不包含蛋白质。在实施例中，细胞培养基是无血清细胞培养基。因此，本发明包含无血清、无白蛋白或无蛋白质的组合物(例如，细胞培养基和补充剂)。
在实施例中，细胞培养基包含白蛋白。在实施例中，细胞培养基包含蛋白质。
在实施例中，相比与不包含环糊精和至少一种脂质的细胞培养基组合的t细胞群体中的对应t细胞，t细胞群体包含的t细胞能够具有更大的表型保留、更大的扩充、更大的效力和/或更高的转导效率。
一方面，提供了一种无血清细胞培养基组合物，其包含亚油酸，至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中)其它ω-6脂肪酸、胆固醇和甲基化环糊精。
一方面，提供了一种无血清细胞培养补充剂组合物，其包含亚油酸，至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中)其它ω-6脂肪酸、胆固醇和甲基化环糊精。
在实施例中，细胞培养基中存在的甲基化环糊精的水平为50μm到200μm、55μm到195μm、60μm到190μm、65μm到185μm、70μm到180μm、75μm到175μm、80μm到170μm、85μm到165μm、90μm到160μm、95μm到155μm，95μm到150μm、100μm到145μm、105μm到140μm、110μm到135μm、115μm到130μm或120μm到125μm。
在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂质的水平为至少约5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂质的水平为约5μm、10μm、15μm到约20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂质的水平为约5μm到约50μm、约5μm到约40μm、约5μm到约30μm、约10μm到约30μm、约11μm到约29μm、约12μm到约28μm、约13μm到约27μm、约14μm到约26μm、约15μm到约25μm、约16μm到约24μm、约17μm到约23μm、约18μm到约22μm、约19μm到约21μm。在实施例中，细胞培养基中的至少一种脂质的水平为10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm。
在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂肪酸的水平为至少约5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂肪酸的水平为约5μm、10μm、15μm到约20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂肪酸的水平为约5μm到约50μm、约5μm到约40μm、约5μm到约30μm、约10μm到约30μm、约11μm到约29μm、约12μm到约28μm、约13μm到约27μm、约14μm到约26μm、约15μm到约25μm、约16μm到约24μm、约17μm到约23μm、约18μm到约22μm、约19μm到约21μm。在一些实施例中，细胞培养基中的至少一种脂肪酸的水平为10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm。
在实施例中，细胞培养基包含的至少一种多不饱和脂肪酸(例如，ω-6脂肪酸，如花生四烯酸、亚油酸和/或γ-亚麻酸)的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种多不饱和脂肪酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种多不饱和脂肪酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约1μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的花生四烯酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的花生四烯酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的花生四烯酸的水平为约0.05μm到约50μm、约1μm到约10μm、约0.5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的亚油酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的亚油酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的亚油酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约1μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的亚麻酸(例如，α-亚麻酸、γ-亚麻酸或其组合)的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的亚麻酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的亚麻酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的多不饱和脂肪酸之外的至少一种脂肪酸(例如，饱和脂肪酸，如肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸和/或单不饱和脂肪酸，如棕榈油酸或油酸)的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的一种或多种脂肪酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的一种或多种脂肪酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的肉豆蔻酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的肉豆蔻酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的肉豆蔻酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的棕榈酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的棕榈酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的棕榈酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的硬脂酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的硬脂酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的硬脂酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的棕榈油酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的棕榈油酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的棕榈油酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的油酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的油酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的油酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的胆固醇的水平为至少约5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的胆固醇的水平为约5μm、10μm或15μm到约20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的胆固醇的水平为约5μm到约50μm、约5μm到约40μm、约5μm到约30μm、约10μm到约30μm、约11μm到约29μm、约12μm到约28μm、约13μm到约27μm、约14μm到约26μm、约15μm到约25μm、约16μm到约24μm、约17μm到约23μm、约18μm到约22μm、约18μm到约21μm、约19μm到约20μm。在实施例中，细胞培养基包含的胆固醇的水平为10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm。
在实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是多不饱和ω-6脂肪酸。
在实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十四碳四烯酸或二十四碳五烯酸。在实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是γ-亚麻酸。在实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是二十碳二烯酸。在实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是二高-γ-亚麻酸。在实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是花生四烯酸。在实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是二十二碳二烯酸。在实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是二十二碳四烯酸。在实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是二十二碳五烯酸。在实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是二十四碳四烯酸。在实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是二十四碳五烯酸。
在实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是花生四烯酸。
在实施例中，无血清细胞培养基组合物进一步包含α-亚麻酸。在实施例中，无血清细胞培养补充剂组合物进一步包含α-亚麻酸。
在实施例中，无血清细胞培养基组合物进一步包含肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和/或硬脂酸。在实施例中，无血清细胞培养基组合物进一步包含肉豆蔻酸。在实施例中，无血清细胞培养基组合物进一步包含油酸。在实施例中，无血清细胞培养基组合物进一步包含棕榈酸。在实施例中，无血清细胞培养基组合物进一步包含棕榈油酸。在实施例中，无血清细胞培养基组合物进一步包含硬脂酸。
在实施例中，无血清细胞培养补充剂组合物进一步包含肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和/或硬脂酸。在实施例中，无血清细胞培养补充剂组合物进一步包含肉豆蔻酸。在实施例中，无血清细胞培养补充剂组合物进一步包含油酸。在实施例中，无血清细胞培养补充剂组合物进一步包含棕榈酸。在实施例中，无血清细胞培养补充剂组合物进一步包含棕榈油酸。在实施例中，无血清细胞培养补充剂组合物进一步包含硬脂酸。
在实施例中，无血清细胞培养基组合物包含至少3、4、5、6、7或8种不同的脂肪酸。
在实施例中，无血清细胞培养补充剂组合物包含至少3、4、5、6、7或8种不同的脂肪酸。
在实施例中，无血清细胞培养基组合物包含3、4、5、6、7或8种不同的脂肪酸。
在实施例中，无血清细胞培养补充剂组合物包含3、4、5、6、7或8种不同的脂肪酸。
在实施例中，无血清细胞培养基组合物包含：(a)亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸或硬脂酸中的任何一种；(b)亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸中的2种、3种、4种、5种、6种或7种；(c)亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸；(d)饱和脂肪酸，并且所述饱和脂肪酸是丁酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸或蜡酸；(e)单不饱和脂肪酸，并且所述单不饱和脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸或神经酸；(f)多不饱和脂肪酸，并且所述多不饱和脂肪酸是十六碳三烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、米德酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十一碳五烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳四烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳五烯酸或二十四碳六烯酸；(g)ω-3脂肪酸，并且ω-3脂肪酸为十六碳三烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸，二十一碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳六烯酸；(h)ω-6脂肪酸，并且ω-6脂肪酸是亚油酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十四碳四烯酸或二十四碳五烯酸；或(i)ω-9脂肪酸，并且ω-9脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸或米德酸。
在实施例中，无血清细胞培养补充剂组合物包含：(a)亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸或硬脂酸中的任何一种；(b)亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸中的2种、3种、4种、5种、6种或7种；(c)亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸；(d)饱和脂肪酸，并且所述饱和脂肪酸是丁酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸或蜡酸；(e)单不饱和脂肪酸，并且所述单不饱和脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸或神经酸；(f)多不饱和脂肪酸，并且所述多不饱和脂肪酸是十六碳三烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、米德酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十一碳五烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳四烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳五烯酸或二十四碳六烯酸；(g)ω-3脂肪酸，并且ω-3脂肪酸为十六碳三烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸，二十一碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳六烯酸；(h)ω-6脂肪酸，并且ω-6脂肪酸是亚油酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十四碳四烯酸或二十四碳五烯酸；或(i)ω-9脂肪酸，并且ω-9脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸或米德酸。
在实施例中，所述胆固醇是合成性胆固醇。
在实施例中，所述甲基化环糊精是甲基化α-环糊精、甲基化β-环糊精或甲基化γ-环糊精。在实施例中，所述甲基化环糊精是甲基化α-环糊精。在实施例中，所述甲基化环糊精是甲基化β-环糊精。在实施例中，所述甲基化环糊精是甲基化γ-环糊精。在实施例中，所述甲基化环糊精是甲基-β-环糊精。
在实施例中，无血清细胞培养基组合物进一步包含未甲基化的环糊精。在实施例中，无血清细胞培养补充剂组合物进一步包含未甲基化的环糊精。
在实施例中，甲基化环糊精与tcol的摩尔比小于10.5∶1、小于10∶1、小于9.5∶1、小于9∶1、小于8.5∶1、小于8∶1、小于7.5∶1、小于7∶1、小于6.5∶1、小于6∶1、小于5.5∶1、小于5∶1、小于4.5∶1、小于4∶1、小于3.5∶1、小于3∶1、小于2.5∶1、小于2∶1、小于1.5∶1、小于1∶1、小于0.5∶1、小于0.25∶1或小于0.1∶1。
在实施例中，组合物内的甲基化环糊精与tl的摩尔比小于11.5∶1、小于11∶1、小于10.5∶1、小于10∶1、小于9.5∶1、小于9∶1、小于8.5∶1、小于8∶1、小于7.5∶1、小于7∶1、小于6.5∶1、小于6∶1、小于5.5∶1、小于5∶1、小于4.5∶1、小于4∶1、小于3.5∶1、小于3∶1、小于2.5∶1、小于2∶1、小于1.5∶1、小于1∶1、小于0.5∶1、小于0.25∶1或小于0.1∶1。
在实施例中，无血清细胞培养基包含或不包含白蛋白。在实施例中，无血清细胞培养补充剂包含或不包含白蛋白。因此，本发明包含无血清的培养基和无白蛋白的补充剂。当存在白蛋白时，它可以是重组人血清白蛋白(rhsa)。
在实施例中，细胞培养基补充剂包含白蛋白。在实施例中，细胞培养基补充剂包含蛋白质。
在实施例中，无血清细胞培养基不包含蛋白质。在实施例中，无血清细胞培养补充剂不包含蛋白质。
在一个实施例中，提供了一种细胞培养基补充剂，其包含0.00647mol/l合成性胆固醇、0.0676mol/l甲基-β-环糊精、0.00072mol/l花生四烯酸、0.00508mol/l亚油酸、0.00014mol/l亚麻酸、27.75422mol/l热水和27.75422mol/l冷水。在实施例中，细胞培养基补充剂的有效稀释度为约1∶10到约1∶5000(例如，约1∶10、约1∶20、约1∶30、约1∶40、约1∶50、约1∶60、约1∶70、约1∶80、约1∶90、约1∶100、约1∶150、约1∶200、约1∶250、约1∶300，约1∶350、约1∶400、约1∶450、约1∶455、约1∶460、约1∶465、约1∶470、约1∶475、约1∶480、约1∶485、约1∶490、约1∶495、约1∶500、约1∶505、约1∶510、约1∶515、约1∶520、约1∶525、约1∶530、约1∶535、约1∶540、约1∶545、约1∶550、约1∶555、约1∶560、约1∶565、约1∶570、约1∶575、约1∶580、约1∶585、约1∶590、约1∶595、约1∶600、约1∶650、约1∶700、约1∶750、约1∶800、约1∶850、约1∶900、约1∶950、约1∶1000、约1∶1500、约1∶2000、约1∶2500、约1∶3000、约1∶3500、约1∶4000、约1∶4500、约1∶5000)。在实例中，细胞培养基补充剂的有效稀释度为约1∶250到约1∶750。在实例中，细胞培养基补充剂的有效稀释度为约1∶400到约1∶600。
在一个实施例中，提供了一种细胞培养基补充剂，其包含0.00647mol/l合成性胆固醇、0.0676mol/l甲基-β-环糊精、0.0000657mol/l花生四烯酸、0.00036mol/l亚油酸、0.00036mol/l亚麻酸、0.00044mol/l肉豆蔻酸、0.00035mol/l油酸、0.00039mol/l棕榈酸、0.00039mol/l棕榈油酸、0.00035mol/l硬脂酸、27.75422mol/l热水和27.75422mol/l冷水。在实施例中，细胞培养基补充剂的有效稀释度为约1∶10到约1∶5000(例如，约1∶10、约1∶20、约1∶30、约1∶40、约1∶50、约1∶60、约1∶70、约1∶80、约1∶90、约1∶100、约1∶150、约1∶200、约1∶250、约1∶300，约1∶350、约1∶400、约1∶450、约1∶455、约1∶460、约1∶465、约1∶470、约1∶475、约1∶480、约1∶485、约1∶490、约1∶495、约1∶500、约1∶505、约1∶510、约1∶515、约1∶520、约1∶525、约1∶530、约1∶535、约1∶540、约1∶545、约1∶550、约1∶555、约1∶560、约1∶565、约1∶570、约1∶575、约1∶580、约1∶585、约1∶590、约1∶595、约1∶600、约1∶650、约1∶700、约1∶750、约1∶800、约1∶850、约1∶900、约1∶950、约1∶1000、约1∶1500、约1∶2000、约1∶2500、约1∶3000、约1∶3500、约1∶4000、约1∶4500、约1∶5000)。在实例中，细胞培养基补充剂的有效稀释度为约1∶250到约1∶750。在实例中，细胞培养基补充剂的有效稀释度为约1∶400到约1∶600。
在一个实施例中，提供了一种细胞培养基补充剂，其包含0.00647mol/l合成性胆固醇、0.0676mol/l甲基-β-环糊精、0.00032mol/l花生四烯酸、0.00105mol/l亚油酸、0.00105mol/l亚麻酸、0.00011mol/l肉豆蔻酸、0.00273mol/l油酸、0.0017mol/l棕榈酸、0.00017mol/l棕榈油酸、0.00202mol/l硬脂酸、27.75422mol/l热水和27.75422mol/l冷水。在实施例中，细胞培养基补充剂的有效稀释度为约1∶10到约1∶5000(例如，约1∶10、约1∶20、约1∶30、约1∶40、约1∶50、约1∶60、约1∶70、约1∶80、约1∶90、约1∶100、约1∶150、约1∶200、约1∶250、约1∶300，约1∶350、约1∶400、约1∶450、约1∶455、约1∶460、约1∶465、约1∶470、约1∶475、约1∶480、约1∶485、约1∶490、约1∶495、约1∶500、约1∶505、约1∶510、约1∶515、约1∶520、约1∶525、约1∶530、约1∶535、约1∶540、约1∶545、约1∶550、约1∶555、约1∶560、约1∶565、约1∶570、约1∶575、约1∶580、约1∶585、约1∶590、约1∶595、约1∶600、约1∶650、约1∶700、约1∶750、约1∶800、约1∶850、约1∶900、约1∶950、约1∶1000、约1∶1500、约1∶2000、约1∶2500、约1∶3000、约1∶3500、约1∶4000、约1∶4500、约1∶5000)。在实例中，细胞培养基补充剂的有效稀释度为约1∶250到约1∶750。在实例中，细胞培养基补充剂的有效稀释度为约1∶400到约1∶600。
组合和培养方法
本发明还包含不同化合物的组合物，以及制备和/或使用这种组合物的方法。这些不同的化合物可以(1)作为培养基补充剂存在或存在于培养基补充剂中，或者(2)存在于培养基中。另外，这种组合可以存在于试剂盒中。本发明的组合物可以包含(1)胆固醇和/或其衍生物、(2)一种或多种环糊精、(3)一种或多种脂肪酸、(4)2-dg和/或(5)另一种化合物(例如，前列腺素、依托莫司、白三烯、他汀等)。因此，本发明的组合物包含含有胆固醇、一种或多种脂肪酸和2-dg但不含环糊精的培养基。本发明的组合物还包含含有胆固醇、一种或多种脂肪酸和环糊精但不含2-dg的培养基。另外，本发明的组合物还包含含有胆固醇、一种或多种脂肪酸、环糊精和2-dg的培养基。
本文所述的组合物包含培养基补充剂、培养基补充剂的添加剂和培养基。当然，存在的特定化合物的量将随组合物的类型而变化。作为一个实例，假设10x培养基补充剂是通过将5x溶液与另一种溶液混合以达到1x浓度来制备的。进一步假设5x溶液含有500μg/ml化合物a。在此类实例下，培养基补充剂将含有100μg/ml化合物a，而培养基将含有10μg/ml化合物a。
最终，通常将本发明的调配物设计用于制备培养基。另外，通常将这种培养基配制为具有期望的特性。在本文其它地方列出许多此类期望特性。另外，此类期望特性包含高水平的细胞扩充速率和一种细胞类型相对于另一种细胞类型(例如，cd4 t细胞相对于cd8 t细胞)的选择性扩充。因此，通常将调节存在的各种化合物的量以进一步通过培养细胞实现所需目的。
一方面，提供了一种组合，所述组合包含：(i)t细胞群体，(ii)包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基，和/或(iii)2-dg。
在包括t细胞群体和细胞培养基的组合的上下文中，“细胞培养基”不包含可能源自t细胞群体的化合物。因此，包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基在细胞培养基与t细胞群体组合时包括环糊精和至少一种脂质。
在实施例中，培养(例如，扩充)t细胞包括活化(例如，刺激)t细胞。在实施例中，除非活化t细胞，否则t细胞群体不会增加或几乎不增加(例如，小于约10％)。刺激t细胞的各种方法和组合物是本领域已知的。在实施例中，通过使t细胞与抗体、配体[如植物血凝素(pha)]或化学化合物[如12-o-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯(tpa)或离子霉素]接触(例如，添加到包括t细胞的培养基)来活化t细胞。在实施例中，用抗cd3/cd28抗体包衣的珠(如
在实施例中，所述至少一种脂质是胆固醇、脂肪酸、脂肪酸酯、磷脂或甘油脂。在实施例中，所述至少一种脂质是胆固醇。在实施例中，所述至少一种脂质是脂肪酸。在实施例中，所述至少一种脂质是脂肪酸酯。在实施例中，所述至少一种脂质是磷脂。在实施例中，所述至少一种脂质是甘油脂。
在实施例中，所述脂肪酸是饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是单不饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是多不饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是单不饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是多不饱和脂肪酸。在一些实施例中，脂肪酸是选自由以下组成的群组中的一种或多种脂肪酸类型：(1)饱和脂肪酸，(2)单不饱和脂肪酸，和(1)多不饱和脂肪酸，以及这些脂肪酸的组合(例如，两种多不饱和脂肪酸、三种单不饱和脂肪酸和一种饱和脂肪酸)。
在实施例中，脂肪酸是ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸或ω-9脂肪酸，或ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸或ω-9脂肪酸中的一种或多种(例如，两种或多种或三种)的组合。在实施例中，所述脂肪酸是lc-pufa。在实施例中，所述脂肪酸是饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是单不饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是多不饱和脂肪酸。在实施例中，所述脂肪酸是亚油酸。
在实施例中，组合进一步包含亚麻酸。在实施例中，所述亚麻酸是α-亚麻酸、γ-亚麻酸或α-亚麻酸和γ-亚麻酸。在实施例中，所述亚麻酸是α-亚麻酸。在实施例中，所述亚麻酸是γ-亚麻酸。在实施例中，所述亚麻酸是α-亚麻酸和γ-亚麻酸。
在实施例中，组合进一步包含花生四烯酸。在实施例中，组合进一步包含肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和/或硬脂酸。在实施例中，组合进一步包含肉豆蔻酸。在实施例中，组合进一步包含油酸。在实施例中，组合进一步包含棕榈酸。在实施例中，组合进一步包含棕榈油酸。在实施例中，组合进一步包含硬脂酸。
在实施例中，至少一种脂质是(a)亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸或硬脂酸中的任何一种；(b)亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸中的2种、3种、4种、5种、6种或7种；(c)亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸；(d)饱和脂肪酸，并且所述饱和脂肪酸是丁酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸或蜡酸；(e)单不饱和脂肪酸，并且所述单不饱和脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸或神经酸；(f)多不饱和脂肪酸，并且所述多不饱和脂肪酸是十六碳三烯酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、米德酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十一碳五烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳四烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳五烯酸或二十四碳六烯酸；(g)ω-3脂肪酸，并且ω-3脂肪酸为十六碳三烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸，二十一碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳六烯酸；(h)ω-6脂肪酸，并且ω-6脂肪酸是亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十四碳四烯酸或二十四碳五烯酸；或(i)ω-9脂肪酸，并且ω-9脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸或米德酸。在实施例中，至少一种脂质是亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸或硬脂酸中的任何一种。在实施例中，至少一种脂质是亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸中的2种、3种、4种、5种、6种或7种。在实施例中，至少一种脂质是亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸。在实施例中，至少一种脂质是饱和脂肪酸，并且所述饱和脂肪酸为丁酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸或蜡酸。在实施例中，至少一种脂质是单不饱和脂肪酸，并且所述单不饱和脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸或神经酸。在实施例中，至少一种脂质是多不饱和脂肪酸，并且所述多不饱和脂肪酸是十六碳三烯酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、米德酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十一碳五烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳四烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳五烯酸或二十四碳六烯酸。在实施例中，至少一种脂质是ω-3脂肪酸，并且ω-3脂肪酸为十六碳三烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸，二十一碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸或二十四碳六烯酸。在实施例中，至少一种脂质是ω-6脂肪酸，并且ω-6脂肪酸为亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十四碳四烯酸或二十四碳五烯酸。在实施例中，至少一种脂质是ω-9脂肪酸，并且ω-9脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸或米德酸。
在实施例中，所述至少一种脂质是胆固醇。在实施例中，所述胆固醇是合成性胆固醇。
在实施例中，所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。在实施例中，所述环糊精是α-环糊精。在实施例中，所述环糊精是β-环糊精。在实施例中，所述环糊精是γ-环糊精。在实施例中，所述环糊精是甲基化的。在实施例中，所述环糊精是甲基-β-环糊精。
在实施例中，所述环糊精是以下中的一种或多种：2-羟丙基-β-环糊精、磺基丁基醚-β-环糊精、2-羟丙基-γ-环糊精、2，6-二甲基-α-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、羟乙基-β-环糊精、β-环糊精多硫酸酯、三甲基β-环糊精和/或γ-环糊精多硫酸酯。在实施例中，所述环糊精是2-羟丙基-β-环糊精、磺基丁基醚-β-环糊精、2-羟丙基-γ-环糊精、2，6-二甲基-α-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、羟乙基-β-环糊精、β-环糊精多硫酸酯、三甲基β-环糊精和/或γ-环糊精多硫酸酯。
在实施例中，组合物包含多种不同的环糊精，其中多种环糊精包含至少两种环糊精(例如，约或至少约2、3、4、5、6、7、8、9或10种环糊精)。在实施例中，组合物包含不同的环糊精，其范围为约两种到约十种(例如，约两种到约十种、约三种到约十种、约四种到约十种、约五种到约十种、约两种到约八种、约三种到约八种、约四种到约八种、约两种到约十种等)。
在实施例中，多种环糊精包含至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)α-环糊精、至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)β-环糊精和/或至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)γ-环糊精。在实施例中，多种环糊精包含至少2种α-环糊精、至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)β-环糊精和/或至少一种(例如，约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)γ-环糊精。在实施例中，多种环糊精包含至少3种α-环糊精、至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)β-环糊精和/或至少一种(例如，约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)γ-环糊精。在实施例中，多种环糊精包含至少4种α-环糊精、至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)β-环糊精和/或至少一种(例如，约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)γ-环糊精。在实施例中，多种环糊精包含至少5种α-环糊精、至少一种(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)β-环糊精和/或至少一种(例如，约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)γ-环糊精。
在实施例中，组合包含亚油酸、胆固醇和环糊精。
在实施例中，组合进一步包括2-dg。在实施方案中，组合包含的2-dg的水平为约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.5mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。在实施例中，细胞培养基包含的2-dg的水平为约0.1mm到约10mm、约0.1mm到约5mm、约0.1mm到约4mm、约0.1mm到约3mm、约0.1mm到约2mm、约0.1mm到约1mm、约0.25mm到约5mm、约0.25mm到约5mm、约0.25mm到约4mm、约0.25mm到约3mm、约0.25mm到约2mm或约0.25mm到约1mm。在实施例中，2-dg的水平小于5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm或0.25mm。在实施例中，2-dg的水平为约5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm或0.25mm。
在实施例中，组合物或组合中的胆固醇分子的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、98％(例如，约5％到约50％、约5％到约50％、约5％到约50％、约5％到约98％、约5％到约85％、约5％到约75％、约5％到约60％、约10％到约98％、约15％到约95％、约20％到约95％、约40％到约80％、约65％到约99％等)在环糊精分子的环内(例如，其至少一部分在环糊精分子的环内部)。
在实施例中，组合物或组合中的脂肪酸分子的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、98％(例如，约5％到约50％、约5％到约50％、约5％到约50％、约5％到约98％、约5％到约85％、约5％到约75％、约5％到约60％、约10％到约98％、约15％到约95％、约20％到约95％、约40％到约80％、约65％到约99％等)在环糊精分子的环内(例如，其至少一部分在环糊精分子的环内部)。
在实施例中，组合包含环糊精和胆固醇，其中tc∶tcol的摩尔比小于10.5∶1、小于10∶1、小于9.5∶1、小于9∶1、小于8.5∶1、小于8∶1、小于7.5∶1、小于7∶1、小于6.5∶1、小于6∶1、小于5.5∶1、小于5∶1、小于4.5∶1、小于4∶1、小于3.5∶1、小于3∶1、小于2.5∶1、小于2∶1、小于1.5∶1、小于1∶1、小于0.5∶1、小于0.25∶1或小于0.1∶1。因此，tc∶tcol的摩尔比可以为约10.5∶1到约0.1∶1、约8∶1到约0.1∶1、约7∶1到约0.1∶1、约6∶1到约0.1∶1、约5∶1到约0.1∶1、约3∶1到约0.1∶1、约2∶1到约0.1∶1等。
在实施例中，组合包含环糊精和至少一种脂肪酸，其中tc∶tfa的摩尔比小于11.5∶1、小于11∶1、小于10.5∶1、小于10∶1、小于9.5∶1、小于9∶1、小于8.5∶1、小于8∶1、小于7.5∶1、小于7∶1、小于6.5∶1、小于6∶1、小于5.5∶1、小于5∶1、小于4.5∶1、小于4∶1、小于3.5∶1、小于3∶1、小于2.5∶1、小于2∶1、小于1.5∶1、小于1∶1、小于0.5∶1、小于0.25∶1或小于0.1∶1。因此，环糊精与至少一种脂肪酸的摩尔比可以为约11.5∶1到约0.1∶1、约10.5∶1到约0.1∶1、约8∶1到约0.1∶1、约7∶1到约0.1∶1、约6∶1到约0.1∶1、约5∶1到约0.1∶1、约3∶1到约0.1∶1、约2∶1到约0.1∶1等。
在实施例中，组合包含环糊精、胆固醇和至少一种脂肪酸，其中(1)tc∶(2)tcol和tfa(例如，tcol和tfa的摩尔值的和)的摩尔比小于7.5∶1、小于7∶1、小于6.5∶1、小于6∶1、小于5.5∶1、小于5∶1、小于4.5∶1、小于4∶1、小于3.5∶1、小于3∶1、小于2.5∶1、小于2∶1、小于1.5∶1、小于1∶1、小于0.5∶1、小于0.25∶1或小于0.1∶1。因此，(1)tc∶(2)tcol和tfa的摩尔比可以为约7∶1到约0.1∶1、约6∶1到约0.1∶1、约5∶1到约0.1∶1、约3∶1到约0.1∶1、约2∶1到约0.1∶1等。
在实施例中，基于摩尔的tc∶tcol为10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15和90∶10(例如，约10∶90到约90∶10、约20∶80到约90∶10、约30∶70到约90∶10、约40∶60到约90∶10、约10∶90到约80∶20、约10∶90到约70∶30、约10∶90到约60∶40、约20∶80到约80∶20、约30∶70到约70∶30、约40∶60到约60∶40等)。
在实施例中，基于摩尔的tfa∶tc的比率为10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15和90∶10(例如，约10∶90到约90∶10、约20∶80到约90∶10、约30∶70到约90∶10、约40∶60到约90∶10、约10∶90到约80∶20、约10∶90到约70∶30、约10∶90到约60∶40、约20∶80到约80∶20、约30∶70到约70∶30、约40∶60到约60∶40等)。
在实施例中，基于摩尔的tfa∶tcol的比率为10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15和90∶10(例如，约10∶90到约90∶10、约20∶80到约90∶10、约30∶70到约90∶10、约40∶60到约90∶10、约10∶90到约80∶20、约10∶90到约70∶30、约10∶90到约60∶40、约20∶80到约80∶20、约30∶70到约70∶30、约40∶60到约60∶40等)。
在实施例中，基于摩尔的总多不饱和脂肪酸分子对其它脂肪酸分子的比率为10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15和90∶10(例如，约10∶90到约90∶10、约20∶80到约90∶10、约30∶70到约90∶10、约40∶60到约90∶10、约10∶90到约80∶20、约10∶90到约70∶30、约10∶90到约60∶40、约20∶80到约80∶20、约30∶70到约70∶30、约40∶60到约60∶40等)。
在实施例中，ω-3多不饱和脂肪酸分子对其它脂肪酸分子的比率为10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15和90∶10(例如，约10∶90到约90∶10、约20∶80到约90∶10、约30∶70到约90∶10、约40∶60到约90∶10、约10∶90到约80∶20、约10∶90到约70∶30、约10∶90到约60∶40、约20∶80到约80∶20、约30∶70到约70∶30、约40∶60到约60∶40等)。
在实施例中，ω-6多不饱和脂肪酸分子对其它脂肪酸分子的比率为10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15和90∶10(例如，约10∶90到约90∶10、约20∶80到约90∶10、约30∶70到约90∶10、约40∶60到约90∶10、约10∶90到约80∶20、约10∶90到约70∶30、约10∶90到约60∶40、约20∶80到约80∶20、约30∶70到约70∶30、约40∶60到约60∶40等)。
在实施例中，ω-9多不饱和脂肪酸分子对其它脂肪酸分子的比率为10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15和90∶10(例如，约10∶90到约90∶10、约20∶80到约90∶10、约30∶70到约90∶10、约40∶60到约90∶10、约10∶90到约80∶20、约10∶90到约70∶30、约10∶90到约60∶40、约20∶80到约80∶20、约30∶70到约70∶30、约40∶60到约60∶40等)。
在实施例中，组合进一步包含前列腺素、皮质类固醇、白三烯、脂氧素、保护素、消退素、寡核苷酸或疏水性药物化合物。在实施例中，组合进一步包含前列腺素。在实施例中，组合进一步包含皮质类固醇。在实施例中，组合进一步包含白三烯。在实施例中，组合进一步包含脂氧素。在实施例中，组合进一步包含保护素。在实施例中，组合进一步包含消退素。在实施例中，组合进一步包含寡核苷酸。在实施例中，组合进一步包含疏水性药物化合物。在实施例中，疏水性药物化合物是依托莫司或他汀。在实施例中，疏水性药物化合物是依托莫司。在实施例中，疏水性药物化合物是他汀。
在实施例中，细胞培养基包含的环糊精的水平为约200μm、150μm、140μm、130μm、120μm、110μm、100μm、90μm、80μm、70μm、60μm、50μm、40μm、30μm、20μm、10μm、5μm、1μm、0.5μm、0.25μm、0.1μm、0.05μm、0.025μm、0.001μm，小于200μm、小于150μm、小于140μm、小于130μm、小于120μm、小于110μm、小于100μm、小于90μm、小于80μm、小于70μm、小于60μm、小于50μm、小于40μm、小于30μm、小于20μm、小于10μm、小于5μm、小于1μm、小于0.5μm、小于0.25μm、小于0.1μm、小于0.05μm、小于0.025μm或小于0.01μm。
在实施例中，细胞培养基包含的环糊精的水平为约50μm到约200μm、约55μm到约195μm、约50μm到约190μm、约65μm到约185μm、约70μm到约180μm、约75μm到约175μm、约80μm到约170μm、约85μm到约165μm、约90μm到约160μm、约90μm到约155μm，约95μm到约150μm、约100μm到约145μm、约105μm到约140μm、约110μm到约135μm、约115μm到约130μm或约120μm到约125μm。
在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂质的水平为至少约5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂质的水平为约5μm、10μm、15μm到约20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂质的水平为约5μm到约50μm、约5μm到约40μm、约5μm到约30μm、约10μm到约30μm、约11μm到约29μm、约12μm到约28μm、约13μm到约27μm、约14μm到约26μm、约15μm到约25μm、约16μm到约24μm、约17μm到约23μm、约18μm到约22μm、约19μm到约21μm。在实施例中，细胞培养基中的至少一种脂质的水平为10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm。
在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂肪酸的水平为至少约5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂肪酸的水平为约5μm、10μm、15μm到约20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种脂肪酸的水平为约5μm到约50μm、约5μm到约40μm、约5μm到约30μm、约10μm到约30μm、约11μm到约29μm、约12μm到约28μm、约13μm到约27μm、约14μm到约26μm、约15μm到约25μm、约16μm到约24μm、约17μm到约23μm、约18μm到约22μm、约19μm到约21μm。在一些实施例中，细胞培养基中的至少一种脂肪酸的水平为10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm。
在实施例中，细胞培养基包含的至少一种多不饱和脂肪酸(例如，ω-6脂肪酸，如花生四烯酸、亚油酸和/或γ-亚麻酸)的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种多不饱和脂肪酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的至少一种多不饱和脂肪酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的花生四烯酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的花生四烯酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的花生四烯酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的亚油酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的亚油酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的亚油酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的亚麻酸(例如，α-亚麻酸、γ-亚麻酸或其组合)的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的亚麻酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的亚麻酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的多不饱和脂肪酸之外的至少一种脂肪酸(例如，饱和脂肪酸，如肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸和/或单不饱和脂肪酸，如棕榈油酸或油酸)的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的一种或多种脂肪酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的一种或多种脂肪酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的肉豆蔻酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的肉豆蔻酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的肉豆蔻酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的棕榈酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的棕榈酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的棕榈酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的硬脂酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的硬脂酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的硬脂酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的棕榈油酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的棕榈油酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的棕榈油酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的油酸的水平为至少约0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的油酸的水平为约0.05μm、0.1μm、0.5μm或1μm到约1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的油酸的水平为约0.05μm到约50μm、约0.5μm到约10μm、约5μm到约10μm或约1μm到约5μm。
在实施例中，细胞培养基包含的胆固醇(例如，合成性胆固醇、不含动物来源的胆固醇等)的水平为至少约5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的胆固醇的水平为约5μm、10μm或15μm到约20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在实施例中，细胞培养基包含的胆固醇的水平为约5μm到约50μm、约5μm到约40μm、约5μm到约30μm、约10μm到约30μm、约11μm到约29μm、约12μm到约28μm、约13μm到约27μm、约14μm到约26μm、约15μm到约25μm、约16μm到约24μm、约17μm到约23μm、约18μm到约22μm、约18μm到约21μm、约19μm到约20μm。在实施例中，细胞培养基包含的胆固醇的水平为10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm。
在实施例中，组合不包含药物化合物。在实施例中，组合不包含前列地尔、头孢替安酯hcl、贝奈克酯hcl、地塞米松、碘、烟碱、尼美舒利、硝酸甘油、奥美拉唑、pge2、吡罗昔康、噻洛芬酸、西沙必利、氢化可的松、鲁康唑、伊曲康唑、丝裂霉素、17β-雌二醇、氯霉素、伏立康唑、马来酸齐拉西道、双氯芬酸钠、依托莫司或他汀。在实施例中，组合不包含疏水性药物化合物。
在实施例中，细胞培养基不包含白蛋白。在实施例中，细胞培养基不包含蛋白质。在实施例中，细胞培养基是无血清细胞培养基。
在实施例中，细胞培养基包含白蛋白。在实施例中，细胞培养基包含蛋白质。
在实施例中，相比与不包含环糊精和至少一种脂质的细胞培养基组合的t细胞群体中的对应t细胞，t细胞群体包含的t细胞能够具有更大的表型保留、更大的扩充、更大的效力和/或更高的转导效率。
在一个方面提供了一种用于培养t细胞群体的方法，所述方法包含在包含环糊精和至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10种)脂质的细胞培养基中温育所述群体。在实施例中，一种用于培养t细胞群体的方法包含在细胞培养基中温育所述群体，所述细胞培养基包含：(1)环糊精和(2)至少2种脂质、至少3种脂质、至少4种脂质、至少5种脂质、至少6种脂质、至少7种脂质、至少8种脂质、至少9种脂质、至少10种脂质、至少15种脂质或至少20种脂质(例如，约3种到约20种、约4种到约20种、约5种到约20种、约6种到约20种、约7种到约20种、约3种到约15种、约3种到约12种、约3种到约10种、约3种约8种、约5种到约20种、约5种到约15种、约5种到约12种、约5种到约9种等脂肪酸)。
在实施例中，细胞培养基包含如本文所提供的包含其实施例的无血清细胞培养补充剂组合物。
在实施例中，所述t细胞群体包含cd8 t细胞。在实施例中，所述t细胞群体包含cd4 t细胞。在实施例中，所述t细胞群体包含cd8 t细胞和cd4 t细胞。
一方面，提供了一种培养包含cd8 t细胞和cd4 t细胞的t细胞群体同时最小化所述群体内cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率的变化的方法，所述方法包含在包含环糊精和多不饱和脂肪酸的培养基中温育所述群体。在实施例中，所述多不饱和脂肪酸是ω-6多不饱和脂肪酸。在实施例中，所述ω-6多不饱和脂肪酸是亚油酸。
在实施例中，培养基进一步包含胆固醇。在实施例中，培养基进一步包含亚麻酸。在实施例中，所述多不饱和脂肪酸是亚麻酸。在实施例中，培养基进一步包含花生四烯酸。
在所述方法的实施例中，最小化cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率的变化包含维持cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率，其中与当所述群体首次与培养基接触时的cd8 t细胞对cd4 t细胞的数量相比，cd8 t细胞与cd4 t细胞的数量相差小于25％、20％、15％、10％或5％。
在实施例中，当群体首次与培养基接触时，则所述群体包含约1∶1(例如1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1、1∶1.1、1∶1.2、1∶1.3、1∶1.4、1∶1.5或约1.01∶1到1.1∶1或约1∶1.01到1∶1.1)的cd8 t细胞对cd4 t细胞比率。在实施例中，当群体首次与培养基接触时，则所述群体包含的cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率为1∶1。
在实施例中，培养基包含(i)环糊精；(ii)胆固醇；以及(iii)脂肪酸，其中脂肪酸由亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸组成。在实施例中，培养基缺乏肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和/或硬脂酸中的任一种或其任何组合。
在实施例中，培养基包含的一种或多种多不饱和脂肪酸与其它脂肪酸的摩尔比为至少1∶1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1)。在实施例中，培养基包含的ω-3多不饱和脂肪酸与其它脂肪酸的摩尔比为至少1∶1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1)。在实施例中，培养基包含的ω-6多不饱和脂肪酸与其它脂肪酸的摩尔比为至少1∶1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1)。在实施例中，培养基包含的ω-9多不饱和脂肪酸与其它脂肪酸的摩尔比为至少1∶1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1)。
在实施例中，培养基包含的亚油酸、亚麻酸和/或花生四烯酸与其它脂肪酸的摩尔比为至少1∶1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1)。在实施例中，培养基包含的(1)亚油酸、亚麻酸和/或花生四烯酸与(2)其它脂肪酸的摩尔比为至少2∶1、至少3∶1、至少4∶1、至少5∶1、至少6∶1、至少7∶1、至少8∶1、至少9∶1或至少10∶1。
在实施例中，所述方法进一步包含将所述群体温育足够的时间直到t细胞已经达到所需数量、分化阶段和/或表型；并任选地从培养物中采集t细胞。
一方面，提供了一种用于优先扩充t细胞亚群的成员的方法，所述方法包含使混合的t细胞群体暴露于：(i)环糊精；和(ii)脂肪酸，其中调整两种或更多种脂肪酸的摩尔比以诱导所述t细胞亚群的所述成员相较于其它t细胞亚群的成员优先扩充。
在实施例中，所述t细胞亚群是cd8 t细胞。
在实施例中，相比于其它脂肪酸，使所述混合的t细胞群体更多地暴露于多不饱和脂肪酸。在实施例中，相比于其它脂肪酸，使所述混合的t细胞群体更多地暴露于ω-6多不饱和脂肪酸。
在实施例中，所述t细胞亚群是cd4 t细胞。在实施例中，所述t细胞是原代t细胞。在实施例中，所述t细胞已经从人类受试者的血液中分离出来。
在实施例中，所述t细胞是基因修饰的t细胞。在实施例中，所述t细胞表达基因修饰的t细胞受体。在实施例中，所述t细胞表达嵌合抗原受体。
在实施例中，所述t细胞是t调节细胞(tregs)、t辅助细胞、th17细胞、th9细胞、t记忆细胞、t效应记忆细胞、t中央记忆细胞、终末分化型效应(ttd)t细胞、原初t细胞或工程化t细胞。
在实施例中，t细胞群体的大小在7天内翻倍至少3(例如，4、5、6、7、8、9、10)倍。
在实施例中，t细胞群体的大小在10天内翻倍至少3、4或5倍。
在实施例中，在t细胞群体首次与培养基接触之后，t细胞群体中的至少75％、80％、85％、90％或95％的t细胞持续7、8、9或10天存活。在实施例中，在t细胞群体首次与培养基接触之后，t细胞群体中的至少95％的t细胞持续10天存活。
在实施例中，所述方法进一步包含制备培养的t细胞以施用于患有疾病或病状或面临患有疾病或病状的风险的受试者。在实施例中，所述方法进一步包含向试者施用t细胞。
在实施例中提供了一种细胞培养板、烧瓶、袋、生物发酵器或生物反应器系统(或其它适于t细胞培养的培养容器)，其包含如本文所提供的包含其实施例的组合。
用于获得所需cd4 ∶cd8 t细胞比的方法
本文还包含用于获得含有所需cd4 ∶cd8 t细胞比率的t细胞群体的组合物和方法。例如，本主题提供了用于优先扩充t细胞群体内的t细胞亚群(例如，cd8 t细胞)的成员的方法。此类方法包含使混合的t细胞群体(包含cd8 t细胞和例如cd4 t细胞)与2-dg接触。
一方面，本文提供了培养包括cd8 t细胞和cd4 t细胞的t细胞群体同时增加群体内cd8 t细胞对cd4 t细胞比率的方法。在实施例中，在包括2-dg的细胞培养基中温育所述群体。在实施例中，细胞培养基进一步包括环糊精和至少一种脂质(如胆固醇和/或脂肪酸)。在实施例中，环糊精和/或脂质(如胆固醇和/或脂肪酸)以相对于本文所提供的细胞培养基、细胞培养补充剂或组合公开的量或摩尔比存在。在实施例中，所述环糊精是本文所公开的任何环糊精或环糊精的组合。在实施例中，所述脂质是本文所公开的任何脂质(如脂肪酸和/或胆固醇)或脂质的组合。
在实施例中，2-dg以约0.1mm到约5mm的水平存在。在实施方案中，组合包含的2-dg的水平为约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.5mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。在实施例中，细胞培养基包含的2-dg的水平为约0.1mm到约10mm、约0.1mm到约5mm、约0.1mm到约4mm、约0.1mm到约3mm、约0.1mm到约2mm、约0.1mm到约1mm、约0.25mm到约5mm、约0.25mm到约5mm、约0.25mm到约4mm、约0.25mm到约3mm、约0.25mm到约2mm或约0.25mm到约1mm。在实施例中，2-dg的水平小于5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm或0.25mm。在实施例中，2-dg的水平为约5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm或0.25mm。
在实施例中，细胞培养基包括血清。在实施例中，血清是人血清。在实施例中，血清是牛血清。在实施例中，牛血清是胎牛血清。在实施例中，血清是细胞培养基的体积的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、10-20％、5-15％、10-20％或15-10％。
在实施例中，细胞培养基是无血清细胞培养基。
在实施例中，在所述群体首次与培养基接触之后，所述群体内的cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率在约2、3、4、5、6或7天内增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍。
在实施例中，当所述群体首次与培养基接触时，所述群体内的cd4 t细胞比cd8 t细胞多。
在实施例中，当所述群体首次与培养基接触时，所述群体内的cd4 t细胞对cd8 t细胞的比率为至少5∶1(例如，至少5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1)。
在实施例中，所述t细胞是原代t细胞。在实施例中，所述t细胞已经从人类受试者的血液中分离出来。在实施例中，所述t细胞是基因修饰的t细胞。在实施例中，所述t细胞表达基因修饰的t细胞受体。在实施例中，所述t细胞表达嵌合抗原受体。
在实施例中，所述t细胞是t调节细胞(tregs)、t辅助细胞、th17细胞、th9细胞、t记忆细胞、t效应记忆细胞、t中央记忆细胞、终末分化型效应(ttd)t细胞、原初t细胞或工程化t细胞。
在实施例中，t细胞群体的大小在7天内翻倍至少3(例如，4、5、6、7、8、9、10)倍。
在实施例中，t细胞群体的大小在10天内翻倍至少3、4或5倍。
在实施例中，在t细胞群体首次与培养基接触之后，t细胞群体中的至少75％、80％、85％、90％或95％的t细胞持续7、8、9或10天存活。在实施例中，在t细胞群体首次与培养基接触之后，t细胞群体中的至少95％的t细胞持续10天存活。
治疗方法
一方面，提供了一种用于治疗有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用通过本文所提供的包括其实施方案的方法获得的t细胞。使用cd8 t细胞的非限制性实例(例如，包括增加的cd8 t细胞比例的t细胞扩充群或从此类扩充群体中分离的cd8 t细胞)包含：基于病毒特异性t细胞用于治疗免疫抑制的移植患者的免疫疗法(如用于巨细胞病毒(cmv)感染和艾普斯登-巴尔病毒(epstein-barrvirus)(ebv)感染)。参见例如，heslop等人，(2010)《血液》115(5)：925-35，其全部内容通过引用并入本文。另外的非限制性实例包含使用car-t和其它模式的工程化病毒特异性t细胞来治疗癌症和感染性疾病。参见例如，pule等人，(2008)《自然医学(naturemedicine.)》115(5)：925-35和ghazi等人，(2013)《免疫疗法杂志(jimmunother)》35(2)：159-168，其每一个的全部内容通过引用并入本文。使用cd4 t细胞的非限制性实例(例如，包括增加的cd4 t细胞比例的t细胞扩充群或从此类扩充群体中分离的cd4 t细胞)包含治疗hiv 患者和用于治疗自身免疫的扩充cd4 t辅助亚群(例如，th1、th2、th3、th17、th9或tfh)和调节性t细胞(treg：cd4 cd25 foxp3 )。参见例如，tebas等人，(2014)《新英格兰医学杂志(nengljmed.)》370(10)：901-10和riley等人，(2009)《免疫学杂志(immunity)》30(5)：656-665，其每一个的全部内容通过引用并入本文。
在实施例中，疾病是过度增殖性病症。在实施例中，疾病是自体免疫性疾病。在实施例中，疾病是炎症性疾病。在实施例中，疾病是过敏性疾病。在实施例中，疾病是感染性疾病。
在实施例中，感染是病毒性感染。在实施例中，病毒感染是巨细胞病毒感染、艾普斯登-巴尔病毒感染或人免疫缺陷病毒感染。
在实施例中，受试者的免疫系统受到抑制。在实施例中，受试者已接受组织或器官移植。在实施例中，受试者患有获得性免疫缺陷综合症。
在实施例中，所述t细胞是cd8 t细胞。在实施例中，所述t细胞是cd4 t细胞。
使用本文所提供的组合物和方法产生的t细胞亚群可以用于治疗目的和/或研究/发现目的的任何数量的生理病状、疾病和/或疾病状态。在实施例中，以异常免疫应答为代表的病状或疾病是自身免疫疾病，例如糖尿病、多发性硬化、重症肌无力、神经炎、狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣或炎性肠病。在实施例中，其中免疫抑制将是有利的病状包含正常或活化的免疫应答对哺乳动物不利的病状，例如，如体液或器官的同种异体移植，以避免排斥或其中不适当的免疫应答与未能受孕和流产有关的生育治疗。在实施例中，在移植之前，期间或之后使用此类细胞避免了可能在所治疗的患者(例如，移植患者)中发生的广泛的慢性移植物抗宿主疾病。在实施例中，细胞可以在采集后立即扩充，或者在扩充之前或在扩充之后并在其治疗使用之前储存(例如，通过冷冻)。在实施例中，此类疗法可以与已知的免疫抑制疗法结合进行。
在实施例中，基于分化阶段分离t细胞。可以基于存在或不存在某些细胞标志物或蛋白质来评估t细胞群体的分化阶段。用于评估t细胞分化阶段的标志物包含：cd3、cd4、cd5、cd8、cd11c、cd14、cd19、cd20、cd25、cd27、cd33、cd34、cd45、cd45ra、cd45rb、cd56、cd62l、cd123、cd127、cd278、cd335、cd11a、cd45ro、cd57、cd58、cd69、cd95、cd103、cd161、ccr7，以及转录因子foxp3。
在实施例中，一旦已经从患者或动物中分离出合适的t细胞群体或亚群，在使用本发明的方法和支持物扩充所得的t细胞群体之前，可以任选地进行遗传或任何其它合适的修饰或操纵。操纵可以例如采取用抗cd3和抗cd28抗体刺激/重新刺激t细胞以使其活化/重新活化的形式。
在实施例中，可能期望向受试者施用活化的t细胞，并且随后根据本文所提供的方法重新抽血(或进行单采血液成分术)、活化和扩充来自其中的t细胞并且向患者重新输注这些活化的和扩充的t细胞。可以每隔几周进行多次此过程。在实施例中，可以抽取10ml到400ml的血来扩充t细胞。在实施例中，抽取约20ml、约30ml、约40ml、约50ml、约60ml、约70ml、约80ml、约90ml或约100ml的血来扩充t细胞。在实施例中，标的组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包含气雾剂吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。在实施例中，本文所描述的组合物可以皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内向患者施用。在实施例中，通过皮内或皮下注射向患者施用t细胞。在实施例中，通过i.v.注射向患者施用t细胞。在实施例中，可以将t细胞直接注射到肿瘤、淋巴结或感染/炎症(自身免疫)部位。
在实施例中，根据本文所提供的方法生成的t细胞亚群可以具有许多潜在使用，包含实验和治疗使用。在实施例中，从患者体内去除少量t细胞，然后在将其重新注入患者体内之前对其进行离体操纵和扩充。可以以此方式治疗的疾病的非限制性实例是自身免疫疾病和期望抑制免疫活性(例如，对于同种异体移植耐受性)的病状。在实施例中，治疗方法包括提供哺乳动物，并从含有t细胞的哺乳动物中获得生物学样品；以及根据本文所提供的方法离体扩充/激活t细胞；以及向待治疗的哺乳动物施用扩充的/活化的t细胞。在实施例中，第一哺乳动物和待治疗的哺乳动物可以相同或不同。在实施例中，哺乳动物通常可以是任何哺乳动物，如猫、狗、兔子、马、猪、牛、山羊、绵羊、猴子或人。在实施例中，第一哺乳动物(“供体”)可以是同基因的、同种异体的或异种异体的。在实施例中，可以向具有异常免疫应答(如自身免疫疾病，包含例如糖尿病、多发性硬化、重症肌无力、神经炎、狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣或炎性肠病)、组织移植或生育治疗的哺乳动物施用疗法。
在实施例中，使用本文所提供的组合物和方法产生的t细胞亚群可以用于多种应用和治疗方式。在实施例中，t细胞亚群可以用于治疗疾病状态，包含但不限于癌症、自身免疫疾病、过敏性疾病、炎症性疾病、感染性疾病以及移植物抗宿主疾病(gvhd)。在实施例中，t细胞疗法包含在免疫耗竭之后或不在免疫耗竭之后通过本文所提供的方法向受试者输注外部扩充的t细胞亚群，或向受试者输注已从供体受试者分离的外部扩充的异源t细胞(例如，过继性细胞转移)。
自身免疫疾病或病症是由于对自身抗原的不适当和过度应答而导致的那些疾病。在实施例中，自身免疫病症包括缺陷性treg细胞。自身免疫疾病的非限制性实例包含：作为非限制性实例的糖尿病、葡萄膜视网膜炎和多发性硬化症、艾迪生氏病、腹腔疾病、皮肌炎、格雷夫斯氏病、桥本甲状腺炎、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、溶血性贫血、寻常性天疱疮、牛皮癣、风湿热、结节病、硬皮病、脊柱关节病、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎、克罗恩病、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、血管球性肾炎、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征、重症肌无力、恶性贫血、反应性关节炎、类风湿性关节炎、干燥综合症、系统性红斑狼疮。在自身免疫疾病状态下，cd4 cd25 tregs可能存在数量减少或功能缺陷。在患有多发性硬化症(viglietta等人，《实验医学杂志(j.exp.med.)》199：971-979(2004).)、自身免疫性多腺性综合征ii型(kriegel等人，《实验医学杂志》199：1285-1291(2004).)、i型糖尿病(lindley等人，《糖尿病杂志(diabetes)》54：92-929(2005).)、牛皮癣(sugiyama等人，《免疫学杂志》174：164-173(2005))和重症肌无力(balandina等人，《血液》105：735-741(2005))的患者中发现了来自外周血的treg，其抑制t细胞增殖的能力降低。
在实施例中，用t细胞疗法治疗自身免疫疾病可能涉及不同的机制。在实施例中，可以从患有自身免疫病症的受试者中去除血液或另一来源的免疫细胞。在实施例中，本文所公开的方法用于从患者样品扩充除记忆t细胞之外的t细胞类型。在实施例中，在去除和扩充自体的细胞之后，可以通过已知方法(包含需要低剂量的全身辐射、胸腺辐射、抗胸腺细胞球蛋白和施用化疗)来耗尽不适当的记忆t细胞。化学治疗剂的实例包含但不限于阿仑单抗(campath)、抗cd3抗体、细胞毒素、氟达拉滨(fludarabine)、环孢霉素、fk506、霉酚酸、类固醇、fr901228和辐射。在实施例中，在耗尽能够识别自身抗原的不适当的记忆t细胞之后，可以向受试者重新施用外部扩充的自体的t细胞以重构或重新刺激其免疫系统。
可替代地或除了上述治疗方式之外，可以从包含外周血单核细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、淋巴结组织、肠道相关淋巴样组织、黏膜相关淋巴样组织、脾脏组织或任何其它淋巴组织和肿瘤等来源分离出treg细胞。在实施例中，使用本文所提供的方法扩充这些t细胞。在实施例中，可以向患者重新施用这些扩充的treg细胞以抑制不适当的免疫反应。在实施例中，可以施用此treg疗法以抑制在免疫耗竭之后的最小的剩余免疫应答，或施用于未经历免疫耗竭的受试者。
在实施例中，提供了用t细胞疗法治疗、降低不良gvhd事件的风险或严重性的方法。在实施例中，受试者患有gvhd。在实施例中，gvhd发生在造血干细胞移植之后。在实施例中，gvhd由输注的造血干细胞制剂中存在的同种异体反应性t细胞引起。在实施例中，受试者已经接受器官移植并且患有由同种异体反应性宿主t细胞介导的移植排斥或具有由同种异体反应性宿主t细胞介导的移植排斥的风险。在实施例中，可以从患有gvhd的受试者中去除血液或另一来源的免疫细胞。在实施例中，本文所提供的方法用于选择性扩充除记忆t细胞之外的t细胞类型，选择性扩充不包括来自外源组织的持久识别的抗原的那些细胞类型。在实施例中，在去除和外部扩充自体的细胞之后，可以通过已知方法(包含需要低剂量的全身辐射、胸腺辐射、抗胸腺细胞球蛋白和施用化疗)来耗尽不适当的记忆t细胞。化学治疗剂的实例包含但不限于阿仑单抗、抗cd3抗体、细胞毒素、氟达拉滨、环孢霉素、fk506、霉酚酸、类固醇、fr901228和辐射。在实施例中，在耗尽能够识别外源组织上抗原的不适当的记忆t细胞之后，可以向受试者重新施用外部扩充的自体t细胞以重构或重新刺激其免疫系统。
在实施例中，可以扩充从患者血液中去除的treg细胞。
在实施例中，向患者重新施用这些扩充的treg细胞以抑制不适当的免疫应答，以抑制在免疫耗竭之后的最小的剩余免疫应答或施用于未经历免疫耗竭的受试者。
本文包含治疗过敏性疾病的方法。在实施例中，过敏性疾病包括t细胞功能障碍。研究表明，cd4 cd25 treg介导的对过敏原特异性t辅助2型(th2)的抑制作用减弱存在于患有季节性过敏(lingem等人，《柳叶刀(lancet)》2004；363：608-15.；grindebackeh等人，《临床实验过敏症(clin.exp.allerg.)》2004；34：1364-72.)的患者。此外，与健康受试者相比，与过敏性反应和哮喘病个体相关的t细胞群体的比例发生了改变(akdism等人，《实验医学杂志》2004；199：1567-75；tiemessenmm等人，《过敏与临床免疫学杂志(jallergyclinimmunol)》2004；113：932-9.)。
在实施例中，可以从患有过敏性病症的受试者中去除血液。在实施例中，本文所提供的方法用于选择性扩充非记忆t细胞的t细胞类型，选择性扩充不包括来自不适当抗原(例如，豆类蛋白)的持久识别的抗原的那些细胞类型。在实施例中，在去除和扩充自体的细胞之后，可以通过已知方法(包含需要低剂量的全身辐射、胸腺辐射、抗胸腺细胞球蛋白和施用化疗)来耗尽不适当的记忆t细胞。化学治疗剂的实例包含但不限于阿仑单抗、抗cd3抗体、细胞毒素、氟达拉滨、环孢霉素、fk506、霉酚酸、类固醇、fr901228和辐射。在实施例中，在耗尽能够识别外源组织上抗原的不适当的记忆t细胞之后，可以向受试者重新施用外部扩充的白体t细胞以重构或重新刺激其免疫系统。
在实施例中，可以扩充从患者血液中去除的treg细胞。可以向患者重新施用这些扩充的treg细胞以抑制不适当的免疫应答，以抑制在免疫耗竭之后的最小的剩余免疫应答或施用于未经历免疫耗竭的受试者。
本文还提供了用于治疗炎症性疾病和与炎症相关的病症的方法。这些疾病中的许多疾病也可以归类为自身免疫疾病。炎症性疾病和与炎症相关的病症的非限制性实例包含：糖尿病；类风湿关节炎；炎症性肠病；家族性地中海热；新生儿发病多系统炎性疾病；肿瘤坏死因子(tnf)受体相关周期性综合征(traps)；白细胞介素-1受体拮抗剂缺乏(dira)；以及白塞氏病。
不受任何理论的束缚，由于treg细胞在抑制针对非病原性抗原的不适当免疫应答中的作用，这些t细胞亚群数量减少或功能受损可以导致炎症性疾病。例如，炎性肠病(mhimmell等人，《免疫学杂志》2012jun；136(2)：115-122)和类风湿关节炎(mnoack等人，《自身免疫评论(autoimmunitiesreviews)》2014jun；13(6)：668-677)就是这样。
在实施例中，可以从患有炎症性病症的受试者中去除血液。在实施例中，本文所提供的方法可以用于选择性扩充非记忆t细胞的t细胞类型，选择性扩充那些不包括持久识别不适当的抗原的细胞类型(例如，抗氨甲酰化蛋白(anti-carp)抗体中的氨酰化蛋白介导的类风湿关节炎)。在去除和扩充自体的细胞之后，可以通过已知方法(包含需要低剂量的全身辐射、胸腺辐射、抗胸腺细胞球蛋白和施用化疗)来耗尽不适当的记忆t细胞。化学治疗剂的实例包含但不限于阿仑单抗、抗cd3抗体、细胞毒素、氟达拉滨、环孢霉素、fk506、霉酚酸、类固醇、fr901228和辐射。在实施例中，在耗尽能够识别自身抗原并引起炎症应答的不适当的记忆t细胞之后，可以向受试者重新施用外部扩充的自体的t细胞以重构其免疫系统。
在实施例中，可以扩充从患者血液中去除的treg细胞。
可以向患者重新施用这些扩充的treg细胞以抑制不适当的免疫应答，以抑制在免疫耗竭之后的最小的剩余免疫应答或施用于未经历免疫耗竭的受试者。
本文还提供了用于治疗过度增殖性疾病(如癌症)的方法。在实施例中，增加的treg活性可以导致对肿瘤抗原的不良免疫应答并导致免疫功能障碍。已经发现在肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌和皮肤癌患者的血液或肿瘤本身中均有升高的cd4 cd25 群体(wooey等人，《免疫学杂志》2002；168：4272-6.；wolfam等人，《临床癌症研究》2003；9：606-12.；liyanageuk等人，《免疫学杂志》2002；169：2756-61.；viguierm等人，《免疫学杂志》2004；173：1444-53.；ormandyla等人，《癌症研究(cancerres)》2005；65：2457-64.)。
在实施例中，使用本文所公开的方法或组合物扩充对肿瘤抗原或过度增殖性病症抗原或与过度增殖性病症相关的抗原具有特异性的t细胞。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，其引起免疫应答，特别是t细胞介导的免疫应答。
在实施例中，可以治疗的癌症包含未血管化或尚未充分血管化的肿瘤以及血管化肿瘤。在实施例中，癌症可以包括非实体瘤(如血液肿瘤，例如，白血病和淋巴瘤)或可以包括实体瘤。待治疗的癌症类型包含但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴样恶性肿瘤，良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如，肉瘤、癌和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也包含在内。这些癌症包含皮肤癌、脑癌和其它中枢神经系统癌、头癌、颈癌、肌肉/肉瘤癌、骨癌、肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌，阴茎癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌或甲状腺癌或胶质母细胞瘤。
血液癌是血液或骨髓的癌症。血液(或血源性)癌的非限制性实例包含白血病，包含急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞的、早幼粒细胞的、髓单核细胞、单核细胞的和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性髓细胞性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级别形式)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤是通常不含有囊肿或液体区的异常肿块。实体瘤可以是良性的或恶性的。根据形成实体瘤的细胞类型来命名不同类型的实体瘤(如肉瘤、癌和淋巴瘤)。如肉瘤和癌等实体瘤的非限制性实例包含纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴类肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和cns肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤、cns淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、血管瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。
在实施例中，扩充的t细胞是经基因修饰的t细胞以靶向通过嵌合抗原受体(car)的表达在肿瘤细胞上表达的抗原。在实施例中，扩充表达car的t细胞。car是被设计为以人白细胞抗原独立方式识别细胞表面抗原的抗原受体。在实施例中，可以从患者血液或其它组织收集免疫细胞。在实施例中，如下所述使t细胞工程化以在其表面上表达car，从而允许它们识别特异性抗原(例如，肿瘤抗原)。在实施例中，这些cart细胞然后可以通过本发明的方法来扩充并输注到患者体内。在实施例中，以1×105个、1×106个、1×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个、1×1011个、5×1011个或1×1012个细胞向受试者施用t细胞。在实施例中，在患者输注之后，t细胞将继续扩充并表达car，从而允许针对携带工程化car以识别特异性抗原的细胞进行免疫应答。
在实施例中，提供了工程化细胞以表达car(例如，t细胞)，其中所述cart细胞表现出抗肿瘤特性。在实施例中，使car工程化以包括细胞外结构域，所述细胞外结构域具有与t细胞抗原受体复合物ζ链(例如，cd3ζ)的细胞内信号传导域融合的抗原结合域。在实施例中，当car在t细胞中表达时能够基于抗原结合特异性来重定向抗原识别。
在实施例中，car的抗原结合部分包括靶标特异性结合元件，另外称为抗原结合部分。在实施例中，部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域以识别充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。因此，car中的抗原部分结构域可以包含例如与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
在实施例中，编码car的天然或合成核酸的表达通常是通过将编码car多肽或其部分的核酸可操作地连接到启动子，并将构建体掺入表达载体中来实现的。载体可以适合于复制和整合真核生物。在实施例中，克隆载体含有用于调节表达所需的核酸序列的转录和转译终止子、起始序列和启动子。
在实施例中，可以使用标准基因递送方案将t细胞用于核酸免疫和基因治疗。基因递送方法是本领域已知的。参见例如美国专利第5,399,346号；第5,580,859号；第5,589,466号。在实施例中，提供了基因治疗载体。
在实施例中，可以将核酸克隆到多种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，所述载体包含但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包含表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
在实施例中，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且例如在sambrook等人，(2001，《分子克隆：实验室手册(molecularcloning：alaboratorymanual)》，纽约冷泉港实验室)，以及其它病毒学和分子生物学手册中描述了。用作载体的病毒包含但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物中有复制功能的起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选择的标志物，(参见例如wo01/96584；wo01/29058；和美国专利第6,326,193号。
已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒粒子中。然后可以分离重组病毒并体内或离体递送到受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施例中，使用慢病毒载体。
在实施例中，另外的启动子元件(例如，增强子)调节转录起始的频率。在实施例中，这些位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔往往是灵活的，使得当元件相对于彼此反向或移动时能保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至50bp。取决于启动子，似乎各元件可以协同或独立地起作用以激活转录。制作cart细胞的方法是本领域已知的(参见例如美国专利8,906,682)。
在一个实施例中，当t细胞是cart细胞时，本发明的抗原结合部分的选择可以取决于要治疗的癌症的特定类型。肿瘤抗原是本领域已知的，并且包含例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(cea)、β-人绒毛膜促性腺激素、α-胎甲球蛋白(afp)、凝集素反应性afp、甲状腺球蛋白、rage-1、mn-caix、人端粒酶逆转录酶、rulru2(as)、肠羧基酯酶、muthsp70-2、m-csf、前列腺(prostase)、前列腺特异性抗原(psa)、pap、ny-eso-1、lage-1a、p53、蛋白质(prostein)、psma、her2/神经鞘、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(pcta-1)、mage、elf2m、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白b2、cd22、胰岛素生长因子(igf-1)、igf-ii、igf-i受体和间皮素。
在实施例中，肿瘤抗原包括与恶性肿瘤相关的一种或多种抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达可以充当免疫攻击的靶抗原的多种蛋白质。这些分子包含但不限于组织特异性抗原，如黑色素瘤中的mart-1、酪氨酸酶和gp100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(pap)和前列腺特异性抗原(psa)。其它靶分子属于转化相关分子，如致癌基因her-2/neu/erbb-2。又另一组靶抗原是癌胚胎抗原，如癌胚抗原(cea)。在b细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性免疫球蛋白构成了单个肿瘤所特有的真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。b细胞分化抗原(如cd19、cd20；ror1、cd22、cd23、λ/κ轻链)是b细胞淋巴瘤中靶抗原的其它候选物。
在实施例中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(tsa)或肿瘤相关抗原(taa)。tsa是肿瘤细胞所特有的，并且不会发生在体内其它细胞上。taa不是肿瘤细胞所特有的，而是在不能诱导针对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。taa可以是当免疫系统不成熟且无法应答时在胎儿发育期间在正常细胞上表达的抗原，或者可以是在正常细胞上通常以极低水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
tsa或taa抗原的非限制性实例包含：分化抗原，如mart-1/melana(mart-1)、gp100(pmel17)、酪氨酸酶、trp-1、trp-2和肿瘤特异性毁灭性抗原，如mage-1、mage-3、bage、gage-1、gage-2、p15；过度表达的胚胎抗原，如cea；过度表达的致癌基因和突变的肿瘤抑制基因，如p53、ras、her-2/neu；染色体易位导致的独特肿瘤抗原；如bcr-abl；e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar；以及病毒抗原，如艾泼斯坦巴尔病毒抗原ebva和人乳头状瘤病毒(hpv)抗原e6和e7。其它基于蛋白质的大抗原包含tsp-180、mage-4、mage-5、mage-6、rage、ny-eso、p185erbb2、p180erbb-3、c-met、nm-23h1、psa、tag-72、ca19-9、ca72-4、cam17.1、numa、k-ras、β-连环蛋白、cdk4、mum-1、p15、p16、43-9f、5t4、791tgp72、α-胎甲球蛋白、β-hcg、bca224、btaa、ca125、ca15-3\ca27/29\bcaa、ca195、ca242、ca-50、cam43、cd68\p1、co-029、fgf-5、c250、ga733\epcam、htgp-175、m344、ma-50、mg7-ag、mov18、nb/70k、ny-co-1、rcas1、sdccag16、ta-90、mac-2结合蛋白\亲环蛋白(cyclophillin)c相关蛋白、taa16、tag72、tlp和tps、cd19、cd20、cd22、ror1、间皮素、cd33/il3ra、c-met、psma、糖脂f77、egrviii、gd-2、my-eso-1tcr、magea3tcr等。
本文还提供了治疗感染性疾病的方法。对感染性疾病的免疫应答涉及抗病原和抗炎应答的平衡。t细胞较多地参与了这种复杂的平衡。在实施例中，能够引起t细胞应答的感染性病原体可以是细菌、病毒、原生动物、寄生虫或真菌。treg细胞与幽门螺杆菌(lundgrena等人，《感染免疫学(infectimmun)》2003；71：1755-62.)、乙型肝炎病毒(hbv)和丙型肝炎病毒(hcv)(cabrerar等人，《肝脏病学(hepatology)》2004；40：1062-71.；stoopjn等人，《肝脏病学》2005；41：771-8.；sugimotok等人，《肝脏病学》2003；38：1437-48.)的慢性感染有关。在实施例中，特定t细胞亚群的升高可以通过不适当地抑制记忆t细胞应答而导致感染的延长。在实施例中，本文所提供的组合物用于特异性扩充特定的t细胞亚群并用于治疗感染性疾病。
在实施例中，感染性疾病是由与病原体的直接接触引起的，并且在人与人之间、动物与人之间或从母亲向未出生的孩子传播。
在实施例中，感染性疾病通过间接接触传播，例如，通过与如门把手、桌子、柜台或水龙头把手等被感染表面接触而传播。在实施例中，感染性疾病通过昆虫叮咬或食物污染而传播。某些自身免疫疾病(如hiv或aids)和一些癌症可以增加对感染性疾病的敏感性。某些抑制免疫系统的治疗方案也可以增强对感染性疾病的敏感性。感染性疾病的实例包含但不限于：天花、疟疾、肺结核、斑疹伤寒症、瘟疫、白喉、伤寒、霍乱、痢疾、肺炎。
在实施例中，t细胞的扩充可以用于治疗感染性疾病状态。在实施例中，患有感染的患者对感染剂没有足够的免疫力。在实施例中，本文所提供的方法用于从对特定感染剂具有免疫力的供体扩充异源t记忆细胞，并用于过继t细胞转移。在实施例中，然后可以将来自经历过感染剂的供体的外部扩充的t细胞输注到患有感染的患者中。在实施例中，以1×105个、1×106个、1×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个、1×1011个、5×1011个或1×1012个细胞向受试者施用t细胞。在实施例中，感染性抗原组分供体记忆t细胞有助于在患者体内建立自体的免疫应答。
在实施例中，感染性疾病的治疗包含分别扩充自体的或异源th17细胞以用于再输注或过继细胞转移。在实施例中，可以从患者分离的血液或组织中外部扩充t细胞。在实施例中，然后可以向患者输注这些扩充的t细胞以帮助b细胞诱导分泌针对特定感染抗原(例如，链球菌m蛋白，奈瑟氏皮利(neisseriapilli)、伯氏疏螺旋体脂蛋白vise(borreliaburgdorferilipoproteinvise)、b.假单胞菌多糖抗原(b.pseudomalleipolysaccharideantigens)、烟曲霉半乳甘露聚糖(aspergillusfumigatusgalactomannan)或f.土拉弗朗西斯菌脂多糖(f.tularensislipopolysaccharide))的抗体。在实施例中，以1×105个、1×106个、1×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个、1×1011个、5×1011个或1×1012个细胞向受试者施用t细胞。
对于以上列出的许多疾病状态，建议使用现有治疗方法。使用本文所公开的方法和组合物扩充的t细胞亚群在一些情况下可以用作单独的替代疗法或与其它已知疗法结合。可以在施用其它疗法之前、同时或之后施用t细胞疗法。
在实施例中，本文所提供的方法与疫苗一起使用以增强抗原的反应性并增强体内效应。在实施例中，将组合物(例如，包括t细胞)和在体内增强t细胞的组合物(例如il-2、il-4、il-7、il-10、il-12和/或il-15)一起向患者施用。通过本文所提供的方法扩充的t细胞可以通过携带所需的感兴趣的核酸序列并潜在地归巢到癌症、疾病或感染的部位而充当如上所述的基因治疗的载体。因此，通过本文所提供的方法扩充的细胞可以与疫苗、一种或多种细胞因子、一种或多种治疗性抗体等组合递送给患者。实际上，可以从更健壮的t细胞群体中受益的任何疗法都可以与本文所提供的组合物结合使用。
细胞产生和疫苗
如本文其它地方所示，本文提供了用于在含有环糊精和一种或多种脂质的培养基中培养细胞(例如，人细胞、人二倍体细胞、灵长类二倍体细胞、用于病毒产生的细胞、t细胞等)的组合物和方法。此类细胞可以用于产生如蛋白质、核酸分子等产物，以及如病毒和vlp等组装材料。
细胞培养物(例如，动物细胞培养物，如哺乳动物细胞培养物)可以用于表达重组蛋白产物。通常，如动物或哺乳动物细胞等细胞可以在培养基中表达和分泌，或者可以经基因工程化以表达和分泌大量的特定蛋白质，更特别地，感兴趣的糖蛋白。应当理解，宿主细胞产生的糖蛋白对于宿主细胞可以是内源的或同源的。可替代地，通常，糖蛋白对于宿主细胞可以是异源的，即，异质的，例如，人糖蛋白可以由例如中国仓鼠卵巢(cho)宿主细胞产生和分泌。适当糖基化的重组蛋白产物作为治疗和预防产物在医学和临床上越来越重要。生物产物的期望目标是开发可靠、经济、有效的细胞培养工艺，同时提高具有高产物质量的最终糖蛋白产物的浓度，所述浓度可以例如通过所产生糖蛋白的唾液酸含量来确定。因此，本文提供了用于细胞培养和产生蛋白质(例如，重组蛋白质)的组合物和方法。
一旦鉴定出用于产生蛋白质的细胞或克隆，就可能需要调整培养基或补充组分，并且另外，可能需要操纵各种工艺参数以增加细胞和/或蛋白质的滴度，和/或提高蛋白质质量(糖基化水平)。参数操纵的实例可以包含：大规模培养容器的使用；培养条件的改变，如温育温度、溶氧浓度、ph、温度变化等。此外，延长的运行时间的提升可以提高最终产物的浓度，同时保持较高的蛋白质质量。
培养基中表达的蛋白质或糖蛋白的聚集可以在生物制造过程期间的任何阶段出现。在细胞培养物中，分泌的蛋白质可能会暴露在不利于蛋白质稳定性的条件下；但更常见的是，大量蛋白质的积累可能由于未折叠的蛋白质分子之间的相互作用，或者由于负责适当折叠的分子伴侣对初生肽链的识别效率低下而导致细胞内聚集。此类聚集可以导致患者施用上的不良副作用，因此设计了昂贵的下游加工步骤以去除较高分子量物种。降低聚集水平的一种方法是仔细调整关键的工艺参数，并鉴定会破坏聚集的细胞培养添加剂，例如，温度转变到31℃、渗透压在420mosm/kg以上、以100rpm和0.04％(w/v)的消泡剂搅拌(《生物技术与生物工程(biotechnolbioeng.)》2018五月；115(5)：1173-1185)。
培养物中细胞碎片的存在和死亡细胞的含量可能会对下游蛋白终产物的分离和/或纯化产生负面影响。使细胞能够在培养物中较长时间保持存活，同时可以减少细胞蛋白和酶(例如，细胞蛋白酶和唾液酸酶)对培养基的污染，这有助于降解和最终降低糖蛋白质量。下游蛋白质纯化问题可能是维持培养物中高细胞存活率的又另一个原因。
使用本文所提供的组合物和方法的细胞培养可以用于产生疫苗。用于病毒产生的细胞包含人二倍体细胞，如mrc-5、mrc-5rcb、wi-38、2bs、walvax-2、kmb-17、imr-90、imr-91等，以及非人二倍体细胞，如vero(非洲绿猴肾)或mdck(马丁达尔比犬肾)。昆虫细胞(如sf9细胞)也可以使用本文所提供的组合物和方法生长。另外，昆虫细胞还可以用于产生例如重组蛋白和病毒。
适用于疫苗(例如，病毒产生、vlp产生等)的细胞系将通常来源于哺乳动物(例如，vero细胞、马、牛(例如，mdbk细胞)、绵羊、狗(例如，来自狗肾脏的mdck细胞)、猫和啮齿动物(例如、仓鼠细胞，如bhk21-f、hkcc细胞或中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞))，但也可以来源于非哺乳动物(例如，鸡细胞、昆虫细胞，如sf9细胞等)。
上述细胞培养基和/或补充剂组合物可以用于培养可以被病毒感染的细胞。为了用病毒感染的细胞，将具有补充剂或没有补充剂的合适的培养基持续几天添加到细胞。可以在细胞融合或接近融合的生长中进行病毒核酸(dna或rna)的转染，并且可以将含有核酸的转染培养基直接添加到细胞。在一些方法中，在数小时(例如在37℃下温育18小时)之后，需要更换培养基。在使用血清进行生长的条件下，可以添加含血清的培养基以停止转染。在转染之后约八天，可以收集细胞上清液(含有病毒)以采集病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段。
在制备大规模产生细胞以用于产生疫苗之前，可以对细胞进行以下测试：i)杀病毒剂；ii)通过检测对指示剂细胞系的细胞病变效应来产生外援因子。
为了产生大量用于产生以下的疫苗的产物：病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或构成疫苗一部分的病毒片段，可以在由特殊玻璃或塑料制成的培养皿、滚瓶、试管、roux烧瓶上通常以固定方式扩充细胞，或根据制造商的说明在微载体珠上扩充。细胞可以半连续培养(例如，可以有限传播的二倍体细胞，例如，hek(人胚肾)细胞、mrc-5、wi-38细胞)，或者可以连续培养(例如，永生的并且可以无限传播的转化的细胞系；例如，hela、vero、hep-2、llc-mk2、bgm等)。
有限生命的半连续细胞系通常为二倍体并保持一定程度的分化。此类细胞系在约三十个分裂周期后衰老的事实意味着需要建立一个主库和工作库系统以便长期维持此类细胞系。
连续细胞系可以无限期繁殖，因为它们已经转化为肿瘤细胞。肿瘤细胞系通常源自实际的临床肿瘤，但也可以使用病毒致癌基因或化学治疗诱导转化。转化后的细胞系的优点是具有几乎无限的可用性，但是缺点是几乎没有保留原始体内特性。
可以在合适的培养条件下扩充细胞以用于细胞生长并维持存活率，例如，对于大多数在37℃下，5％co2细胞。可以用病毒接种或感染细胞以优先获得0.01moi。在一些实例中，接种可能会继续进行，而无需进一步更换培养基或补充剂。
可以使用标准计数技术(如使用手动血细胞计数器或使用细胞计数仪)确定在扩充之后存在的细胞数量。病毒滴度还可以通过连续稀释结合噬菌斑测定进行测量。为了确定病毒滴度是否获得正确的克隆，可以对病毒核酸进行提取并测序。
本文提供了用于生长细胞(例如，人细胞、人二倍体细胞、灵长类二倍体细胞、用于病毒产生的细胞、t细胞等)的方法，所述细胞可以被病毒感染以产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段。此类方法可以包含用于培养二倍体细胞群体的方法。步骤可以包含：使细胞与包括环糊精-脂质的培养基或包括环糊精-脂质的补充剂接触，所述培养基增加了：细胞的生长、细胞的活细胞密度、病毒感染的细胞的病毒滴度或其组合。由此培养的细胞可以用于在无血清条件下产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段。可替代地，可以用病毒感染的细胞/或用衍生自病毒的核酸转染细胞。
由上述感染的细胞产生的病毒可以是动物病毒、植物病毒或噬菌体。这些病毒可以包含但不限于：水痘带状疱疹病毒(vzv)、风疹、麻疹、流行性腮腺炎、甲型肝炎、腺病毒、脊髓灰质炎、轮状病毒、鼻病毒、天花、水痘、黄热病、乳头瘤病毒、埃博拉病毒、hiv、疱疹病毒、巨细胞病毒、粘液病毒、副粘病毒、肠道病毒、呼吸道合胞体病毒、狂犬病或水疱性口炎病毒(vsv)和登革热病毒；和/或病毒粒子可以源自细小病毒科、逆转录病毒科、黄病毒科、噬菌体等。
用于病毒转染或疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸、病毒片段产生的细胞类型可以是动物细胞。动物细胞可以是牛细胞、犬细胞、猫细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、灵长类细胞或人细胞。具体来说，动物细胞可以是二倍体细胞。或者细胞可以选自由以下组成的群组：mrc-5、mrc-5rcb、mrc-9、wi-38、2bs、walvax-2、imr-90、imr-91、kmb-17、hut系列细胞、张氏肝细胞、u937、mdck、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero和前述细胞的任何克隆。
可以连续或半连续培养细胞。另外，可以将细胞培养为贴壁培养物或在微载体上培养。每种细胞类型可以有具体的培养基和/或基础培养基要求。使用包含但不限于代谢分析和/或实验设计(doe)原理的技术来确定在本领域中常规施用的合适的基础培养基。一种产生用于培养例如二倍体细胞的无血清细胞培养基的典型方法，其可以包括混和(i)基础培养基；以及(ii)包括环糊精和至少一种脂质的补充剂；或(ii)适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂。补充剂可以进一步包括生长因子。可以将细胞与含有上述补充剂的cd(环糊精-脂质)一起进行无血清培养，以用于病毒转染或疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸、病毒片段产生。
本文提供了用于补充细胞培养基(用于培养例如二倍体细胞)的系统，所述系统可以包括(i)一种或多种不同的环糊精，其中每种环糊精在单独的容器中；以及(ii)两种或更多种不同的脂肪酸，其中每种脂肪酸在单独的容器中。
本文提供了用于培养细胞或细胞系的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)细胞群体；(ii)包括环糊精和至少一种脂质的无血清细胞培养基。另一种试剂盒可以包括(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)包括环糊精和至少一种脂质的补充剂。又另一种试剂盒可以包括：(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂。本文所提供的试剂盒可以用于细胞的无血清培养，所述细胞用于病毒转染的，或用于制备疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸、病毒片段产生。这些试剂盒可以用于培养动物细胞，其中动物细胞可以是牛细胞、猫细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、灵长类细胞或人细胞，或者其中动物细胞是二倍体细胞；或者其中细胞选自由以下组成的群组：mrc-5细胞、mrc-5rcb细胞、mrc-9细胞、wi-38细胞、2bs细胞、walvax-2细胞、imr-90细胞、imr-91细胞、kmb-17细胞、hut系列细胞、张氏肝细胞、u937细胞、mdck细胞、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero细胞和前述细胞的任何克隆。
另外，可以在培养基中培养细胞，洗涤细胞，然后与培养基重新接触。然后可以直接或通过细胞裂解从培养基中获得病毒、vlp和/或病毒组分。当细胞与编码一种或多种病毒组分的病毒或核酸分子接触时，可以使细胞与病毒或核酸分子在任何步骤接触，包含洗涤步骤或在洗涤步骤与重新接触培养基之间。另外地，可以使用具有整合到其基因组中的编码病毒或病毒组分的核酸的细胞。
可以通过上述方法或不需要洗涤步骤的类似方法产生疫苗。当疫苗组分由整合到产生细胞基因组中的核酸编码时，并且当核酸(包含病毒)可以被培养物中的细胞吸收时，通常不需要清洗步骤。
如本文所述培养的细胞可以在核酸摄取之前(例如，通过病毒接种)在第一培养基中培养，并且在核酸摄取时和/或之后在第二培养基中培养。在细胞摄取核酸(例如，通过病毒感染)之后，可以在第二细胞培养基中培养细胞，所述第二细胞培养基可以是与第一培养基相同的培养基或是不同的培养基。例如，在一些实施例中，可以在第一细胞培养基中培养细胞，然后可以去除第一细胞培养基，可以任选地漂洗细胞(例如，用如pbs等水性缓冲溶液)，并且可以将第二培养基添加到细胞。在一些实施例中，第二培养基可以含有核酸(例如，病毒)以供细胞摄取。在一些实施例中，第一培养基和第二培养基是相同的培养基(例如，具有相同的组分，在一些实施例中其不必是相同的物理培养基)。在其它实施例中，第一培养基和第二培养基是不同的(例如，具有不同的组分)。
用于病毒产生的细胞包含人二倍体细胞，如mrc-5、mrc-5rcb、wi-38、2bs、walvax-2、kmb-17、imr-90、imr-91等，以及非人二倍体细胞，如vero(非洲绿猴肾)或mdck(马丁达尔比犬肾)。昆虫细胞(如sf9细胞)也可以使用本文所提供的组合物和方法生长。另外，昆虫细胞还可以用于产生病毒。
可以通过本文所述的方法和使用组合物产生的病毒包含水痘带状疱疹病毒(vzv)、风疹、麻疹、mmr、甲型肝炎、腺病毒、脊髓灰质炎、轮状病毒、狂犬病或水疱性口炎病毒(vsv)和登革热病毒。
本文所提供的组合物和方法还可以用于产生病毒样颗粒(vlp)。本文进一步提供例如本文所述产生的vlp。vlp可以源自乙型肝炎病毒，并由小的hbv衍生表面抗原(hbsag)构成。vlp可以由多种病毒家族的组分产生，包含细小病毒科(例如，腺相关病毒)、逆转录病毒科(例如，hiv)、黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒)和噬菌体(例如，qβ、ap205)。
如本文其它地方所述，本文所提供的组合物和方法还可以用于产生疫苗。可能产生的疫苗类别包含灭活疫苗、减毒疫苗、类毒素疫苗、亚单位疫苗和结合疫苗。灭活疫苗是不能诱导疾病(例如，通过化学、热或放射治疗)的致病因子或与之相关的药剂的疫苗。减毒疫苗通常含有活的或可复制的药剂(1)对其毒性的性质已经被破坏，或(2)使用密切相关但危险性较小的生物体产生广泛的免疫应答。尽管大多数减毒疫苗是病毒性疫苗，但有些是细菌性的。类毒素疫苗是由会引起疾病的灭活的有毒化合物而不是微生物制成。并非所有类毒素都用于病毒和微生物。例如，使用响尾蛇(cotalusatrox)(即，西部菱纹响尾蛇)类毒素来接种个体以抵抗响尾蛇叮咬。亚单位疫苗由能够引起保护性免疫应答的致病因子的抗原片段构成。例如，抗乙型肝炎病毒的亚单位疫苗仅由此病毒的表面蛋白构成。
本文所提供的细胞培养基和/或补充剂组合物可适合于培养上述任何细胞。这些细胞培养基和/或补充剂组合物通常将包括基于环糊精的脂质组合物。本文提供的培养基组合物可以具有至少两种：(i)一种包括细胞培养组分、环糊精和至少一种脂质，或(ii)一种包括基础细胞培养基和包括基于环糊精基脂质的单独补充剂。例如，基于环糊精的脂质补充剂可以包括亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇和环糊精。
一些示例性的基于环糊精的脂质补充剂描述于本申请的实施例1：表1、2和3中，有时也分别称为cd(环糊精-脂质)补充剂1、2和3。另外，称为二倍体增长补充剂(diploidgrowthsupplement)的含环糊精-脂质的补充剂是可商购的(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)目录号a39695sa)。因此，培养基组合物可以包括(i)合适的基础细胞培养基(如可商购(赛默飞世尔科技公司，目录号a39693dk)，和(ii)适当稀释度的如表1、表2和表3(实例1)所述的补充剂。基础培养基可以含有蛋白质、维生素、矿物质和氨基酸，并且可以任选地富含胎牛血清使得其能够生长。然而，在许多实例中，基础培养基可以与无血清补充剂(如包括基于环糊精的脂质(如上述脂质(包含上述或实例1：表1、2和3中的那些脂质))的补充剂(二倍体生长补充剂(赛默飞世尔科技公司，目录号a39695sa))组合，从而使得细胞能够在无血清条件下生长。为了获得最佳生长，可以根据要培养的细胞系适当稀释cd补充剂或二倍体生成补充剂。例如，在一个具体实例中，mrc-5二倍体细胞在具有1∶500或1∶2000稀释度的cd补充剂1或cd补充剂2(参见实例1)的二倍体基底sfm(diploidbasalsfm)(赛默飞世尔科技公司，目录号a39693dk)中生长(另请参见本申请的图51和表45)。
用于培养产生病毒或疫苗等的细胞的细胞培养补充剂可以包括作为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精的环糊精。在一个实施例中，环糊精可以是甲基化的。在另一个实施例中，环糊精是甲基-β-环糊精。在特定实施例中，细胞培养基或补充剂包括的环糊精的水平为约10μm到约200μm。
用于培养产生病毒或疫苗等的细胞的细胞培养补充剂可以包括胆固醇，其中胆固醇可以是合成性胆固醇，或者可以以约5μm到约30μm的水平存在。在一个实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是多不饱和ω-6脂肪酸。在另一个实施例中，至少一种其它ω-6脂肪酸是花生四烯酸。在特定实施例中，多不饱和ω-6脂肪酸选自由以下组成的群组：花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸。
试剂盒和培养基补充剂系统
在一个方面提供了一种用于补充t细胞培养基的系统，所述系统包含：(i)两种或多种不同的环糊精，其中每种环糊精在单独的容器中；(ii)两种或更多种不同的脂质(例如，脂肪酸)，其中每种脂质在单独的容器中。在另一个方面提供了一种用于补充t细胞培养基的系统，所述系统包含：(i)两种或多种不同的环糊精和两种或更多种不同的脂质(例如，脂肪酸)的组合，其中每种环糊精在单独的容器中，其中每种脂质在单独的容器中；和(ii)2-dg。在又另一个方面提供了一种用于补充t细胞培养基的系统，所述系统包含：2-dg。在实施例中，两种或更多种不同的环糊精包含本文所公开的环糊精的任何组合。在实施例中，两种或更多种不同的脂质包含本文所公开的脂质(例如，脂肪酸)的任何组合。
在一些方面，本文提供了用于培养t细胞的试剂盒，所述试剂盒包含无血清培养基、环糊精、一种或多种脂质和/或2-dg。
试剂盒还可以包含使用试剂盒的书面说明，如洗涤步骤、培养条件和将分离的t细胞与本文提供的用于选择性扩充特定t细胞亚群的组合物一起温育的持续时间的说明。
混合的t细胞群体的来源的实例
在实施例中，混合的t细胞群体的起始来源是可以从受试者分离的血液(例如，循环血液)。在实施例中，可以从一种或多种单位血液或通过单采血液成分术或白细胞去除术获得循环血液。在实施例中，单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包含t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。可以从多种来源获得t细胞，包含(但不限于)血液单核细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、淋巴结组织、肠道相关淋巴样组织、黏膜相关淋巴样组织、脾脏组织或任何其它淋巴组织和肿瘤。可以从t细胞系以及自体的或同种异体来源获得t细胞。还可以从异种异体来源，例如，从小鼠、大鼠、非人灵长类和猪获得t细胞。
在实施例中，可以使用技术人员已知的任何数目的技术(例如，ficoll分离)从收集自受试者的单位血液中获得t细胞。可以从受试者的循环血液中分离t细胞。在实施例中，可以通过单采血液成分术或白细胞去除术从受试者获得血液。在实施例中，单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包含t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在实施例中，在暴露于致敏组合物以及随后的活化和/或刺激之前，从受试者获得t细胞来源。在实施例中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并且将细胞置于适合的缓冲液或培养基中以供后续处理步骤。在本发明的实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。在实施例中，洗涤溶液缺乏钙并且可能缺乏镁或可能缺乏许多(如果不是全部的话)二价阳离子。如本领域的普通技术人员将容易理解的，可以通过本领域的技术人员已知的方法来完成洗涤步骤，如根据制造商的说明使用半自动“流通式”离心机(例如，cobe2991细胞处理器，巴克斯特公司(baxter))。在实施例中，在洗涤之后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如无钙(ca)、无镁(mg)的pbs。在实施例中，可以去除单采血液成分术样品的不期望组分，并且细胞直接重悬于培养基中。
在实施例中，通过裂解或去除红细胞并消耗单核细胞从外周血淋巴细胞中分离t细胞，例如，通过
在实施例中，可以为cd3 细胞阳性选择t细胞。可以使用本领域的技术人员已知的任何选择技术。一个非限制性实例是流式细胞分选。在另一个实施例中，可以通过与抗cd3珠温育来分离t细胞。一个非限制性实例是抗cd3/抗cd28共轭珠，如
在实施例中，可以基于是否存在一种或多种标志物通过选择来生成t细胞亚群。例如，可以基于对cd4 、cd25 、cd127neg/low和任选地，foxp3 的细胞的选择从混合群体中获得treg细胞。在实施例中，treg细胞可以是foxp3-。在此实例中，选择实际上是指基于一个或多个可定义的特性来“选择”细胞。另外，选择可以是阴性的或阳性的，因为它可以针对具有一种或多种特性(阳性)的细胞，或者对于不具有一种或多种特性(阴性)的细胞。
关于treg细胞，出于说明的目的，可以通过这些细胞与具有附着在其上与cd4和/或cd25结合的抗体的表面(例如，磁珠)结合以及非treg细胞与具有附着在其上结合cd127的抗体的表面(例如，磁珠)结合而从混合群体中获得这些细胞。作为一个具体实例，可以将结合有与cd3结合的抗体的磁珠用于分离cd3 细胞。一旦释放，然后可以使获得的cd3 细胞与结合有与cd4结合的抗体的磁珠接触。然后可以使所得的cd3 、cd4 细胞与结合有与cd25结合的抗体的磁珠接触。然后可以使所得的cd3 、cd4 、cd25 细胞与结合有与cd127结合的抗体的磁珠接触，其中收集的细胞是不与珠结合的细胞。
在实施例中，可以同时使用多种特性以获得t细胞亚群(例如，treg细胞)。例如，还可以使用含有结合有两个或多个细胞表面标志物的抗体的表面。作为一个具体实例，可以通过将这些细胞与具有附着到其上的与cd4和cd25结合的抗体的表面结合而从这些细胞的混合群体中获得cd4 、cd25 细胞。同时选择多个特性可能会导致大量不期望的细胞类型与所期望的细胞类型“共同纯化”。这是因为，使用上述具体实例，除了cd4 、cd25 细胞之外，还可以获得cd4 、cd25-和cd4-、cd25 的细胞。
流式细胞术对于基于所期望的特性的细胞分离特别有用。可以基于与结合感兴趣细胞的分子(例如，天然配体，如与cd127结合的il-7，对cd25具有特异性的抗体等)相关的可检测标记分离细胞。因此，与可以通过流式细胞术系统检测和/或分化的细胞组分结合的配体可以用于纯化/分离具有具体特性的t细胞。此外，可以通过流式细胞术同时确定存在或不存在多种特性。
本文包含用于获得一个或多个t细胞亚群的成员的方法，其中所述t细胞亚群的成员通过具体特性来鉴定并且与具有不同于这些特性的细胞分离。可以用于本发明的方法的特性的实例包含存在或不存在以下蛋白质：cd3、cd4、cd5、cd8、cd11c、cd14、cd19、cd20、cd25、cd27、cd33、cd34、cd45、cd45ra、cd56、cd62l、cd123、cd127、cd278、cd335、ccr7、k562p、k562cd19和foxp3。
实例
以下实例说明了本发明的某些具体实施例，但并不意味着限制本发明的范围。
通过以下实例和详细的方案来进一步说明本文的实施例。然而，实例仅旨在说明实施例，而不应被解释为限制本文的范围。贯穿本申请引用的所有参考文献、公开专利和专利申请的内容通过引用结合在此。
实例1：实例2-4的方法和结果
材料与方法
cd补充剂调配物：对于每1lcd补充剂，将0.5l制造级水在4℃下预冷却，并且将另外的0.5l加热到≥80℃。将合成性胆固醇和粉末状脂肪酸(肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸-如果适用的话)添加到加热的水并混合最多10分钟。在混合的同时，缓慢地添加36g甲基-β-环糊精，从而允许每次添加稍微分层放置在表面上而不接触槽的圆周。将槽盖上盖子以维持升高的温度至少60分钟。如前所述缓慢添加54g甲基-β-环糊精、盖上盖子并混合至少30分钟。降低混合速度直到泡沫消散。使用预冷却的水进行qs并产生总生产体积(1l)并且混合直到温度达到＜25℃。添加剩余的脂质(花生四烯酸、亚麻酸、油酸和棕榈油酸-如果适用的话)、盖上盖子并混合至少90分钟。使用1l
细胞培养：t细胞分离：从hemacare公司获得来自正常供体的去识别的冷冻单采袋。用
t细胞活化和扩充：用
表型：用cd补充剂或5％人ab血清中的一种将原代人t细胞扩充10天。通过磁分离从2×106个细胞中去除
细胞因子谱：用
结果
表1-3总结了在细胞(例如，t细胞、二倍体细胞)中配制和测试的三种基于环糊精的补充剂。简而言之，将胆固醇溶解于热水中，随后缓慢添加甲基-β-环糊精和脂肪酸。监测溶液直到外观透明并无菌过滤。修改cd补充剂1(表1)的调配物，同时在cd补充剂2和cd补充剂3(分别是表2和3)中保持相同的脂肪酸：胆固醇摩尔比。cd补充剂2的调配物基于脂质浓缩物中的脂肪酸浓度(g/l)，而cd补充剂3的调配物基于通常在牛血清白蛋白中发现的脂肪酸浓度(g/l)。化学定义脂质浓缩物(赛默飞世尔科技公司，目录号11905-031)，缩写为“脂质浓缩物”。
图1-6是一系列图表，表明与基于环糊精的补充剂相比，含有基于乳剂的脂质浓缩物的无血清培养基对人t细胞扩充的效果欠佳。用
图7-10是一系列图表，表明与在含5％人ab血清的培养基中培养的t细胞相比，在用cd补充剂1、2和3培养的t细胞中，增强了中心记忆亚群的储存。
细胞生长和存活率：t细胞扩充表达为累积群体倍增数或累积活t细胞随时间(天)的变化。结果表示至少3个独立实验。表4-9量化了在图1-6中显示的图形结果。结果表明，与通过以选定浓度的cd补充剂1、2和3在无血清培养基中的基于环糊精的补充剂相比，脂质浓缩物(1∶100)提供欠佳的t细胞扩充(表达为累积群体倍增数)(图1和2)。图3和4示出与图1和2相同的生长数据，但以累积活t细胞随时间(天)的变化表示。到第12天，当将细胞扩充表达为累积细胞数时cd补充剂1、2和3(1∶500)之间的性能差异比表达为累积群体倍增数更明显。图5和6描绘了与脂质浓缩物/无脂质补充和其它浓度的cd补充剂1、2和3相比，cd补充剂1、2和3(1∶500)维持了增加的t细胞存活率。
表型：图7描绘了用于分化表型分析的门控策略。图8和表10描绘了与扩充之前(第0天)的原始亚群分布相比，cd4 /cd8 比率的平均变化。图9和10描绘了在5％人ab血清和cd补充剂1、2和3中扩充的cd4 t细胞和cd8 t细胞的分化状态。结果表明，用5％人ab血清培养的cd4 和cd8 t细胞失去ccr7 /cd62l 表型，并积累了ccr7-/cd62l-表型，这表明细胞应激和营养缺乏。可替代地，用cd补充剂1、2和3培养的cd4 和cd8 t细胞避免了ccr7-/cd62l-积累。
细胞因子谱：用
实例2：在含有脂质的无血清培养基中培养t细胞
脂质似乎是在无血清培养基中生长的t细胞的氧化磷酸化(oxphos)来源，是最佳t细胞扩充所需的。用
实例3：含有cd补充剂1的无血清培养基优先扩充cd8 t细胞亚群
对含有cd补充剂1的无血清培养基中优先扩充的cd8 t细胞亚群进行分析。用
实例4：在含有cd补充剂1、2和3的无血清培养基中扩充t细胞表型
用
实例5：含有cd补充剂1的无血清培养与含血清的培养基中的细胞因子谱
用
实例6
材料/方法
2-脱氧-d-葡萄糖制备：2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg，164.16g/mol)由(阿克罗斯有机物公司(acrosorganics)，目录号111980-250)制造。2-dg溶液是在无菌过滤水中以100mm的原液浓度制备的，然后在eppendorf管中以每管的最终体积为1ml等分。
细胞培养：t细胞分离：从范奈斯(vannuys)的hemacare公司的来自正常供体的去识别的冷冻单采袋，目录号ca91406。用
t细胞活化和扩充：用
对于一些研究，使用untouched人cd8 和cd4 t细胞试剂盒通过阴性选择从pbmc中分离出cd8 和cd4 t细胞。使用cd45ra纳米珠(美天旎公司)通过阳性选择从富集的t细胞中分离出原初和非原初t细胞。
表型：使用或者不使用2-dg和5％人ab血清将原代人t细胞扩充10天。通过磁分离从2×106个细胞中去除
细胞因子谱：用
结果：
细胞生长和存活率：t细胞扩充表达为累积群体倍增数。结果表示至少3个独立实验。表12、14-15、18-19、22-23分别量化了在图12、15-16、19-20、24-25中显示的图形结果。图12的结果表明，具有2-dg的补充剂不会影响t细胞生长。与无血清培养基中较高的浓度相比，较低浓度的2-dg提供次佳的t细胞扩充(表达为累积群体倍增数)。4mm2-dg扩充到约6倍群体。在实施例中，2-dg的浓度为4mm或更少。在实施例中，2-dg的浓度为0.5mm或更少。在实施例中，2-dg的浓度为0.25mm或更少。
图15和16表明原初和非原初t细胞的生长曲线。细胞扩充表达为累积群体倍增数。在使用和没有使用4mm2-dg的情况下，在含有5％人血清的x-vivotm15中扩充细胞12天。用2-dg补充不会影响任何一种细胞类型的生长。
图15和16表明原初和非原初t细胞的生长曲线。细胞扩充表达为累积群体倍增数。在使用和没有使用4mm2-dg的情况下，在含有5％人血清的x-vivotm15中扩充细胞12天。用2-dg补充不会影响任何一种细胞类型的生长。
以两种不同的cd4 ∶cd8 比(5∶1和10∶1)将cd4 和cd8 t细胞混合，以确定2-dg对cd8 t细胞的作用。在使用和没有使用2-dg的所有条件下扩充到约6到7倍群体。结果展示，在两种混合物中2-dg处理对细胞生长的影响相似。(图19和20)。
图25示出与图24相同的生长数据，但具有最佳条件。在不同的时间点(第0、3、5、7天)以及每次向细胞进料时，用0.25mm2-dg培养t细胞。在所有条件下生长到约6到7倍群体倍增数。
表型：图13描绘了用于分化表型分析的门控策略。在第0天扩充前，cd8 t细胞的频率以19％开始。在第10天扩充后，在不添加2-dg的情况下，cd8 t细胞群体增长到30％。但是，在使用0.25mm和0.5mm2-dg的情况下，cd8 t细胞群体增加到48％。
图14描绘了与扩充之前(第0天)的原始亚群分布相比的cd8 ∶cd4 比率。结果表明，与第0天相比，cd8 ∶cd4 t细胞比增加约3.2倍。
图17和18示出与扩充之前(第0天)的原始亚群分布相比的cd8∶cd4 比率。结果表明，原初t细胞中cd8 ∶cd4 t细胞比增加了3.4倍，而对非原初t细胞中的影响较小。
图21和表22描绘了与扩充之前(第0天)的原始亚群分布相比，cd4 /cd8 比率的平均变化，所述原始亚群分布表示两个群在扩充之前的频率。与第0天相比，2-dg能够修正cd8 t细胞中的较大缺陷。
图26表示与第0天相比，cd8 ∶cd4 t细胞比的增加倍数。结果示出，仅在第7天用0.25mm2-dg培养t细胞和每次向细胞进料的情况下会导致cd8 t细胞同样增加3倍。
细胞因子谱：
将t细胞扩充12天，并用
实例7
材料/方法
2-脱氧-d-葡萄糖制备：2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg，164.16g/mol)由阿克罗斯有机物公司(赛默飞世尔科技公司的一部分)制造。2-dg溶液是在无菌过滤水中以100mm的原液浓度制备的，然后在eppendorf管中以每管的最终体积为1ml等分。
细胞培养：t细胞分离：来自hemacare公司的来自正常供体的去识别的冷冻单采血液袋。用
t细胞活化和扩充：用
对于一些研究，使用untouched人cd8 和cd4 t细胞试剂盒通过阴性选择从pbmc中分离出cd8 和cd4 t细胞。使用cd45ra纳米珠(美天旎公司)通过阳性选择从富集的t细胞中分离出原初和非原初t细胞。
表型：使用或者不使用2-dg和5％人ab血清将原代人t细胞扩充10天。通过磁分离从2x106个细胞中去除
细胞因子谱：用
结果：
细胞生长和存活率：t细胞扩充表达为累积群体倍增数。结果表示至少3个独立实验。表25、27-28、31、33-34、37-38和40-41分别量化了在图28、31-32、35、38-39、43-44和46-47中显示的图形结果。图28示出了在批量t细胞中2-dg(0、1mm、2mm和4mm)的剂量反应。结果表明，用2-dg补充不会影响t细胞生长。图31和32表明原初和非原初t细胞的生长曲线。细胞扩充表达为累积群体倍增数。在使用和没有使用4mm2-dg的情况下，用5％人血清扩充细胞12天。用2-dg补充不会影响原初t细胞的生长，然而，对非原初t细胞有一定影响。
图35示出了在批量t细胞中2-dg(0.25mm和0.5mm)的小剂量反应。测试了较低浓度的2-dg，因为似乎不同应用需要使用不同浓度的2-dg(按设定比率混合cd4 t细胞与cd8 t细胞)。结果示出，即使补充了较低浓度的2-dg，也不会影响t细胞生长。
在图38和39中，将cd4 和cd8 t细胞以两种不同的cd4∶cd8比(5∶1和10∶1)混合，以确定2-dg对cd8 t细胞的影响。在使用和没有使用2-dg的所有条件下扩充到约6到7倍群体。结果展示，在两种混合物中2-dg处理对细胞生长的影响相似。
图43示出与图17相同的生长数据，但具有最佳条件。在不同的时间点(第0、3、5、7天)以及每次向细胞进料时，用0.25mm2-dg培养t细胞。在所有条件下生长到约6到7倍群体倍增数。
图46和47分别展示了具有2-dg的cd脂质浓缩物1(clcl)和cd脂质浓缩物2(clc2)的剂量响应。结果表明具有和没有2-dg的1∶1000clc1和1∶1000clc2证明了t细胞中的最佳生长。
表型：
图29描绘了用于分化表型分析的门控策略。在第0天扩充前，cd8 t细胞的频率以27％开始。在第10天扩充后，在不添加2-dg的情况下，cd8 t细胞群体增长到38％。但是，在使用4mm2-dg的情况下，cd8 t细胞群体增加到63％。
图30描绘了与扩充之前(第0天)的原始亚群分布相比的cd8 ∶cd4 比率。结果表明，与第0天扩充前相比，4mm2-dg导致cd8∶cd4比率增加4.1倍。
图33和34表示出与扩充之前(第0天)的原始亚群分布相比的cd8∶cd4 比率。结果表明，原初t细胞中cd8∶cd4比率增加了2.4倍，而对非原初t细胞中的影响较小。
图36描绘了用于分化表型分析的门控策略。在第0天扩充前，cd8 t细胞的频率以19％开始。在第10天扩充后，在不添加2-dg的情况下，cd8 t细胞群体增长到30％。但是，在使用0.25mm和0.5mm2-dg的情况下，cd8 t细胞群体增加到48％。来自单个供体的代表。
图37描绘了与扩充之前(第0天)的原始亚群分布相比的cd8 ∶cd4 比率。结果示出，与第0天扩充前相比，在使用0.25mm和0.5mm2-dg的情况下，cd8∶cd4比率增加2.1和2.2倍。来自3个不同供体的代表。
图40和表41描绘了与扩充之前(第0天)的原始亚群分布相比，cd4 /cd8 比率的平均变化，所述原始亚群分布表示两个群在扩充之前的频率。与第0天扩充前相比，2-dg能够修正cd8 t细胞中的较大缺陷。
图45表示与第0天相比，cd8∶cd4比率的增加倍数。结果示出，仅在第7天用0.25mm2-dg培养细胞与在每次进料时用2-dg培养细胞显示出相同的结果，并且两者均导致cd8∶cd4比率增加3倍。这使得将2-dg操纵作为过程开发工具添加到协议中变得更加容易。
图48和49表示与第0天相比，cd8∶cd4比率的增加倍数。结果表明，与第0天扩充前相比，当添加2-dg与clc1时，cd8∶cd4比率增加1.6倍，并且当添加2-dg与clc2时，cd8∶cd4比率增加1.4倍。
细胞因子谱：
将t细胞扩充12天，并用
实例8：培养二倍体细胞以用于含脂质的无血清培养基(sfm)中的疫苗产生
背景
传统上由胎牛血清提供的脂质，对于在无血清培养基中生长的二倍体细胞以及最佳的二倍体细胞扩充也似乎是必需的。
通常，二倍体细胞用于疫苗产生，其可能涉及整个病毒或部分病毒、病毒粒子、病毒蛋白、病毒dna或其片段的产生。已经用于疫苗产生的病毒的实例包含但不限于水痘带状疱疹(vzv)、风疹、麻疹、mmr、甲型肝炎、腺病毒、脊髓灰质炎、轮状病毒、狂犬病或水疱性口炎病毒(vsv)、登革热病毒等。用于疫苗产生的细胞包含人类二倍体细胞，如mrc-5、mrc-5rcb、wi-38、2bs、walvax-2、kmb-17、imr-90、imr-91等，用于内部疫苗制造的其它专有的二倍体细胞系以及非人二倍体细胞，如vero(非洲绿猴肾)细胞等。
疫苗制造商通常在含有10％牛血清的经典培养基中培养二倍体细胞，由于与血清相关的潜在监管和供应链风险，因此希望转向不含血清的调配物。通过代谢物分析和实验设计(doe)原理，为二倍体细胞的“生长”开发了首个无血清培养基(sfm)，也称为二倍体生长sfm。使用二倍体生长sfm的优点是无血清，这支持将细胞从解冻直接恢复到无适应性扩充，可以支持先前在含血清的培养基中冷冻的二倍体细胞的恢复，同时还能与含血清的培养基的性能相当，因为产生病毒的要求与细胞生长的要求不同，分别优化了二倍体产生培养基，从而产生了无动物来源(aof)的二倍体产生sfm。二倍体生长sfm和aof二倍体产生sfm共同为制造商提供了生产疫苗的机会，而无需担心牛血清白蛋白(bsa)的存在，从而达到了who设定的50ng/剂量bsa限制。通过转向无血清工艺，疫苗制造商可以减少对血清的依赖性，降低生产和纯化成本，并提高产品的一致性和安全性。
材料与方法
下文所述的制备cd环糊精-脂质补充剂的组合物和方法与实例1：cd补充剂调配物的相同。二倍体生长补充剂(赛默飞世尔科技公司，目录号a39695sa)是在有或没有cd环糊精-脂质补充剂的情况下制备的，如下所述。
1.细胞培养
将mrc-5pd19细胞(ecacc，目录号05072101)解冻到二倍体基础sfm(赛默飞世尔科技公司，目录号a39693dk)中，其含有6mml-谷氨酰胺和1％二倍体生长补充剂的-有或没有cd脂质补充剂。为了对照，将mrc-5pd19细胞解冻到memα培养基(赛默飞世尔科技公司，目录号12571-063)，其补充有10％胎牛血清(赛默飞世尔科技公司，目录号10082)、4mml-谷氨酰胺和2g/ld-葡萄糖。细胞用杜氏磷酸盐缓冲盐水(赛默飞世尔科技公司，目录号14190-136)洗涤，并用胰蛋白酶-edta(0.05％)(赛默飞世尔科技公司，目录号25300-054)分离，用2x定义的胰蛋白酶抑制剂(赛默飞世尔科技公司，目录号r-007-100)淬灭，每3-4天进行传代。使用vi-细胞xr分析仪(印第安纳州印第安纳波利斯的贝克曼库尔特公司)进行细胞计数，并在25ml生长培养基中以0.6×106vcd的密度接种，在75cm2的通气式的t型烧瓶中培养3天(康宁公司(corning)，目录号353136)或在25ml生长培养基中以0.3×106vcd的密度接种，在75cm2的通气式的t形烧瓶中培养4天(康宁公司，目录号353136)。
2.病毒产生
对于病毒产生(例如，水痘带状疱疹病毒产生)，将示例性二倍体细胞(例如，mrc-5)以40,000个细胞/cm2接种在二倍体基础sfm(赛默飞世尔科技公司，目录号a39693dk)中，其含有6mml-谷氨酰胺和1％的二倍体生产(赛默飞世尔科技公司，目录号a39696sa)，或者对于对照组，在memα培养基中，其补充有10％胎牛血清(赛默飞世尔科技公司，目录号10082)、4mml-谷氨酰胺和2g/ld-葡萄糖。在24小时之后，将培养基分别换成含有6mml-谷氨酰胺的二倍体sfm或含有2％fbs、4mml-谷氨酰胺和2g/ld-葡萄糖的memα。以0.01moi的水痘带状疱疹病毒(
结果
细胞生长和存活率测量
二倍体活细胞密度(vcd)表示为每毫升的活细胞，并示出为二倍体生长sfm与含血清的培养基(memα 10％fbs)中每个细胞系的％对照组，这些结果表示了至少3个独立实验。
下面的图50和表44描绘了与对照memα培养基 10％fbs中每个细胞系的生长相比，mrc-5、wi-38和imr-90细胞系在5代传代中的平均％(vcd)。结果表明，对于mrc-5细胞，其生长几乎与含血清的培养基对照组相当。
下面的图51和表45描绘了在有或没有脂质补充剂的二倍体生长sfm中mrc-5细胞的vcd与在对照memα培养基中生长的mrc-5细胞的比较。另外，进行了2种类型的脂质补充剂比较：1)在“脂质浓缩物”(1∶100和1∶1000)(赛默飞世尔科技公司，目录号11905-031)中和2)在cd补充剂1和2(分别为1∶2000和1∶500)中，其制备在上文实例1中进行了描述。结果表明，与脂浓缩物(1∶100和1∶1000)相比，cd补充剂1和2增加了mrc-5vcd。此外，结果还表明，与含血清培养基中的vcd相比，增加了(基于环糊精的)cd补充剂1和2的mrc-5vcd(图51和表45)。
因此，含有cd脂质补充剂的二倍体sfm产生的二倍体细胞生长与含血清的培养基相当或更好。
下面的图52和表46表明，在二倍体sfm中生长的mrc-5细胞产生的水痘带状疱疹病毒(vzv)产生与在含血清的培养基中生长的细胞相当。
除了培养人二倍体细胞(如上所示)之外，包括二倍体生长补体cd1或cd2的二倍体生产sfm还能够培养非人二倍体细胞，如vero细胞(数据未示出)。
在sfm条件下生长用于病毒产生的细胞的试剂盒
用于疫苗产生的培养细胞(包含二倍体细胞和非二倍体细胞)的示例性试剂盒可能含有试剂盒1和2中所示的以下组分：
试剂盒1由1l二倍体基础培养基 10ml二倍体生长补充剂或10l二倍体基础培养基 100ml二倍体生长补充剂组成。
试剂盒2由1l二倍体基础培养基 10ml二倍体生产补充剂或10l二倍体基础培养基 100ml二倍体生产补充剂组成。
在一些实施例中，仅二倍体生长补充剂可以含有环糊精脂质，而二倍体基础培养基和二倍体生产补充剂不含有环糊精和/或脂质。
这些用于培养产生疫苗的细胞的以下试剂盒可从赛默飞世尔科技公司获得。
液体试剂盒1
液体试剂盒2
在另一个实施例中，二倍体生长补充剂和二倍体生产补充剂两者均可以含有环糊精和/或脂质。
使用在sfm条件下培养二倍体细胞的一些应用
1.对于病毒/疫苗产生，使用以下参考文献中描述的方法和/或方案，所有这些文献均通过引用并入本文。
a)mirchamsy等人，《拉兹研究所档案(arch.inst.razi)》，(1979)31，97-102。生产麻疹和风疹病毒疫苗
b)sanofipasteur，《狂犬病疫苗
c)liu等人，“与在vero细胞中繁殖的病毒相比，mrc-5细胞中传播的登革热病毒的遗传稳定性高”，3：e1810(2008)。
2.为了测试疫苗生产的效力或确定病毒滴度，使用例如在hong，《病毒学期刊(virologyjournal)》(2015)12：101中描述的方法和/或方案，其通过引用并入本文。
3.对于测试：i)杀病毒剂；ii)通过检测对指示细胞系(如mrc-5细胞、vero细胞等)的细胞病变效应的不定因子(参见例如http://www.mds-usa.com/cellcharacter_adventitious.html)，其通过引用并入本文。
4.对于用合适的转染试剂进行转染(参见例如http://www.merckmillipore.com/intershop/web/wfs/merck-jp-site/ja_jp/-/jpy/showdocument-pronet？id＝201708.146)，其通过引用并入本文。
5.对于诊断测试(例如参见cmv：gregory等人，《临床微生物学杂志(journalofclinicalmicrobiology)》，17：605-609(1983)，cmv，狂犬病、单纯疱疹、vsv、回声、鼻病毒(dilnessa等人，《微生物学和现代技术杂志(journalofmicrobiologyandmodemtechniques)》2：102(2007))，其通过引用并入本文)。
6.在细胞模型中(例如，肺癌模型(zuchowska等人，《生物微流体(biomicrofluidics)》11：024110(2017)，通过引用并入本文))。
7.研究染色体不稳定性(参见conry等人，pnas107：15455-15460(2010))；或研究复制性衰老(参见https://www.activemotif.com/catalog/details/40310/wi-38-nuclear-extract)，两者均通过引用并入本文。
其它实施例
虽然已经结合其具体实施方式对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点以及修改都在以下权利要求的范围内。
在此参考的专利和科学文献建立了所属领域的技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利和公开的或未公开的美国专利申请都通过引用而并入。所有出版的外国专利和在此引用的专利申请特此通过引用进行结合。在此以登录号引用的genbank和ncbi提交特此通过引用进行结合。所有在此引用的其它出版的参考文献、文献、手稿和科学文献特此通过引用进行结合。
虽然参考其优选的实施方案已经具体地展示和描述了本发明，本领域的技术人员将会理解的是，在不脱离由所附权利要求书涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出不同的在形式和细节上的改变。
本发明的示例性主题由以下条款表示：
条款1.一种组合，其包括(i)t细胞群体；以及(ii)包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基。
条款2.根据条款1所述的组合，其中所述至少一种脂质是胆固醇、脂肪酸、脂肪酸酯、磷脂或甘油脂。
条款3.根据条款2所述的组合，其中所述脂肪酸是饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸。
条款4.根据条款2或3所述的组合，其中所述脂肪酸是ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸或ω-9脂肪酸。
条款5.根据条款2到4中任一项所述的组合，其中所述脂肪酸是亚油酸。
条款6.根据条款5所述的组合，其进一步包括亚麻酸。
条款7.根据条款6所述的组合，其中所述亚麻酸是α-亚麻酸、γ-亚麻酸或α-亚麻酸和γ-亚麻酸。
条款8.根据条款5到7中任一项所述的组合，其进一步包括花生四烯酸。
条款9.根据条款5到8中任一项所述的组合，其进一步包括肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸或硬脂酸。
条款10.根据条款1到9中任一项所述的组合，其中所述至少一种脂质是至少2、3、4、5、6、7或8种不同的脂肪酸。
条款11.根据条款1到10中任一项所述的组合，其中所述至少一种脂质是2、3、4、5、6、7或8种不同的脂肪酸。
条款12.根据条款1到11中任一项所述的组合，其中所述至少一种脂质是
(a)亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸或硬脂酸中的任何一种；
(b)亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸中的2种、3种、4种、5种、6种或7种；
(c)亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸；
(d)饱和脂肪酸，并且所述饱和脂肪酸为丁酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸或蜡酸；
(e)单不饱和脂肪酸，并且所述单不饱和脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸或神经酸；
(f)多不饱和脂肪酸，并且所述多不饱和脂肪酸是十六碳三烯酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、米德酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十一碳五烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳四烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳五烯酸或二十四碳六烯酸；
(g)ω-3脂肪酸，并且ω-3脂肪酸为十六碳三烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸，二十一碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸或二十四碳六烯酸；
(h)ω-6脂肪酸，并且ω-6脂肪酸为亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十四碳四烯酸或二十四碳五烯酸；或者
(i)ω-9脂肪酸，并且ω-9脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸或米德酸。
条款13.根据条款1或2所述的组合，其中所述至少一种脂质是胆固醇。
条款14.根据条款13所述的组合，其中所述胆固醇是合成性胆固醇。
条款15.根据条款1到14中任一项所述的组合，其中所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。
条款16.根据条款1到15中任一项所述的组合，其中所述环糊精是甲基化的。
条款17.根据条款16所述的组合，其中所述环糊精是甲基-β-环糊精。
条款18.根据条款1到16中任一项所述的组合，其中所述环糊精是2-羟丙基-β-环糊精、磺基丁基醚-β-环糊精、2-羟丙基-γ-环糊精、2，6-二甲基-α-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、羟乙基-β-环糊精、β-环糊精多硫酸酯、三甲基β-环糊精或γ-环糊精多硫酸酯。
条款19.根据条款1到18中任一项所述的组合，其中组合物包括多种不同的环糊精，其中所述多种环糊精包括至少两种环糊精。
条款20.根据条款19所述的组合，其中所述多种环糊精包括至少一种α-环糊精、至少一种β-环糊精和/或至少一种γ-环糊精。
条款21.根据条款1到20中任一项所述的组合，其包括亚油酸、胆固醇和环糊精。
条款22.根据条款1到21中任一项所述的组合，其包括环糊精和胆固醇，其中所述环糊精与所述胆固醇的摩尔比小于10.5∶1。
条款23.根据条款1到21中任一项所述的组合，其包括环糊精和至少一种脂肪酸，其中所述环糊精与所述至少一种脂肪酸的摩尔比小于11.5∶1。
条款24.根据条款1到21中任一项所述的组合，其包括环糊精、胆固醇和至少一种脂肪酸，其中所述环糊精与所述胆固醇和所述至少一种脂肪酸的摩尔比小于7.5∶1。
条款25.根据条款1到21中任一项所述的组合，其包括环糊精、胆固醇和至少一种脂肪酸，其中所述环糊精与所述胆固醇和所述至少一种脂肪酸的摩尔比小于5.5∶1。
条款26.根据条款1到21中任一项所述的组合，其包括环糊精、胆固醇和至少一种脂肪酸，其中所述环糊精与所述胆固醇和所述至少一种脂肪酸的摩尔比小于4.5∶1。
条款27.根据条款1到26中任一项所述的组合，其进一步包括前列腺素、皮质类固醇、白三烯、脂氧素、保护素、消退素、寡核苷酸或疏水性药物化合物。
条款28.根据条款27所述的组合，其中所述疏水性药物化合物是依托莫司或他汀。
条款29.根据条款1到28中任一项所述的组合，其中所述细胞培养基包括水平小于约200μm的环糊精。
条款30.根据条款1到28中任一项所述的组合，其中所述细胞培养基包括水平为约50μm到约200μm的环糊精。
条款31.根据条款1到30中任一项所述的组合，其中所述细胞培养基包括水平为约10μm到约30μm的胆固醇。
条款32.根据条款1到31中任一项所述的组合，其中所述细胞培养基中的所述至少一种脂质的水平为约10μm到约30μm。
条款33.根据条款1到26或29到32中任一项所述的组合，所述组合不包括药物化合物。
条款34.根据条款1到26或29到32中任一项所述的组合，所述组合不包括前列地尔、头孢替安酯hcl、贝奈克酯hcl、地塞米松、碘、烟碱、尼美舒利、硝酸甘油、奥美拉唑、pge2、吡罗昔康、噻洛芬酸、西沙必利、氢化可的松、鲁康唑、伊曲康唑、丝裂霉素、17β-雌二醇、氯霉素、伏立康唑、马来酸齐拉西道、双氯芬酸钠、依托莫司或他汀。
条款35.根据条款1到26或29到32中任一项所述的组合，所述组合不包括疏水性药物化合物。
条款36.根据条款1到35中任一项所述的组合，其中(i)所述细胞培养基包括白蛋白；或(ii)所述细胞培养基不包括白蛋白。
条款37.根据条款1到36中任一项所述的组合，其中(i)所述细胞培养基包括白蛋白；或(ii)所述细胞培养基不包括蛋白质。
条款38.根据条款1到37中任一项所述的组合，其中所述细胞培养基是无血清细胞培养基。
条款39.根据条款1到38中任一项所述的组合，其中相比与不包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基组合的t细胞群体中的对应t细胞，t细胞群体包括的t细胞能够具有更大的表型保留、更大的扩充、更大的效力和/或更高的转导效率。
条款40.根据条款1到39中任一项所述的组合，其进一步包括2-脱氧-d-葡萄糖。
条款41.一种细胞培养板或烧瓶、袋、生物发酵器或生物反应器系统，其包含根据条款1到40中任一项所述的组合。
条款42.一种无血清细胞培养基组合物，其包括亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇和甲基化环糊精。
条款43.根据条款42所述的组合物，其中所述甲基化环糊精以约50μm到约200μm的水平存在。
条款44.根据条款42或43所述的组合物，其中所述胆固醇以约10μm到约30μm的水平存在。
条款45.一种无血清细胞培养补充剂组合物，其包括亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇和甲基化环糊精。
条款46.根据条款42到45中任一项所述的组合物，本文中至少一种其它ω-6脂肪酸是多不饱和ω-6脂肪酸。
条款47.根据条款42到46中任一项所述的组合物，本文中至少一种ω-6脂肪酸是γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十四碳四烯酸或二十四碳五烯酸。
条款48.根据条款42到47中任一项所述的组合物，本文的至少一种其它ω-6脂肪酸是花生四烯酸。
条款49.根据条款42到48中任一项所述的组合物，其进一步包括α-亚麻酸。
条款50.根据条款42到49中任一项所述的组合物，其进一步包括肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸或硬脂酸。
条款51.根据条款42到50中任一项所述的组合物，其包括至少3、4、5、6、7或8种不同脂肪酸。
条款52.根据条款42到50中任一项所述的组合物，其包括3、4、5、6、7或8种不同脂肪酸。
条款53.根据条款42到52中任一项所述的组合物，其包括
(a)亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸或硬脂酸中的任何一种；
(b)亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸中的2种、3种、4种、5种、6种或7种；
(c)亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸；
(d)饱和脂肪酸，并且所述饱和脂肪酸为丁酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、木蜡酸或蜡酸；
(e)单不饱和脂肪酸，并且所述单不饱和脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸或神经酸；
(f)多不饱和脂肪酸，并且所述多不饱和脂肪酸是十六碳三烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、米德酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十一碳五烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳四烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳五烯酸或二十四碳六烯酸；
(g)ω-3脂肪酸，并且ω-3脂肪酸为十六碳三烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸，二十一碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸或二十四碳六烯酸；
(h)ω-6脂肪酸，并且ω-6脂肪酸为亚油酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十四碳四烯酸或二十四碳五烯酸；或者
(i)ω-9脂肪酸，并且ω-9脂肪酸是棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸或米德酸。
条款54.根据条款42到53中任一项所述的组合物，其中所述胆固醇是合成性胆固醇。
条款55.根据条款42到54中任一项所述的组合物，其中所述甲基化环糊精是甲基化α-环糊精、甲基化β-环糊精或甲基化γ-环糊精。
条款56.根据条款42到55中任一项所述的组合物，其中所述甲基化环糊精是甲基-β-环糊精。
条款57.根据条款42到56中任一项所述的组合物，其进一步包括未甲基化的环糊精。
条款58.根据条款42到57中任一项所述的组合物，其中所述甲基化环糊精与所述胆固醇的摩尔比小于10.5∶1。
条款59.根据条款42到58中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的所述甲基化环糊精与其它脂质的摩尔比小于11.5∶1。
条款60.根据条款42到59中任一项所述的组合物，其中所述组合物(i)包括白蛋白；或(ii)不包括含白蛋白。
条款61.根据条款42到60中任一项所述的组合物，其中所述组合物(i)包括蛋白质；或(ii)不包括含蛋白质。
条款62.根据条款42到61中任一项所述的组合物，其进一步包括2-脱氧-d-葡萄糖。
条款63一种用于培养t细胞群体的方法，所述方法包括在包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基中温育所述群体。
条款64.根据条款63所述的方法，其中所述细胞培养基包含根据条款45到62中任一项所述的无血清细胞培养补充剂组合物。
条款65.根据条款63或64所述的方法，其中所述t细胞群体包括cd8 t细胞。
条款66.根据条款63或64所述的方法，其中所述t细胞群体包括cd4 t细胞。
条款67.根据条款63或64所述的方法，其中所述t细胞群体包括cd8 t细胞和cd4 t细胞。
条款68.根据条款63到67中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包括2-脱氧-d-葡萄糖。
条款69.一种培养包括cd8 t细胞和cd4 t细胞的t细胞群体同时最小化所述群体内cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率的变化的方法，所述方法包括在包括环糊精和多不饱和脂肪酸的细胞培养基中温育所述群体。
条款70.根据条款69所述的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是ω-6多不饱和脂肪酸。
条款71.根据条款70所述的方法，其中所述ω-6多不饱和脂肪酸是亚油酸。
条款72.根据条款69到71中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包括胆固醇。
条款73.根据条款71或72中任一项所述的组合方法，其中所述细胞培养基进一步包括亚麻酸。
条款74.根据条款69所述的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是亚麻酸。
条款75.根据条款69到74中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包括花生四烯酸。
条款76.根据条款69到75中任一项所述的方法，其中最小化cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率的变化包括维持cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率，其中与当所述群体首次与培养基接触时的cd8 t细胞与cd4 t细胞的数量相比，cd8 t细胞与cd4 t细胞的数量相差小于25％、20％、15％、10％或5％。
条款77.根据条款69到76中任一项所述的方法，其中当所述群体首次与所述培养基接触时，则所述群体包括约1∶1的cd8 t细胞对cd4 t细胞比率。
条款78.根据条款69所述的方法，其中所述培养基包括(i)环糊精；(ii)胆固醇；以及(iii)脂肪酸，其中所述脂肪酸由亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸组成。
条款79.根据条款69到78中任一项所述的方法，其中所述培养基缺乏肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和/或硬脂酸中的任一种或其任何组合。
条款80.根据条款69到79中任一项所述的方法，其中所述培养基包含的亚油酸、亚麻酸和/或花生四烯酸与其它脂肪酸的摩尔比为至少1∶1。
条款81.根据条款69到80中任一项所述的方法，其进一步包括将所述群体温育足够的时间直到t细胞已经达到所需数量、分化阶段和/或表型；并任选地从培养物中采集t细胞。
条款82.一种用于优先扩充t细胞亚群的成员的方法，所述方法包括使混合的t细胞群体暴露于：
(i)环糊精；以及
(ii)脂肪酸；
其中调整两种或更多种脂肪酸的摩尔比以诱导所述t细胞亚群的所述成员相较于其它t细胞亚群的成员优先扩充。
条款83.根据条款82所述的方法，其中所述t细胞亚群是cd8 t细胞。
条款84.根据条款83所述的方法，其中相比于其它脂肪酸，使所述混合的t细胞群体更多地暴露于多不饱和脂肪酸。
条款85.根据条款83所述的方法，其中相比于其它脂肪酸，使所述混合的t细胞群体更多地暴露于ω-6多不饱和脂肪酸。
条款86.根据条款82到85中任一项所述的方法，其进一步包括使所述混合的t细胞群体暴露于2-脱氧-d-葡萄糖。
条款87.根据条款82所述的方法，其中所述t细胞亚群是cd4 t细胞。
条款88.根据条款82到87中任一项所述的方法，其中所述t细胞是原代t细胞。
条款89.根据条款82到88中任一项所述的方法，其中所述t细胞已经从人类受试者的血液中分离出来。
条款90.根据条款82到87中任一项所述的方法，其中所述t细胞是基因修饰的t细胞。
条款91.根据条款90所述的方法，其中所述t细胞表达基因修饰的t细胞受体。
条款92.根据条款90所述的方法，其中所述t细胞表达嵌合抗原受体。
条款93.一种培养包括cd8 t细胞和cd4 t细胞的t细胞群体同时增加所述群体内的cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率的方法，所述方法包括在包括2-脱氧-d-葡萄糖的细胞培养基中温育所述群体。
条款94.根据条款93所述的方法，其中所述2-脱氧-d-葡萄糖以约0.1mm到约5mm的水平存在。
条款95.根据条款93或94所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包括血清。
条款96.根据条款95所述的方法，其中所述血清是人血清。
条款97.根据条款93或94所述的方法，其中所述细胞培养基是无血清细胞培养基。
条款98.根据条款93到97中任一项所述的方法，其中首次与所述培养基接触约7天内，所述群体内cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率增加至少2倍、2.5倍、3倍或3.5倍。
条款99.根据条款93到98中任一项所述的方法，其中当所述群体首次与培养基接触时，所述群体内的cd4 t细胞比cd8 t细胞多。
条款100.根据条款99所述的方法，其中当所述群体首次与培养基接触时，所述群体内的cd4 t细胞对cd8 t的比率为约至少5∶1。
条款101.根据条款63到100中任一项所述的方法，其中所述t细胞是原代t细胞。
条款102.根据条款63到101中任一项所述的方法，其中所述t细胞已经从人类受试者的血液中分离出来。
条款103.根据条款63到100中任一项所述的方法，其中所述t细胞是基因修饰的t细胞。
条款104.根据条款103所述的方法，其中所述t细胞表达基因修饰的t细胞受体。
条款105.根据条款103所述的方法，其中所述t细胞表达嵌合抗原受体。
条款106.根据条款63到105中任一项所述的方法，其中所述t细胞是t调节细胞(treg)、t辅助细胞、th17细胞、th9细胞、t记忆细胞、t效应记忆细胞、t中央记忆细胞、终末分化型效应(ttd)t细胞、原初t细胞或工程化t细胞。
条款107.根据条款63到106中任一项所述的方法，其中所述t细胞群体的大小在7天内翻倍至少3倍。
条款108.根据条款63到107中任一项所述的方法，其中所述t细胞群体的大小在10天内翻倍至少3、4或5倍。
条款109.根据条款63到108中任一项所述的方法，其中在所述t细胞群体首次与所述培养基接触之后，所述t细胞群体中的至少75％、80％、85％、90％或95％的t细胞持续7、8、9或10天存活。
条款110.根据条款63到109中任一项所述的方法，其中在所述t细胞群体首次与所述培养基接触之后，所述t细胞群体中的至少95％的t细胞持续10天存活。
条款111.根据条款63到110中任一项所述的方法，其进一步包括制备培养的t细胞以施用于患有疾病或病状或面临患有疾病或病状的风险的受试者。
条款112.根据条款111所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用所述t细胞。
条款113.一种用于治疗有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用通过根据条款63到111中任一项所述的方法获得的t细胞。
条款114.根据条款113所述的方法，其中所述疾病是过度增殖性病症。
条款115.根据条款113所述的方法，其中所述疾病是自体免疫性疾病。
条款116.根据条款113所述的方法，其中所述疾病是炎症性疾病。
条款117.根据条款113所述的方法，其中所述疾病是过敏性疾病。
条款118.根据条款113所述的方法，其中所述疾病是感染性疾病。
条款119.根据条款118所述的方法，其中所述感染性疾病是病毒性感染。
条款120.根据条款119所述的方法，其中所述病毒感染是巨细胞病毒感染、艾普斯登-巴尔病毒感染或人免疫缺陷病毒感染。
条款121.根据条款113到120中任一项所述的方法，其中所述受试者的免疫系统受到抑制。
条款122.根据条款113到121中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受组织或器官移植。
条款123.根据条款113到122中任一项所述的方法，其中所述受试者患有获得性免疫缺陷综合症。
条款124.根据条款113到123中任一项所述的方法，其中所述t细胞是cd8 t细胞。
条款125.根据条款113到123中任一项所述的方法，其中所述t细胞是cd4 t细胞。
条款126.根据条款113到125中任一项所述的方法，其中所述t细胞是cd8 t细胞和cd4 t细胞。
条款127.一种用于补充t细胞培养基的系统，所述系统包括(i)两种或更多种不同的环糊精，其中每种环糊精在单独的容器中；以及(ii)两种或更多种不同的脂肪酸，其中每种脂肪酸在单独的容器中。
条款128.根据条款127所述的系统，所述系统进一步包括2-脱氧-d-葡萄糖。
条款129.一种用于培养t细胞的试剂盒，所述试剂盒包括无血清培养基、环糊精和一种或多种脂质。
条款130.根据条款129所述的试剂盒，其进一步包括2-脱氧-d-葡萄糖。
条款131.根据条款129或130所述的试剂盒，其进一步包括依托莫司。
条款132.一种组合，其包括(i)t细胞群体；(ii)细胞培养基以及(iii)包括环糊精和至少一种脂质的补充剂。
条款133.一种试剂盒或组合，其包含(i)细胞培养基，和(ii)根据条款42到62中任一项所述的组合物。
条款134.一种组合，其包括(i)二倍体细胞群体或非二倍体细胞群体；以及(ii)包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基。
条款135.根据条款134所述的组合，其中所述二倍体细胞在无血清条件下产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段。
条款136一种用于培养二倍体细胞群体的方法，所述方法包括在包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基中温育所述细胞群体。
条款137.根据条款136所述的方法，其中所述细胞培养基是无血清的。
条款138.根据条款137到137所述的方法，其中所述细胞群体选自由以下组成的群组：mrc-5、mrc-5rcb、wi-38、2bs、walvax-2、imr-90、imr-91、kmb-17和vero细胞。
条款139.根据条款137到138所述的方法，其中所述细胞在无血清条件下产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段。
条款140.一种用于补充二倍体细胞培养基的系统，所述系统包括(i)一种或多种不同的环糊精，其中每种环糊精在单独的容器中；以及(ii)两种或更多种不同的脂肪酸，其中每种脂肪酸在单独的容器中。
条款141.根据条款140所述的系统，所述系统进一步包括生长因子。
条款142.一种用于补充二倍体细胞培养基的系统，所述系统包括(i)环糊精；以及(ii)两种或更多种不同的脂肪酸，其中每种脂肪酸在单独的容器中。
条款143.一种用于培养产生疫苗的细胞或细胞系的试剂盒，所述试剂盒包括基础培养基和无血清生长补充剂。
条款144.根据条款143所述的用于培养产生疫苗的细胞或细胞系的试剂盒，其中所述无血清生长补充剂进一步包括环糊精和一种或多种脂质。
条款145.根据条款144所述的用于培养产生疫苗的细胞或细胞系的试剂盒，其中所述产生疫苗的细胞是二倍体细胞或非二倍体细胞。
条款146.根据条款145所述的用于培养产生疫苗的细胞或细胞系的试剂盒，其中所述二倍体细胞是人细胞。
条款147.一种无血清细胞培养基组合物，其包括亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇和环糊精。
条款148.一种无血清细胞培养补充剂组合物，其包括亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇和环糊精。
条款149.根据条款147所述的无血清细胞培养基组合物或根据条款148所述的无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述环糊精是甲基化环糊精。
条款150.根据条款149所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述甲基化环糊精以约50μm到约200μm的水平存在。
条款151.根据条款147到150中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或根据条款148到150中任一项所述的无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述胆固醇是合成性胆固醇；和/或其中所述胆固醇以约5μm到约30μm的水平存在。
条款152.根据条款147到151中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或根据条款148到151中任一项所述的无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述至少一种其它ω-6脂肪酸是多不饱和ω-6脂肪酸。
条款153.根据条款147到152中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或根据条款148到152中任一项所述的无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述至少一种其它ω-6脂肪酸是花生四烯酸。
条款154.根据条款147到153中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或根据条款148到153中任一项所述的无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述多不饱和ω-6脂肪酸选自由以下组成的群组：花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸。
条款155.根据条款148到154中任一项所述的无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述补充剂的有效稀释度为约1∶10到约1∶5000。
条款156.根据条款147所述的无血清细胞培养基组合物或根据条款148所述的无血清细胞培养补充剂组合物，所述组合物能够培养可以产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段的细胞。
条款157.根据条款147到156中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述细胞是动物细胞。
条款158.根据条款147到157中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述动物细胞是牛细胞、犬细胞、猫细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、灵长类细胞或人细胞。
条款159.根据条款147到158中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述动物细胞是二倍体细胞。
条款160.根据条款147到159中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述细胞选自由以下组成的群组：mrc-5、mrc-5rcb、mrc-9、wi-38、2bs、walvax-2、imr-90、imr-91、kmb-17、hut系列细胞、张氏肝细胞、u937、mdck、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero和前述细胞的任何克隆。
条款161.根据条款147到160中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述培养基或补充剂增加：所述细胞的生长、所述细胞的活细胞密度、病毒感染的细胞的病毒滴度或其组合。
条款162.根据条款147到161中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述细胞被病毒感染。
条款163.根据条款147到162中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述病毒是动物病毒、植物病毒或噬菌体。
条款164.根据条款147到163中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述病毒选自由以下组成的群组：水痘带状疱疹病毒(vzv)、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、甲型肝炎病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、天花病毒、水痘病毒、黄热病病毒、乳头瘤病毒、埃博拉病毒、hiv、狂犬病病毒或水疱性口炎病毒(vsv)和登革热病毒。
条款165.根据条款147到164中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述病毒粒子源自细小病毒科、逆转录病毒科、黄病毒科或噬菌体。
条款166.根据条款148所述的无血清细胞培养补充剂组合物，所述组合物被添加到基础培养基以培养可以产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段的二倍体细胞，其中所述细胞在无血清条件下培养。
条款167一种用于培养二倍体细胞群体的方法，所述方法包括在包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基中温育所述细胞群体。
条款168.根据条款167所述的培养细胞群体的方法，所述细胞群体包括产生疫苗的二倍体细胞，所述方法包括在无血清细胞培养基中温育所述细胞群体，所述无血清细胞培养基包括：
(i)环糊精、亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸和胆固醇，或
(ii)适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂；其中与没有环糊精的含血清培养基中的活细胞密度相比，所述培养使所述无血清细胞培养基中的活细胞密度增加。
条款169.根据条款167所述的用于培养二倍体细胞群体的方法，其中所述环糊精是甲基化环糊精。
条款170.根据条款169所述的用于培养二倍体细胞群体的方法，其中所述甲基化环糊精以约50μm到约200μm的水平存在。
条款171.根据条款168或169所述的用于培养二倍体细胞群体的方法，其中所述至少一种其它ω-6脂肪酸是多不饱和ω-6脂肪酸。
条款172.根据条款168或169所述的用于培养二倍体细胞群体的方法，其中所述多不饱和ω-6脂肪酸选自由以下组成的群组：花生四烯酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸。
条款173.根据条款167到172中任一项所述的用于培养二倍体细胞群体的方法，其中：
(i)所述培养基或补充剂增加：所述细胞的生长、所述细胞的活细胞密度、病毒感染的细胞的病毒滴度或其组合；和/或
(ii)所述二倍体细胞能够在无血清条件下产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或其病毒片段；和/或
(iii)所述细胞被病毒感染。
条款174.根据条款167到173中任一项所述的用于培养二倍体细胞群体的方法，其中：
(i)所述病毒是动物病毒、植物病毒或噬菌体；和/或
(ii)所述病毒选自由以下组成的群组：水痘带状疱疹病毒(vzv)、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、甲型肝炎病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、天花病毒、水痘病毒、黄热病病毒、乳头瘤病毒、埃博拉病毒、hiv、狂犬病病毒或水疱性口炎病毒(vsv)和登革热病毒；和/或
(iii)所述病毒粒子源自细小病毒科、逆转录病毒科、黄病毒科或噬菌体。
条款175.根据条款167到174中任一项所述的方法，其中所述细胞群体选自由以下组成的群组：mrc-5、mrc-5rcb、mrc-9、wi-38、2bs、walvax-2、imr-90、imr-91、kmb-17、hut系列细胞、张氏肝细胞、u937、mdck、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero和前述细胞的任何克隆。
条款176.一种组合，其包括：
(i)细胞群体；(ii)包括环糊精和至少一种脂质的无血清细胞培养基，或者(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)包括环糊精和至少一种脂质的补充剂，或
(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂。
条款177.根据条款176所述的组合，其中：
(i)所述细胞是动物细胞；或者
(ii)所述动物细胞是牛细胞、猫细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、灵长类细胞或人细胞；或者
(iii)所述动物细胞是二倍体细胞；或者
(iv)所述细胞选自由以下组成的群组：mrc-5、mrc-5rcb、mrc-9、wi-38、2bs、walvax-2、imr-90、imr-91、kmb-17、hut系列细胞、张氏肝细胞、u937、mdck、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero和前述细胞的任何克隆。
条款178.根据条款176到177所述的组合，其中所述二倍体细胞在无血清条件下产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段。
条款179.一种产生无血清二倍体细胞培养基的方法，所述方法包括混和(i)基础培养基；以及(ii)包括环糊精和至少一种脂质的补充剂；或(ii)适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂。
条款180.根据条款179所述的产生无血清二倍体细胞培养基的方法，其中所述补充剂进一步包括生长因子。
条款181.一种用于补充二倍体细胞培养基的系统，所述系统包括(i)一种或多种不同的环糊精，其中每种环糊精在单独的容器中；以及(ii)两种或更多种不同的脂肪酸，其中每种脂肪酸在单独的容器中。
条款182.一种用于培养细胞或细胞系的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)细胞群体；(ii)包括环糊精和至少一种脂质的无血清细胞培养基，或者
(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)包括环糊精和至少一种脂质的补充剂，或者
(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂。
条款183.根据条款182所述的试剂盒，其中：
(i)所述细胞是动物细胞；或者
(ii)所述动物细胞是牛细胞、犬细胞、猫细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、灵长类细胞或人细胞；或者
(iii)所述动物细胞是二倍体细胞；或者
(iv)所述细胞选自由以下组成的群组：mrc-5、mrc-5rcb、mrc-9、wi-38、2bs、walvax-2、imr-90、imr-91、kmb-17、hut系列细胞、张氏肝细胞、u937、mdck、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero和前述细胞的任何克隆。
条款184.根据条款182和183所述的试剂盒，其中所述细胞在无血清条件下产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段。
1.一种无血清细胞培养基组合物，其包括亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇和环糊精。
2.一种无血清细胞培养补充剂组合物，其包括亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇和环糊精。
3.根据权利要求1所述的无血清细胞培养基组合物或根据权利要求2所述的无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述环糊精是甲基化环糊精。
4.根据权利要求3所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述甲基化环糊精以约50μm到约200μm的水平存在。
5.根据前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或根据前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述胆固醇是合成性胆固醇；和/或其中所述胆固醇以约5μm到约30μm的水平存在。
6.根据前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或根据前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述至少一种其它ω-6脂肪酸是多不饱和ω-6脂肪酸。
7.根据前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或根据前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述至少一种其它ω-6脂肪酸是花生四烯酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或根据前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述多不饱和ω-6脂肪酸选自由以下组成的群组：花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述补充剂的有效稀释度为约1∶10到约1∶5000。
10.根据权利要求1所述的无血清细胞培养基组合物或根据权利要求2所述的无血清细胞培养补充剂组合物，所述组合物能够培养可以产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段的细胞。
11.根据前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述细胞是动物细胞。
12.根据权利要求11所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述动物细胞是牛细胞、犬细胞、猫细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、灵长类细胞或人细胞。
13.根据权利要求11或12所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述动物细胞是二倍体细胞。
14.根据前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基组合物，其进一步包括2-脱氧-d-葡萄糖。
15.根据前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述细胞选自由以下组成的群组：mrc-5、mrc-5rcb、mrc-9、wi-38、2bs、walvax-2、imr-90、imr-91、kmb-17、hut系列细胞、张氏肝细胞(changliver)、u937、mdck、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero和前述细胞的任何克隆。
16.根据前述细胞中的任何细胞所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述培养基或补充剂增加：所述细胞的生长、所述细胞的活细胞密度、病毒感染的细胞的病毒滴度或其组合。
17.根据前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述细胞被病毒感染。
18.根据权利要求16或17所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述病毒是动物病毒、植物病毒或噬菌体。
19.根据权利要求16到18所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述病毒选自由以下组成的群组：水痘带状疱疹病毒(vzv)、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、甲型肝炎病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、天花病毒、水痘病毒、黄热病病毒、乳头瘤病毒、埃博拉病毒、hiv、狂犬病病毒或水疱性口炎病毒(vsv)和登革热病毒。
20.根据权利要求10到19中任一项所述的无血清细胞培养基组合物或无血清细胞培养补充剂组合物，其中所述病毒粒子源自细小病毒科(parvoviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、黄病毒科(flaviviridae)或噬菌体。
21.根据权利要求2所述的无血清细胞培养补充剂组合物，所述组合物被添加到基础培养基以培养可以产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段的二倍体细胞，其中所述细胞在无血清条件下培养。
22.一种用于培养二倍体细胞群体的方法，所述方法包括在包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基中温育所述细胞群体。
23.根据权利要求22所述的培养细胞群体的方法，所述细胞群体包括产生疫苗的二倍体细胞，所述方法包括在无血清细胞培养基中温育所述细胞群体，所述无血清细胞培养基包括：
(i)环糊精、亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸和胆固醇，或
(ii)适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂；其中与没有环糊精的含血清培养基中的活细胞密度相比，所述培养使所述无血清细胞培养基中的活细胞密度增加。
24.根据权利要求23所述的用于培养二倍体细胞群体的方法，其中所述环糊精是甲基化环糊精。
25.根据权利要求24所述的用于培养二倍体细胞群体的方法，其中所述甲基化环糊精以约50μm到约200μm的水平存在。
26.根据权利要求23所述的用于培养二倍体细胞群体的方法，其中所述至少一种其它ω-6脂肪酸是多不饱和ω-6脂肪酸。
27.根据权利要求23所述的用于培养二倍体细胞群体的方法，其中所述多不饱和ω-6脂肪酸选自由以下组成的群组：花生四烯酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸。
28.根据权利要求22到27中任一项所述的用于培养二倍体细胞群体的方法，其中
(i)所述培养基或补充剂增加：所述细胞的生长、所述细胞的活细胞密度、病毒感染的细胞的病毒滴度或其组合；和/或
(ii)所述二倍体细胞能够在无血清条件下产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或其病毒片段；和/或
(iii)所述细胞被病毒感染。
29.根据权利要求22到28中任一项所述的用于培养二倍体细胞群体的方法，其中
(i)所述病毒是动物病毒、植物病毒或噬菌体；和/或
(ii)所述病毒选自由以下组成的群组：水痘带状疱疹病毒(vzv)、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、甲型肝炎病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、天花病毒、水痘病毒、黄热病病毒、乳头瘤病毒、埃博拉病毒、hiv、狂犬病病毒或水疱性口炎病毒(vsv)和登革热病毒；和/或
(iii)所述病毒粒子源自细小病毒科家族、逆转录病毒科家族、黄病毒科家族或噬菌体。
30.根据权利要求22到29中任一项所述的方法，其中所述细胞群体选自由以下组成的群组：mrc-5、mrc-5rcb、mrc-9、wi-38、2bs、walvax-2、imr-90、imr-91、kmb-17、hut系列细胞、张氏肝细胞、u937、mdck、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero和前述细胞的任何克隆。
31.一种组合，其包括：
(i)细胞群体；(ii)包括环糊精和至少一种脂质的无血清细胞培养基，或者
(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)包括环糊精和至少一种脂质的补充剂，或者
(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂。
32.根据权利要求31所述的组合，其中：
(i)所述细胞是动物细胞；或者
(ii)所述动物细胞是牛细胞、猫细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、灵长类细胞或人细胞；或者
(iii)所述动物细胞是二倍体细胞；或者
(iv)所述细胞选自由以下组成的群组：mrc-5、mrc-5rcb、mrc-9、wi-38、2bs、walvax-2、imr-90、imr-91、kmb-17、hut系列细胞、张氏肝细胞、u937、mdck、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero和前述细胞的任何克隆。
33.根据权利要求31或32所述的组合，其中所述二倍体细胞在无血清条件下产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段。
34.一种产生无血清二倍体细胞培养基的方法，所述方法包括混和(i)基础培养基；以及(ii)包括环糊精和至少一种脂质的补充剂；或(ii)适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂。
35.根据权利要求34所述的产生无血清二倍体细胞培养基的方法，其中所述补充剂进一步包括生长因子。
36.一种用于补充二倍体细胞培养基的系统，所述系统包括(i)一种或多种不同的环糊精，其中每种环糊精在单独的容器中；以及(ii)两种或更多种不同的脂肪酸，其中每种脂肪酸在单独的容器中。
37.一种用于培养细胞或细胞系的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)细胞群体；(ii)包括环糊精和至少一种脂质的无血清细胞培养基，或者
(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)包括环糊精和至少一种脂质的补充剂，或者
(i)细胞群体；(ii)无血清基础细胞培养基；以及(iii)适当稀释度的在表1和/或表2中描述的补充剂。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中：
(i)所述细胞是动物细胞；或者
(ii)所述动物细胞是牛细胞、犬细胞、猫细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、灵长类细胞或人细胞；或者
(iii)所述动物细胞是二倍体细胞；或者
(iv)所述细胞选自由以下组成的群组：mrc-5、mrc-5rcb、mrc-9、wi-38、2bs、walvax-2、imr-90、imr-91、kmb-17、hut系列细胞、张氏肝细胞、u937、mdck、表达cd4的t细胞、表达cd8的t细胞、vero和前述细胞的任何克隆。
39.根据权利要求37到38所述的试剂盒，其中所述细胞在无血清条件下产生疫苗、病毒、病毒粒子、病毒蛋白或核酸或病毒片段。
40.一种组合，其包括(i)t细胞群体；以及(ii)包括环糊精和至少一种脂质的培养基。
41.根据权利要求40所述的组合，其中所述至少一种脂质是胆固醇、脂肪酸、脂肪酸酯、磷脂或甘油脂。
42.根据权利要求41所述的组合，其中所述脂肪酸是饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸。
43.根据权利要求41所述的组合，其中所述脂肪酸是ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸或ω-9脂肪酸。
44.根据权利要求41所述的组合，其中所述脂肪酸是亚油酸。
45.根据权利要求41所述的组合，其进一步包括亚麻酸。
46.根据权利要求45所述的组合，其中所述亚麻酸是α-亚麻酸、γ-亚麻酸或α-亚麻酸和γ-亚麻酸。
47.根据权利要求41所述的组合，其进一步包括花生四烯酸。
48.根据权利要求40所述的组合，其中所述至少一种脂质是胆固醇。
49.根据权利要求40所述的组合，其中所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。
50.根据权利要求40所述的组合，其中所述环糊精是甲基化的。
51.根据权利要求50所述的组合，其中所述环糊精是甲基-β-环糊精。
52.根据权利要求40所述的组合，其中组合物包括多种不同的环糊精，其中所述多种环糊精包括至少两种环糊精。
53.根据权利要求48所述的组合，其中所述环糊精对所述胆固醇的摩尔比小于11.5∶1。
54.根据权利要求40所述的组合，其中所述细胞培养基包括水平为约10μm到约200μm的环糊精。
55.根据权利要求40所述的组合，其中所述细胞培养基是无血清培养基。
56.根据权利要求40所述的组合，其中所述细胞培养基不包括白蛋白。
57.根据权利要求40所述的组合，其进一步包括2-脱氧-d-葡萄糖。
58.一种用于培养t细胞群体的方法，所述方法包括在包括环糊精和至少一种脂质的细胞培养基中温育所述群体。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述细胞培养基包括无血清细胞培养补充剂组合物，所述组合物包括亚油酸、至少一种其它ω-6脂肪酸、胆固醇和环糊精。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述t细胞群体包括cd8 t细胞。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述t细胞群体包括cd4 t细胞。
62.根据权利要求58所述的方法，其中所述t细胞群体包括cd8 t细胞和cd4 t细胞。
63.根据权利要求58所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包括2-脱氧-d-葡萄糖。
64.一种培养包括cd8 t细胞和cd4 t细胞的t细胞群体的方法，所述方法包括在包括环糊精和多不饱和脂肪酸的细胞培养基中温育所述群体，
其中在培养10天之后，所述群体内cd4 t细胞对cd8 t细胞的比率变化小于50％，并且
其中所述细胞培养基含有在0.1mm到约10mm之间的2-脱氧-d-葡萄糖。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是ω-6多不饱和脂肪酸。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述ω-6多不饱和脂肪酸是亚油酸。
67.根据权利要求64所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包括胆固醇。
68.根据权利要求64所述的方法，其中当所述群体首次与所述培养基接触时，则所述群体包括约1∶1的cd4 t细胞对cd8 t细胞比率。
69.一种用于优先扩充t细胞亚群的成员的方法，所述方法包括使混合的t细胞群体暴露于：
(i)环糊精；以及
(ii)两种或更多种脂肪酸，
其中调整两种或更多种脂肪酸的摩尔比以诱导所述t细胞亚群的所述成员相较于其它t细胞亚群的成员优先扩充。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述t细胞亚群是cd8 t细胞。
71.根据权利要求69所述的方法，其中所述t细胞亚群是cd4 t细胞。
72.根据权利要求69所述的方法，其进一步包括使所述混合的t细胞群体暴露于2-脱氧-d-葡萄糖。
73.根据权利要求69所述的方法，其中相比其它脂肪酸，使所述混合的t细胞群体更多地暴露于多不饱和脂肪酸。
74.根据权利要求69所述的方法，其中所述t细胞是原代t细胞。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述t细胞已经从人类受试者的血液中分离出来。
76.根据权利要求69所述的方法，其中所述t细胞是基因修饰的t细胞。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述t细胞表达基因修饰的t细胞受体。
78.根据权利要求69所述的方法，其中所述t细胞表达嵌合抗原受体。
79.一种培养包括cd8 t细胞和cd4 t细胞的t细胞群体，同时增加所述群体内cd8 t细胞对cd4 t细胞比率的方法，所述方法包括在包括2-脱氧-d-葡萄糖的细胞培养基中温育所述群体。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述2-脱氧-d-葡萄糖以约0.1mm到约5mm的水平存在。
81.根据权利要求79所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包括血清。
82.根据权利要求79所述的方法，其中所述细胞培养基是无血清细胞培养基。
83.根据权利要求79所述的方法，其中首次与所述培养基接触7天之后，所述群体内cd8 t细胞对cd4 t细胞的比率增加2倍到5倍。
84.根据权利要求79中任一项所述的方法，其中所述t细胞是原代t细胞。
85.根据权利要求79所述的方法，其中所述t细胞已经从人类受试者的血液中分离出来。
86.根据权利要求79所述的方法，其中所述t细胞是基因修饰的t细胞。
87.根据权利要求79所述的方法，其中所述t细胞表达基因修饰的t细胞受体。
88.根据权利要求79所述的方法，其中所述t细胞表达嵌合抗原受体。
89.根据权利要求79所述的方法，其中所述t细胞是t调节细胞(treg)、t辅助细胞、th17细胞、th9细胞、t记忆细胞、t效应记忆细胞、t中央记忆细胞、终末分化型效应(ttd)t细胞、原初t细胞或工程化t细胞。
90.根据权利要求79所述的方法，其进一步包括制备培养的t细胞以施用于患有疾病或病状或面临患有疾病或病状的风险的受试者。
91.根据权利要求90所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用所述t细胞。
92.一种用于治疗有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用通过根据权利要求91所述的方法获得的t细胞。
93.一种用于培养t细胞的试剂盒，所述试剂盒包括无血清培养基、环糊精和一种或多种脂质。
94.根据权利要求93所述的试剂盒，其进一步包括2-脱氧-d-葡萄糖。
技术总结