本发明涉及用于检测核酸分子，确切地说，在等温多核苷酸扩增反应中形成的多核苷酸扩增产物的方法和试剂盒。
背景技术：
：序列特异性等温核酸扩增技术提供了优于传统聚合酶链反应(pcr)的优势，因为它们无需pcr中使用的热循环设备即可提供快速并且灵敏的分子检测。由于它们适合与低功率并且便携式仪器一起使用，因此它们在现场或现场护理分子诊断中可能会发现特定效用。与用热量使双链dna(dsdna)变性的pcr相比，等温扩增方法通常使用酶活性来分离目标多核苷酸的链，并且允许序列特异性寡核苷酸引物的杂交。扩增反应由多轮引物杂交、引物延伸和链分离驱动，并且在单一温度下进行。尽管许多扩增系统目前在使用中，但并非全部都足够简单以在短时间范围中提供特异性检测。那些能够快速扩增的酶通常使用链置换聚合酶，所述酶具有链分离和引物延伸的双重功能。此类方法包括环介导等温扩增(lamp)(notomi等人,2000,<<核酸研究28(12):e63,dna的环介导等温扩增(nucleicacidsres.28(12):e63,loop-mediatedisothermalamplificationofdna)>>；nagamine等人,2002,<<分子细胞探针。16(3):223-9，使用环引物通过环介导等温扩增的加速反应(nagamineetal,2002,molcellprobes.16(3):223-9,acceleratedreactionbyloop-mediatedisothermalamplificationusingloopprimers)>>)、智能扩增(smap)(lezhava和hayashizaki,2009，<<分子生物学方法578：437-51通过等温智能扩增方法和交叉激活扩增(cpa)检测snp(methodsmolbiol.578:437-51detectionofsnpbytheisothermalsmartamplificationmethod,andcross-primingamplification(cpa))>>(xu等人，2012，<<科学报导2：246，交叉激活扩增：等温dna扩增的机制和优化(scirep.2:246,crossprimingamplification:mechanismandoptimizationforisothermaldnaamplification)>>)。这些中的每一个都能够使用链置换聚合酶与复杂的寡核苷酸引物一起从目标多核苷酸产生大量的多核苷酸扩增产物。虽然许多早期等温扩增方法依赖于使用浑浊度或插入染料方法检测目标核酸，但近年来使用荧光探针检测已变得更常见。典型荧光探针检测方法涉及使用经设计以按序列特异性方式结合到扩增目标多核苷酸的探针。举例来说，塔克曼探针(taqmanprobe)为与目标多核苷酸杂交的双重标记寡核苷酸。dna聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性取代并且使探针降解，从淬灭剂释放荧光团。此类探针已成功地用于多重等温扩增反应中，其中包括解旋酶以分离dsdna目标的链(tong等人,2008，<<生物技术.45(5):543-57.doi：10.2144/000112959，用于检测生物威胁生物体的等温塔克曼分析的开发(biotechniques.45(5):543-57.doi:10.2144/000112959,developmentofisothermaltaqmanassaysfordetectionofbiothreatorganisms)>>)。hybeacon探针是具有用荧光染料标记的一种或多种内部碱基的单链寡核苷酸。当与互补目标杂交时，它们比单链杂交时更具荧光性，并且可以使用解链或粘接曲线分析来监测与目标的杂交。hybeacon探针已成功用于检测等温扩增反应的扩增产物，并且目标序列中的序列变异可检测为不同的解链峰(howard等人，2015，<<分子细胞探针。29(2)：92-8，doi：10.1016/j.mcp.2014.12.001，使用等温扩增和hybeacon探针快速检测诊断目标-用于序列特异性检测的同质系统(molcellprobes.29(2):92-8,doi:10.1016/j.mcp.2014.12.001,rapiddetectionofdiagnostictargetsusingisothermalamplificationandhybeaconprobes--ahomogenoussystemforsequence-specificdetection)>>)。例如，由于与一个等位基因完全互补并且相对于另一个等位基因错配，hybeacon探针可用于区分扩增产物中的不同等位基因。通过调适用于每个扩增反应的目标特异性lamp引物中的一个，lamp技术最近已经被调适用于检测多个目标，以含有淬灭剂或荧光团，并且适当时提供含有荧光团或淬灭剂的互补寡核苷酸，其与lamp引物形成双螺旋(泰纳(tanner)等人,2012,<<生物技术。53(2)：81-9.doi10.2144/0000113902，实时循环介导等温扩增中的同时多目标检测(biotechniques.53(2):81-9.doi:10.2144/0000113902,simultaneousmultipletargetdetectioninreal-timeloop-mediatedisothermalamplification)>>)。扩增反应期间双螺旋区的链分离产生荧光信号的增加。使用不同荧光团/淬灭剂对允许检测多个目标。然而，目标的选择取决于标记的目标特异性lamp引物的互补标记寡核苷酸的特异性，以及缺乏与多重反应中所用的其它目标特异性lamp引物的交叉反应性。在实践中，所述方法已用于检测多重来源于人类、大肠杆菌、秀丽隐杆线虫和噬菌体dna的高度发散的目标序列。需要不仅依赖于目标序列的核苷酸序列之间的差异的检测方法，以使得能够区分等温扩增反应中的不同扩增产物。本发明提供了一种方法，其中将检测盒并入扩增产物中，并且通过与通常标记的盒寡核苷酸杂交来检测盒或其补体的存在。可用不同标记的盒寡核苷酸检测不同的盒或其补体，从而甚至可以在多重反应中区分出密切相关的产品。已开发适合的盒寡核苷酸以用于常规pcr(us2007/117108a1、us2013/252238a1和wo2014/135872a1)，但先前尚未在需要复杂的多域寡核苷酸引物的等温扩增反应中利用。在本说明书中对先前已出版文献的列举或讨论不应视为承认所述文献为目前先进技术的一部分或为公共常识。技术实现要素：根据本发明，提供一种检测一个或多个多核苷酸扩增产物的方法，所述方法包含以下步骤：a)提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个组包含一个或多个寡核苷酸引物集合，每个集合的特征在于：i)第一寡核苷酸引物(正向引物)，其包含荧光盒特异性部分和3'下游目标特异性部分；和ii)一种或多种目标特异性寡核苷酸引物；其中在具体集合中的寡核苷酸引物各自适合于与目标多核苷酸的链杂交，以允许在等温多核苷酸扩增反应中形成所述目标多核苷酸的扩增产物；并且其中相同组中的每个集合的所述第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，其能够与相同组中的任何集合的所述第一寡核苷酸引物的所述荧光盒特异性部分的补体杂交；b)提供一个或多个盒寡核苷酸集合，每个集合的特征在于：i)第一盒寡核苷酸，其用荧光部分(供体部分)标记并且具有能够与给定寡核苷酸引物组中的任何集合的所述第一寡核苷酸引物的所述荧光盒特异性部分的所述补体杂交的序列；和ii)第二盒寡核苷酸，其用受体部分(例如淬灭剂部分)标记；其中每个集合的所述盒寡核苷酸彼此杂交以形成荧光淬灭对；c)在链置换dna聚合酶存在下引发等温多核苷酸扩增反应，由此产生(如果存在目标多核苷酸)相关第一寡核苷酸引物的至少一部分的互补序列，使得相关第二(受体，例如淬灭剂，标记的)盒寡核苷酸不太可能与相关第一(荧光标记的)盒寡核苷酸杂交，由此产生信号；和d)检测所产生的所述信号。还提供适用于此类方法的试剂盒。附图说明图1a：环介导等温扩增(lamp)中利用的目标序列与相对应的经典lamp引物一起展示。在本发明的示例性方法中，如所示，将盒通用序列并入f1c和f2(或b1c和b2)序列之间的lamp“内部引物”中的一者中。这将通用盒序列并入到了lamp“回路”中的一者中，其中其为可进入的。图1b：基于图1a中所定义的结构，此图表明通用盒区序列可并入到lamp反应产物中、复制和检测其补体的机制。该图仅显示了整个lamp反应的相关部分。图2：此图展示当将实施例1中所描述的snp基因分型lamp反应与通用盒等温检测系统组合时，实时(a/b)和端点(c)数据产生。此图展示：a)在罗氏lightcycler480仪器的fam检测通道中产生的实时数据。关于多个反应的荧光迹线叠加，一组迹线展示随时间推移荧光的显影，且另一组展示随时间推移荧光的减少或无荧光显影。平坦的迹线用于无目标控制。b)在罗氏lightcycler480仪器的hex检测通道中产生的实时数据。关于多个反应的荧光迹线叠加，一组迹线展示随时间推移荧光的显影，且另一组展示随时间推移荧光的减少或无荧光显影。高荧光组和低荧光组的成员分别对应于a中展示的低荧光组和高荧光组的成员。平坦迹线不用于目标控制。c)扩增后产生的端点数据图，其中y轴显示hex通道的荧光强度，并且x轴显示fam通道的荧光强度。清楚地区分两个基因分型集群。图3：此图展示实施例2中产生且如图2所描述的实时(a/b)和端点(c)数据两者。具体实施方式本发明的第一方面提供一种检测一种或多种多核苷酸扩增产物的方法，所述方法包含以下步骤：a)提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个组包含一个或多个寡核苷酸引物集合，每个集合的特征在于：i)第一寡核苷酸引物(正向引物)，其包含荧光盒特异性部分和3'下游目标特异性部分；和ii)一种或多种目标特异性寡核苷酸引物；其中在具体集合中的寡核苷酸引物各自适合于与目标多核苷酸的链杂交，以允许在等温多核苷酸扩增反应中形成所述目标多核苷酸的扩增产物；并且其中相同组中的每个集合的所述第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，其能够与相同组中的任何集合的所述第一寡核苷酸引物的所述荧光盒特异性部分的补体杂交；b)提供一个或多个盒寡核苷酸集合，每个集合的特征在于：i)第一盒寡核苷酸，其用荧光部分(供体部分)标记并且具有能够与给定寡核苷酸引物组中的任何集合的所述第一寡核苷酸引物的所述荧光盒特异性部分的所述补体杂交的序列；和ii)第二盒寡核苷酸，其用受体部分(例如淬灭剂部分)标记；其中每个集合的所述盒寡核苷酸彼此杂交以形成荧光淬灭对；c)在链置换dna聚合酶存在下引发等温多核苷酸扩增反应，由此产生(如果存在目标多核苷酸)相关第一寡核苷酸引物的至少一部分的互补序列，使得相关第二(受体，例如淬灭剂，标记的)盒寡核苷酸不太可能与相关第一(荧光标记的)盒寡核苷酸杂交，由此产生信号；和d)检测所产生的所述信号。以上步骤(a)提供一种或多种寡核苷酸引物组，每个组包含一种或多种适用于在等温多核苷酸扩增反应中产生目标多核苷酸的扩增产物的寡核苷酸引物集合。在每个集合中的第一寡核苷酸引物也称为“带尾引物”，其包含3'下游目标特异性序列和荧光盒特异性部分两者。荧光盒特异性部分的目的是并入到扩增产物中，使得荧光盒特异性部分的补体可用于与用荧光部分标记的第一盒寡核苷酸杂交。在每个集合中，第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的补体能够与用荧光部分标记的第一盒寡核苷酸杂交。通常，每个集合中的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分是相同的。通常，它们至少部分与第一盒寡核苷酸的序列相同。在使用所述方法时，第一盒寡核苷酸与所述或每个寡核苷酸引物集合的所述或每个扩增产物杂交，产生信号。适当地，所述方法涉及超过一个寡核苷酸引物组。适当地，每个寡核苷酸引物组将不同荧光盒特异性部分并入到扩增产物中，所述扩增产物与用不同荧光部分标记的不同第一盒寡核苷酸杂交。通过这种方式，可以通过产生不同的荧光信号来区分多个目标。在步骤(b)中，将每个标记有荧光部分的第一盒寡核苷酸与第二个标记有受体部分的盒寡核苷酸一起提供，并且二者相互杂交形成荧光淬灭对。所述对的第一盒寡核苷酸能够与给定寡核苷酸引物组中的任何集合的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的补体杂交。换句话说，不管在给定组中存在多少寡核苷酸引物集合，每组仅需要一个荧光淬灭对。适当地，所述方法涉及超过一个寡核苷酸引物组，并且为每个组提供了不同的荧光淬灭对，从而在所述方法的操作中为每个组产生了不同的荧光信号。在一个实施方案中，每个集合经设计以从单一目标产生扩增产物，并且通过获取不同荧光信号检测每个扩增产物。在步骤(c)中，等温多核苷酸扩增反应产生(如果存在目标多核苷酸)相关第一寡核苷酸引物的至少一部分，并且通常是所有的互补序列。第一(荧光标记的)盒寡核苷酸优先与扩增产物中荧光盒特异性部分的补体杂交，并且因此第二盒寡核苷酸对其荧光信号的猝灭减少。在第一轮多核苷酸扩增反应中，引物延伸产物由第一寡核苷酸引物形成。然后从反向引物扩增此产物通常形成相关第一寡核苷酸引物的互补序列。然而，不能排除的是，这种反向引发的扩增可能在整个相关第一寡核苷酸引物的互补序列的形成完成之前终止。相关第一寡核苷酸引物的互补序列的部分必须至少包含荧光盒特异性部分的补体的至少一部分(通常所有)，以便相关第二(受体，例如淬灭剂，标记的)盒寡核苷酸不太可能与相关第一(荧光标记的)盒寡核苷酸杂交(被认为是，因为相关第一寡核苷酸引物的形成的互补序列实际上与第一盒寡核苷酸杂交)。反应条件和组分如本发明的方法中的“多核苷酸扩增反应”涉及核酸引物分子与模板多核苷酸分子的链杂交和模板依赖性引物延伸反应，其中链置换dna聚合酶通过将一系列碱基添加到引物的3'末端而延伸杂交引物，所述序列通过模板链中的碱基序列确定。由模板依赖性引物延伸反应引起的目标特异性引物延伸产物的形成可以认为是第一轮多核苷酸扩增反应。其它轮需要引物延伸产物的链分离，使得其它引物可以与一种或其它链杂交并且进行引物延伸反应。在等温多核苷酸扩增反应中，相较于常规聚合酶链反应(pcr)，在第一轮反应中形成目标特异性引物延伸产物之后的链分离不通过单独加热来实现。确切地说，不必将反应物加热到高于引物延伸所选择的温度的温度。本发明的方法在链置换dna聚合酶的存在下进行，因此允许多轮多核苷酸扩增反应在相对恒定的温度下进行。通常，多核苷酸扩增反应(并且任选地还检测信号)在适合于来自链置换dna聚合酶的延伸引物的温度下进行。在某些实施方案中，可周期性地冷却反应物以促进在步骤(d)中检测信号。如果合适的话，反应物也可以在其端点冷却以促进信号的检测。术语ta将为所属领域的技术人员众所周知的，并且是指在引物延伸反应期间发生显著引物延伸的温度(通常设定或程序化到控制反应参数的设备中)。通常，在整个多核苷酸扩增反应中将基本上使用相同的ta。有时在多核苷酸扩增反应的最初几轮中会使用不同的ta(通常更高)。通常，从组合反应物组分或进行第一次引物延伸反应开始直至终止或完成反应为止，ta的变化范围不会超过10℃，通常不会超过5℃或不超过2℃。合适的ta适合于链置换dna聚合酶的操作，并且是有助于模板特异性引物杂交和延伸的ta。合适的反应温度可在50℃与75℃之间，如在60℃与65℃之间。可以在第一引物延伸反应之前进行初始变性步骤，以分离目标核酸分子的链。举例来说，除链置换dna聚合酶以外，反应混合物可以加热到约95℃持续约5分钟，然后在添加链置换dna聚合酶之前冷却到约4℃，并且在反应温度下培育。初始变性步骤可能不是必需的。例如，xu等人，2012，同前文献，描述了一种等温方法，其中在反应缓冲液中包括甜菜碱以在反应温度下引起自发形成局部变性气泡。bstdna聚合酶，大片段是合适的链置换dna聚合酶并且具有在升高的温度下的活性，并且在50℃至70℃稳定>30分钟。通过进行标准等温多核苷酸扩增反应，可以轻易地筛选现有聚合酶的变异体，例如使用拉姆达dna(nagamine等人，摩尔.cel.探针，16：223-9(2002))的标准lamp，其中使用标准引物浓度，在60℃到68℃下，在少于30分钟内，将5ng拉姆达噬菌体基因组dna的充足扩增视为阈值检测。与野生型bstdna聚合酶相比，适合的聚合酶变异体包括bst2.0或bst2.0warmstarttmdna聚合酶或9°ntm聚合酶(新英格兰生物实验室，伊普威治，质量。)、大片段，其中多重反应时间可以减少到少至5分钟到30分钟，而信号没有显著减少。另一适合的聚合酶变异体为bst3.0(新英格兰生物实验室，伊普威治，质量。)，其为计算机设计的芽孢杆菌脂肪酰基杆菌dna聚合酶i的同源物、经工程改造用于改进等温扩增性能和提高逆转录活性的大片段。bst3.0dna聚合酶含有具有dna或rna模板的5′→3′dna聚合酶活性和强链置换活性，但缺乏5′→3′和3′→5′核酸外切酶活性。通常，链置换dna聚合酶缺乏5'-3'核酸外切酶和/或3'-5'核酸外切酶活性。缺乏3'-5'核酸外切酶活性可以促进扩增特异性。通常，5'-3'核酸外切酶活性不存在或处于低含量以避免或减少置换的链的降解。在某些实施方案中，链置换dna聚合酶为存在于反应中的唯一酶。在其它实施方案中，可以包括另一种酶，如错配结合蛋白，例如水生栖热菌，其可以减少错配和背景扩增，如关于smap方法在上文的lezhava和hayashizaki,2009，同前文献中所描述。5'-3'核酸外切酶(如果存在)可以是gspssddna聚合酶i、大片段；gspssd2.0dna聚合酶i、大片段；或gspm3.0dna聚合酶i、大片段，所有这些都是热稳定的并且还具有逆转录酶活性。可以包括无机焦磷酸酶以防止在反应期间的焦磷酸的累积，例如购自英国optigene有限公司(目录号iso-001nd)的无机焦磷酸酶或公开于wo9612798中的海滨嗜热球菌的耐热焦磷酸酶。在一个实施方案中，存在于反应中的唯一酶为链置换dna聚合酶和无机焦磷酸酶。在实践本发明的方法时，有必要产生多核苷酸扩增混合物，例如包括发生多核苷酸扩增反应所必需的所有元素的组合物。反应混合物包括引物延伸反应中采用的引物。可以使用一个或多个寡核苷酸引物组，每个组包含一个或多个寡核苷酸引物集合。每个集合可通常具有正向引物和反向引物。如上所述，通常可使用1、2、3、4个或更多个引物组。每个组可通常包括一个引物集合(除非，例如，存在的原因为为何其愿意测量由两个单独引物集合产生的组合扩增产物)。每个多核苷酸扩增混合物通常将包含至少两种或三种正向引物。还可以存在用于每个正向引物的对应反向引物，但这些引物可能不会不同，例如在snp基因分型反应中，其中共同反向引物可以与数种不同正向引物一起使用。多核苷酸扩增混合物包括至少一对标记的寡核苷酸(一个或多个盒寡核苷酸集合)，其中寡核苷酸彼此杂交以形成荧光淬灭对，其中一个寡核苷酸用荧光部分标记并且另一个寡核苷酸用淬灭部分标记。每个集合的荧光标记的寡核苷酸包含能够与特定组的每个引物集合的第一寡核苷酸引物(正向引物)的荧光盒特异性区域的补体杂交的序列。充当模板的核酸可以是单链或双链，其中核酸通常是脱氧核糖核酸(dna)，但可替代地为核糖核酸(rna)。模板核酸的长度可以短至20bp，但通常至少约50或100bp长，并且更通常至少约150bp，并且可以长至1,000或10,000bp或更长。例如，长度为50,000bp或更长，包括基因组dna提取物，其消化物或粗裂解物等。核酸可以在溶液中游离，其一端或两端侧接载体中存在的非模板核酸，例如质粒等，唯一的标准是核酸可用于参与引物延伸反应。模板核酸可以纯化形式存在，或以与其它非模板核酸的复杂混合物形式存在，例如在细胞dna制备等中。取决于进行pcr的应用，模板核酸可衍生自多种不同来源，其中此类来源包括包含核酸的生物，即病毒；原核生物，例如细菌、古细菌和蓝细菌；和真核生物，例如脊椎动物，包括爬行动物、鱼类、鸟类、蛇和哺乳动物，例如啮齿动物、灵长类动物，包括人类。模板核酸可以直接从其天然来源获得，例如作为粗裂解物，和/或可以以多种如本领域已知的不同的方式进行预处理。在一些实施方案中，模板核酸可以来自合成源。如所属领域中已知，反应混合物可含有各种缓冲剂组分、盐、dntp、缓冲剂、二价阳离子(例如来源于镁盐)。可包括mgso4，通常在3.5mm-5.5mm范围内，例如4mm的浓度。寡核苷酸引物如上所述，每个寡核苷酸引物集合包括第一寡核苷酸引物(正向引物)，其包含荧光盒特异性部分和3'下游目标特异性部分；和一种或多种目标特异性寡核苷酸引物。第一寡核苷酸引物可以包括一个或多个其它引物部分，并且同样地，目标特异性寡核苷酸引物中的一个或多个可包含超过一个引物部分。“引物部分”是指在多核苷酸扩增产物的形成中起作用的引物的一部分。典型的引物部分是目标特异性部分，但也可以包括自退火部分。适当地，所述或每个引物部分经设计以具有预期比反应物的ta高约5℃的熔融温度(tm)。寡核苷酸的tm是以℃为单位的温度，在所述温度下，单链寡核苷酸群体中的50％的分子与它们的互补序列杂交，并且群体中50％的分子不与所述互补序列杂交。用于测定序列的tm的常用公式为tm＝4(g c) 2(a t)。寡核苷酸对的tm也可以凭经验测量，例如可以使用解链曲线分析来测量tm，例如使用96孔白板上的罗氏lightcycler480仪器。可以在不存在聚合酶的情况下在标准反应缓冲液中测试tm。实施例中指出了标准反应缓冲液。可以通过lightcycler480分析函数(-df/dt)从熔融曲线数据中产生熔融峰。通过使用手动tm选项来计算温度以识别反向熔融峰中的最低点。当参考tm进行涉及寡核苷酸的部分的杂交时，相关tm被视为可以使用对应于所述寡核苷酸的相关部分的测试寡核苷酸确定杂交的tm。具有合适的tm的引物部分通常具有在18与30个核苷酸之间的序列长度。通常，相对于荧光盒特异性部分，第一寡核苷酸引物(正向引物)具有5'上游目标特异性部分。在某些实施方案中，相对于荧光盒特异性部分，第一寡核苷酸引物(正向引物)可具有5'上游自退火部分。“自退火”意指所述部分在反应物的ta下形成发夹结构，例如通过具有为其3'部分的反向补体的5'部分。通常，涉及第一寡核苷酸引物的多核苷酸扩增方法不是聚合酶螺旋反应，如liu等人，2015，科学报导5：12723.doi：10.1038/srep12723，聚合酶螺旋反应(psr)：一种新型的等温核酸扩增方法中所述。在一个实施方案中，相对于荧光盒特异性部分，第一寡核苷酸引物(正向引物)具有5'上游目标特异性部分。包括这样的第一寡核苷酸引物的寡核苷酸引物集合可以适当地应用于环介导等温扩增(lamp)、交叉激活扩增(cpa)或智能扩增(smap)。如上文的notomi等人，2000，同前文献中所述，环介导等温扩增(lamp)反应需要两个内部引物和两个外部引物。内部引物称为正向内部引物(fip)和反向内部引物(bip)，并且每个引物含有两个与目标dna的有义和反义序列相对应的目标特异性部分，一个用于激活第一阶段，并且另一个用于激活后期的自激活。第一阶段中的外部引物的延伸使得相应内部引物的延伸产物被链置换聚合酶置换。在后续阶段中，正向引物可以杂交到单链环结构，所述单链环结构通过5'上游目标特异性部分与其延伸产物中的补体的杂交形成。可以包括其它引物以加快反应，如在nagamine等人，2002，同前文献中所描述。在一个实施方案中，fip和/或bip引物可以经修改以包括5'上游和3'下游目标特异性部分之间的荧光盒特异性部分。在xu等人，2012，同前文献中描述的“单”和“双”交叉激活扩增(cpa)中，扩增产物的任一端或两端分别包括由交叉引物形成的环。在“单”cpa中，交叉引物含有5'尾部序列，其与互补链的引物相同。其允许通过从上游引物延伸的链置换，并且将第二定义的激活位点并入所得产物的5'端中。反向链的引物各自由与模板互补的单个序列组成，并且经过选择以使它们与模板串联结合，从而提供了带切口的双链dna区域，所述区域可通过置换dna聚合酶延伸。在“双”cpa中，使用正向和反向反义引物，并且每一交叉引物含有与彼此的激活位点一致的5'尾部序列，从而在每一轮延伸中引入额外引发位点。在一个实施方案中，可以对“单”cpa中的交叉引物或“双”cpa中的一个或两个交叉引物进行修饰以包括5'上游和3'下游目标特异性部分之间的荧光盒特异性部分。在lezhava和hayashizaki，2009，同前文献中描述的智能扩增(smap)中，带尾的折回引物(tp)和带尾的折叠引物(fp)激活来自任一链的延伸反应，并且自身被外部引物置换。通常还包括升压引物。外部引物和tp可分别与lamp中使用的外部引物和fip或bip相同。但是，fp与fip或bip的不同之处在于，它的尾部不是目标特异性部分，而是自退火部分，其可以作为发夹存在。这促进了从fp自激活dna合成，从而使反应永久化。确切地说，当产生折叠区段的补体时，合成产物的3'端自杂交并且充当引物以合成目标的额外链。在一个实施方案中，tp可以经修改以包括5'上游和3'下游目标特异性部分之间的荧光盒特异性部分。在替代实施方案中，相对于荧光盒特异性部分，第一寡核苷酸引物(正向引物)具有5'上游自退火部分。包括这样的第一寡核苷酸引物的寡核苷酸引物集合可以适当地应用于smap。此实施方案对应于smap，其中fp经修改以包含荧光盒特异性部分。假定第一寡核苷酸引物除了荧光盒特异性部分之外还可含有一个或两个引物部分，其长度通常可以为30至120个核苷酸，例如长度为40至90个核苷酸、或长度为40至80个核苷酸。引物适合地包括于扩增反应中，如在lamp、cpa或smap中，浓度范围为0.1-2.0μm。对于lamp反应，优选浓度为：在0.8到2.0μm下的bip/fip引物、在0.2到0.8μm下的f3/b3引物、以及在0.4到1.0μm下的loopf/loopb(如果存在)。对于lamp、cpa和smap中的每一个，示例性引物浓度和反应条件在howard等人，2015，同前文献中描述。盒寡核苷酸集合和荧光盒特异性部分如上所述，特定组中的每个第一寡核苷酸引物(正向引物)的荧光盒特异性部分或“标签”序列通常可以相同或紧密相关，例如，相同的长度或长度上的差异少于约10，更通常为5、4、3、2或1个核苷酸，并且可能不超过3、2或1个不同的核苷酸。这些荧光盒特异性部分完全相同可能是最直接的，但不是必须的，这使得寡核苷酸设计具有更大的灵活性。一组的荧光盒特异性部分或标记序列通常会与另一组的荧光盒特异性部分或标记序列明显不同，使得一组的荧光盒特异性部分与另一组的荧光盒特异性部分的补体之间实际上没有相关的杂交，如本领域技术人员将显而易见。合适的盒寡核苷酸集合和荧光盒特异性部分描述于us2007/117108a1、us2013/252238a1和wo2014/135872a1中。一组中的第一个寡核苷酸引物(正向引物)的每个都有(通常相同或紧密相关)荧光盒特异性部分。在将互补序列引入(例如，通过引物延伸反应的进程，当存在将特定引物集合的引物的目标核酸导入时)荧光盒特异性部分(它的萤光标记的荧光盒寡核苷酸能够杂交)时，产生了可检测信号，因为受体(淬灭剂)标记的荧光盒寡核苷酸不太可能与萤光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸结合并且使来自荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸的信号淬灭。当多核苷酸扩增反应进行并且产生能够杂交的荧光标记的荧光盒寡核苷酸的更多延伸产物时，产生的信号通常越大。因此，除了荧光团域外，荧光标记的寡核苷酸还包含能够与给定组的第一寡核苷酸引物(正向引物)的荧光盒特异性部分的补体杂交的序列，所述“标签”序列与核酸序列(延伸产物)结合，所述核酸序列是作为标记的引物或反应中包括的引物(其可以是未标记的，或其可例如在随后轮的引物延伸反应中为萤光标记的盒寡核苷酸自身)，例如在严格杂交条件下。荧光标记的寡核苷酸可或可不能够充当多核苷酸扩增反应中的引物(例如可具有3'oh组)。如果用所述荧光部分标记的第一盒寡核苷酸或荧光部分标记的第一盒寡核苷酸能够在多核苷酸扩增反应中用作引物，则通常认为形成了更多的引物延伸产物，并因此获得了更好的信号。受体/淬灭剂标记的荧光盒寡核苷酸可通常不能够充当引物延伸反应中的引物，例如因为受体/淬灭剂可阻止寡核苷酸充当引物。除受体域外，受体部分标记的盒寡核苷酸能够与相应的荧光标记的盒寡核苷酸杂交以形成荧光淬灭对。通常，荧光标记的盒寡核苷酸不包含目标序列特异性部分，即不包含与目标多核苷酸杂交的序列(在多核苷酸扩增反应的ta下)，第一寡核苷酸引物(一个或多个)的目标特异性部分意图与目标多核苷酸杂交。因此，在这种排列中，荧光标记的盒寡核苷酸不与特定的目标序列结合，而是可以用于(与适当的寡核苷酸引物集合一起)检测由任何目标序列产生的多核苷酸扩增产物。荧光标记的盒寡核苷酸(和相应的受体/猝灭剂标记的盒寡核苷酸)可以包括在“主”测定混合物中，与(目标特异性)“测定”混合物一起使用。通常，受体/供体标记的盒寡核苷酸也不包含目标序列特异性部分。因此，在一个实施方案中，每个集合中的第一盒寡核苷酸和第二盒寡核苷酸不包含目标特异性部分。在替代的排列中，第一寡核苷酸引物是荧光标记的盒寡核苷酸，并且荧光标记直接并入扩增产物中。通常，荧光标记的盒寡核苷酸由荧光部分(供体部分)和能够与第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的补体杂交的序列组成。通常，受体/淬灭剂标记的盒寡核苷酸由受体/淬灭剂部分和能够与荧光标记的盒寡核苷酸的荧光盒特异性部分杂交的序列组成。荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸与受体(淬灭剂)标记的荧光盒寡核苷酸之间的相互作用通常不如荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸与相关组的每个引物集合的正向寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分互补的延伸产物之间的相互作用稳定。此类排列可适用于实现避免异常信号的产生与允许引物延伸反应有效地进行之间的最优平衡。因此，荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸与受体(淬灭剂)标记的荧光盒寡核苷酸(本文中tma)之间的杂交的tm可以低于荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸与相关组的每个引物集合的正向寡核苷酸引物(本文中tmc)的荧光盒特异性部分互补的延伸产物的杂交的tm(例如，在约1℃与低于10℃之间)。在一实施方案中(例如，当荧光标记的盒寡核苷酸不包含目标特异性序列时)，淬灭剂标记的盒寡核苷酸比荧光标记的盒寡核苷酸短1到5个核苷酸碱基，通常，荧光标记的盒寡核苷酸的不成对的(相对于淬灭剂标记的盒寡核苷酸)部分在荧光标记的盒寡核苷酸的3'端处，或与淬灭剂标记的盒寡核苷酸的5'端“相反”。与荧光标记的寡核苷酸的补体杂交的相关寡核苷酸引物(或引物)的部分通常在荧光标记的盒寡核苷酸的约5个核苷酸长度(例如5、4、3、2或1个核苷酸之间更短，和5、4、3、2或1个核苷酸之间更长；例如相同长度)内，例如长度的任何差异通常在寡核苷酸引物和荧光标记的寡核苷酸的5'端处。在随后轮的多核苷酸扩增反应中，荧光标记的盒寡核苷酸自身可充当引物，因此引物延伸期间形成的补体将通常延伸到荧光标记的盒寡核苷酸的5'端。因此，与淬灭剂标记的盒寡核苷酸杂交的补体部分通常与淬灭剂标记的盒寡核苷酸一样长。在其它实施方案中，相比于在相关寡核苷酸引物(或引物)和荧光标记的盒寡核苷酸的补体之间，淬灭剂标记的盒寡核苷酸与荧光标记的盒寡核苷酸之间可替代地或另外存在更多(或更显著)的不匹配。如所属领域的技术人员众所周知，寡核苷酸对内的不匹配的位置和不匹配的性质(例如a:t配对或g:c配对是否被破坏)将影响不匹配对tm的稳定性/变化的改变的重要性。在又其它实施方案中，可替代地或另外，相对于引物延伸反应混合物(并且因此并入引物的补体中)中所使用的那些，在淬灭剂标记的盒寡核苷酸中可以使用不同的核苷酸/碱基，由此改变淬灭剂标记的盒寡核苷酸与荧光标记的盒寡核苷酸和引物延伸产物之间的杂交的相对稳定性。通常，对于本领域技术人员显而易见的是，在淬灭剂标记的盒寡核苷酸中可以使用一个或多个“非标准”碱基并且在引物延伸混合物中使用“标准”碱基，但是其它排列也是可能的。一个或多个荧光淬灭对的tm(tma)通常在等温多核苷酸扩增反应的ta的(±)20℃之内，例如在(±)10℃之内。在示例性实施方案中，如us2007/117108a1中所述，荧光淬灭对的tm可以为约55℃，如us2013/252238a1中所述在48至50℃之间，或如wo2014/135872a1中所述为约62℃。在一个实施方案中，一个或多个荧光淬灭对的tm(tma)高于等温多核苷酸扩增反应的ta，如比等温多核苷酸扩增反应的ta高最多15℃、最多10℃或在1℃与10℃之间。在此排列中，在荧光获取温度下将未并入的荧光寡核苷酸杂交到淬灭剂寡核苷酸，允许实时或在终点监测反应。此实施方案的优点为可在扩增反应的温度下进行实时检测；不需要反应物冷却。合适的荧光猝灭对和荧光盒特异性寡核苷酸部分描述于wo2014/135872a1中。独立地，tma高于、处于或低于ta下，每个集合中的第一或第二寡核苷酸盒中的一个可以具有tm，所述tm处于或低于等温多核苷酸扩增反应的ta。通常，第二寡核苷酸盒的tm为ta或低于ta，并且第一寡核苷酸的tm高于反应的ta。在此排列中，单标记的寡核苷酸序列具有不同tm，并且具有较大tm的寡核苷酸序列通常比另一个长超过10个核苷酸，并且优选地长至少15个核苷酸。us2007/117108a1和us2013/252238a1中描述了适合的荧光淬灭对和荧光核特异性寡核苷酸部分。在本发明中，一对标记的荧光盒寡核苷酸(或引物寡核苷酸)中的一个或两个可含有修饰的碱基，例如硫代磷酸酯修饰的碱基。在任何给定的寡核苷酸/引物中，被硫代磷酸酯取代的磷酸二酯键的数目可以在从无到被硫代磷酸酯取代的所有磷酸二酯键的范围内，例如一个，两个，三个，四个或更多个。寡核苷酸/引物可以在5'和/或3'端含有硫代磷酸酯，然而，优选的是，作为此类末端修饰的替代或补充，寡核苷酸/引物的内部碱基中的至少一个是硫代磷酸酯。举例来说，10-90％、20-80％、30-70％或40-60％的碱可为硫代磷酸酯。在一个实施方案中，经硫代磷酸酯修饰的碱基(其中存在超过一个)由至少一种，例如一到三种未经修饰的(磷酸二酯)碱基分离，例如寡核苷酸/引物内的替代性碱基可以是硫代磷酸酯。在一个实施方案中，其可尤其适用于荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸或寡核苷酸以含有经硫代磷酸酯修饰的碱基。认为经硫代磷酸酯修饰的碱的存在可有助于减少可能是荧光的异常产物的形成，并因此使得错误的荧光信号产生。参见例如us2013/0252238，其关于硫代磷酸酯并入模式的讨论也被认为对于本发明也是有用的。信号检测当合适的荧光能量供体和能量受体部分彼此紧邻时，发生荧光能量转移。供体吸收的激发能转移到受体上，然后可以通过荧光发射(如果是荧光团)或通过非荧光手段(如果是淬灭剂)进一步耗散此能量。供体-受体对包含两个-荧光基团和具有重叠光谱的荧光修饰基团，其中供体(荧光基团)发射与受体(荧光修饰)吸收重叠，使得存在从激发荧光团到所述对的另一个成员的能量转移。因此，本发明的标记的寡核苷酸对(荧光盒寡核苷酸集合)为核酸检测器，其在单独的寡核苷酸上包括荧光团域和第二寡核苷酸，荧光能量供体(即供体)安置于荧光团域，第二寡核苷酸具有受体域，其中荧光能量受体(即受体)安置于所述受体域内。如上所述，供体寡核苷酸包括供体荧光团。供体荧光团可以位于核酸检测器中的任何地方，但通常存在于寡核苷酸的5'端处。受体域包括荧光能量受体。受体可以位于受体域中的任何地方，但通常存在于寡核苷酸的3'端处。在本发明中，在一对标记的寡核苷酸中，每个寡核苷酸可以含有一种或多种标记，例如1、2或3种标记。盒寡核苷酸中的一个或两个优选地含有单个标记，更优选两个寡核苷酸含有一个标记。举例来说，荧光标记的盒寡核苷酸优选地在寡核苷酸的5'端处或内含有标记，并且淬灭剂标记的盒寡核苷酸在寡核苷酸的3'端处或内含有标记。可以选择标记的寡核苷酸对的荧光团，以使其选自相似的化学家族或不同的化学家族，例如花青染料、呫吨等。所关注的荧光团包括(但不限于)荧光素染料(例如5-羧基荧光素(5-fam)、6-羧基荧光素(6-fam)、2',4',1,4,-四氯荧光素(tet)、2',4',5',7',1,4-六氯荧光素(hex)和2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(joe)、花青染料(如cy5、丹酰基衍生物)、若丹明染料(例如四甲基-6-羧基罗丹明(tamra))和四丙烷-6-羧基罗丹明(rox))、dabsyl、dabcyl、花青(如cy3、蒽醌、硝基噻唑)和硝基咪唑化合物或其它非嵌入染料。所关注的荧光团进一步描述在国际专利申请wo01/42505和wo01/86001中。如果使用多于一个引物组(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)并且因此使用数个盒寡核苷酸集合，那么对于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(或更多)个寡核苷酸集合中的每一个，荧光团组通常可以是不同的。受体(例如淬灭剂)组可以相同或不同，只要它们能够以令人满意的方式调节配对的荧光团组的荧光即可。通常在单个反应管中使用1、2、3或4个不同的引物组(每个引物组可以具有一个或多个引物组，通常是一个引物组)，并且因此可以使用1、2、3或4个盒寡核苷酸集合。限制因素可为有可能区分的不同光谱的数目，其可取决于可用的荧光产生/测量设备的特征。选择相容的荧光团和受体/猝灭剂集合的考虑是本领域技术人员已知的。可以通过在多核苷酸扩增反应期间或之后的任何点测量信号来检测在本发明的方法中产生的信号。信号的测量可为定性或定量的。可在反应结束时检测到信号，或可实时地检测到信号。在荧光淬灭对的tm低于扩增反应的ta的情况下，可以周期性地冷却反应物以允许测量，例如到荧光淬灭对的tm或低于所述tm的温度。通常，仅将温度冷却到检测荧光所需的程度。例如，可以每五分钟将反应物冷却至37℃。受体标记的盒寡核苷酸相对于荧光团标记的盒寡核苷酸的比例可以在多核苷酸扩增反应中改变，以优化获得的信号和/或最小化在“无模板对照”(ntc)中产生的信号。合适的比例可以是至少0.75：1、1：1、1.5：1、2：1、3：1、4：1或5：1，例如在1：1和10：1之间，例如在盒寡核苷酸集合中受体标记的盒寡核苷酸与荧光团标记的盒寡核苷酸在1：1和5：1之间。应用本发明可用于多种不同的应用中，并且特别适合用于等位基因特异性snp基因分型、体细胞突变检测、病原体检测、基因表达研究或拷贝数变异研究等。定义如本文所用，“核酸”是指单链或双链的dna、rna和它们的任何化学修饰。修饰包括但不限于那些提供其它化学基团的修饰，这些化学基团将额外的电荷、极化性、氢键、静电相互作用和功能性结合到核酸上。此类修饰包括(但不限于)2'-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫尿苷的取代、5-溴或5-碘尿嘧啶的取代；主链修饰、甲基、异常碱基配对组合，如异碱基异胞嘧啶和异胍等。修改还可包括3'和5'修饰，例如封盖。如本文所用，“互补”是指一对含氮碱基，其由通过氢键连接至嘧啶的嘌呤组成，其连接dna或接合dna和rna的杂交分子的互补链。如本文所用，“荧光基团”是指在具有选定波长的光激发时发射不同波长的光的分子。荧光基团也可以称为“荧光团”。如本文所用，“荧光修饰基团”是指可以以任何方式改变来自荧光基团的荧光发射的分子。荧光修饰基团通常通过能量转移机制来实现。取决于荧光修饰基团的身份，荧光发射可以经历许多改变，包括但不限于衰减、完全猝灭、增强、波长改变、极性改变、荧光寿命改变。荧光修饰基团的一个实例是淬灭基团。如本文所用，“能量转移”是指通过荧光修饰基团改变荧光基团的荧光发射的过程。如果荧光修饰基团是淬灭基团，则来自荧光基团的荧光发射减弱(淬灭)。能量转移可以通过荧光共振能量转移或通过直接能量转移发生。在这两种情况下，精确的能量转移机制是不同的。应当理解，在本申请中对能量转移的任何引用都包括所有这些机械上不同的现象。能量转移在本文中也称为荧光能量转移或fet。如本文所用，“能量转移对”是指参与能量转移的任何两个分子。通常，分子中的一个充当荧光基团，并且另一个充当荧光修饰基团。这样的对可包含例如两个可以彼此不同的荧光基团和一个猝灭基团、两个猝灭基团和一个荧光基团、或多个荧光基团和多个猝灭基团。在存在多个荧光基团和/或多个淬灭基团的情况下，各个荧光基团和/或淬灭基团可以彼此不同。本发明的优选的能量转移对包含荧光基团和猝灭基团。在一些情况下，荧光基团与荧光修饰基团之间的区别可为模糊的。举例来说，在某些情形下，两个邻近荧光素基团可经由直接能量转移彼此淬灭荧光发射。因此，在本申请中对能量转移对的各个成员的身份没有限制。所需要的是，如果单个构件之间的距离改变了某个临界值，则整个能量转移对的光谱特性会以某种可测量的方式改变。如本文所用，“引物”是指当置于可以发生与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时能够充当合成的起始点的寡核苷酸。因此，能够充当引物的寡核苷酸可通常具有3'oh基团。如本文所用，“猝灭基团”是指可以至少部分衰减由荧光基团发射的光的任何荧光修饰基团。我们在此将这种衰减称为“猝灭”。因此，在存在淬灭基团的情况下荧光基团的发光使得发射信号强度比预期的要弱，或者甚至完全不存在。通过荧光基团和淬灭基团之间的能量转移发生淬灭。如本文所用，“荧光共振能量转移”或“fret”是指其中由激发的荧光基团发射的光至少部分地被荧光修饰基团吸收的能量转移现象。如果荧光修饰基团是淬灭基团，则所述基团可以将吸收的光作为不同波长的光辐射，或者可以将其作为热量耗散。fret取决于荧光基团的发射光谱和淬灭基团的吸收光谱之间的重叠。fret还取决于淬灭基团与荧光基团之间的距离。在某个临界距离以上，淬灭基团无法吸收荧光基团发出的光，或者吸收能力很差。如本文所用，“带尾引物”是指含有至少两个域的寡核苷酸，一个对所关注的目标核酸(例如，dna)具有特异性，即能够与所述目标核酸杂交，并且另一个序列(通常是目标特异性序列的5')充当生产包含库“标签”序列的补体的延伸产物的模板。然后，“标签”序列的补体可以结合至例如相应的荧光标记的盒寡核苷酸的“标签”部分(其可能缺少“标签”部分以外的任何序列)。加标签的引物还可在上面提到的两个域和/或标签之间包含另外的区域，例如接头。如本文所用，“直接能量转移”是指其中在荧光基团和荧光修饰基团之间不发生光子通过的能量转移机制。不受单一机制的束缚，据信在直接能量转移中，荧光基团和荧光修饰基团彼此干扰电子结构。如果荧光修饰基团是淬灭基团，则将使得淬灭基团阻止荧光基团发光。通常，通过直接能量转移进行淬灭比通过fret淬灭更有效。实际上，一些不能通过fret淬灭特定荧光基团的淬灭基团(因为它们与荧光基团之间没有必要的光谱重叠)可以通过直接能量转移有效地做到这一点。此外，如果一些荧光基团与其它荧光基团足够接近以引起直接的能量转移，它们本身可以充当淬灭基团。举例来说，在这些条件下，两个邻近荧光素基团可有效地淬灭彼此的荧光。由于这些原因，对用于实施本发明的荧光基团和猝灭基团的性质没有限制。当提及“杂交”或寡核苷酸和/或引物“杂交”另一核苷酸序列的能力时，技术人员将理解，这种杂交能够在多核苷酸扩增反应中普遍存在的条件下发生，其中利用寡核苷酸和/或引物。试剂盒本发明还提供了适用于检测一种或多种多核苷酸扩增产物的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：i)第一寡核苷酸引物(正向引物)，其包含5'上游目标特异性或自退火部分、荧光盒特异性部分和3'下游目标特异性部分；和ii)一种或多种目标特异性寡核苷酸引物；其中在具体集合中的寡核苷酸引物各自适合于与目标多核苷酸的链杂交，以允许在等温多核苷酸扩增反应中形成所述目标多核苷酸的扩增产物；并且其中相同组中的每个集合的所述第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，其能够与相同组中的任何集合的所述第一寡核苷酸引物的所述荧光盒特异性部分的补体杂交；b)一种或多种盒寡核苷酸集合，每个集合的特征在于：i)第一盒寡核苷酸，其用荧光部分(供体部分)标记并且具有能够与给定寡核苷酸引物组中的任何集合的所述第一寡核苷酸引物的所述荧光盒特异性部分的所述补体杂交的序列；和ii)第二盒寡核苷酸，其用受体部分(例如淬灭剂部分)标记；其中每个集合的所述盒寡核苷酸彼此杂交以形成荧光淬灭对。本发明还提供了适用于检测一种或多种多核苷酸扩增产物的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：i)第一寡核苷酸引物(正向引物)，其包含荧光盒特异性部分和3'下游目标特异性部分；和ii)一种或多种目标特异性寡核苷酸引物；其中在具体集合中的寡核苷酸引物各自适合于与目标多核苷酸的链杂交，以允许在等温多核苷酸扩增反应中形成所述目标多核苷酸的扩增产物；并且其中相同组中的每个集合的所述第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，其能够与相同组中的任何集合的所述第一寡核苷酸引物的所述荧光盒特异性部分的补体杂交；b)一种或多种盒寡核苷酸集合，每个集合的特征在于：i)第一盒寡核苷酸，其用荧光部分(供体部分)标记并且具有能够与给定寡核苷酸引物组中的任何集合的所述第一寡核苷酸引物的所述荧光盒特异性部分的所述补体杂交的序列；和ii)第二盒寡核苷酸，其用受体部分(例如淬灭剂部分)标记；其中每个集合的所述盒寡核苷酸彼此杂交以形成荧光淬灭对；和c)链置换聚合酶。在任一试剂盒中，第一寡核苷酸引物通常可以是未标记的。荧光标记的盒寡核苷酸通常不包含目标特异性序列。寡核苷酸的进一步优选如上所述。根据本发明的试剂盒还可以含有适用于多核苷酸扩增反应的其它组分，如二价阳离子，例如来源于镁盐、脱氧核糖核苷酸5'三磷酸酯(dntp)、缓冲剂等。试剂盒可在第一容器中包含一个或多个盒寡核苷酸集合，任选地，其中第一容器包含用于进行多核苷酸扩增反应的其它组分，例如缓冲液、链置换聚合酶，并且任选地，其中第一盒寡核苷酸不包含目标特异性部分；和在单独的另一容器中的一个或多个寡核苷酸引物组。间接(实时)检测多核苷酸扩增产物此实施方案利用未标记的寡核苷酸引物引发lamp反应。fip或bip引物通过在5'上游和3'下游目标特异性序列之间引入“标签”dna序列来修饰，并且与其它五个lamp引物一起使用，如图1中所说明。反应中还包括单个荧光标记的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够与反应中生成的修饰的fip或bip引物的标签序列区域的补体杂交。存在许多合适的荧光团，受欢迎的选择是fam(荧光素的衍生物)。最后，包括于反应中的是3'淬灭剂标记的寡核苷酸与fam标记的寡核苷酸反义。存在许多合适的标签，其中黑洞(blackhole)淬灭剂系列标签是受欢迎的选择。因为淬灭剂寡核苷酸的长度足够长以产生高于反应物的ta的tm，所以可实时评估产物产生(例如使用罗氏lc480或abi7900棱镜仪器)。由于两个标记的寡核苷酸的互补性，它们彼此杂交。这种杂交使淬灭剂标记非常接近荧光团，从而使来自荧光团的所有荧光信号均被淬灭。起始多核苷酸扩增过程并且开始产生扩增产物。在最初的几轮扩增后，产生了标记的寡核苷酸的互补序列。然后，荧光寡核苷酸能够在多核苷酸扩增反应期间引发合成，并且如此进行。荧光寡核苷酸能够充当引物不是必需的，但是认为如果荧光寡核苷酸充当引物可以产生更多的产物，这可以提供更好的信号。这产生含有荧光分子的扩增子。一旦发生这种情况，由于扩增过程产生双链扩增子dna，因此淬灭寡核苷酸不太可能与荧光标记的寡核苷酸杂交。由于淬灭寡核苷酸不再与荧光标记的寡核苷酸杂交，随后因此产生了信号，所述信号与产生的扩增产物的量成正比并且可以被测量。修饰的fip或bip引物的标签区域不必与单一荧光标记的寡核苷酸相同，只要产生的标签区域的互补序列与荧光标记的寡核苷酸杂交即可。间接(端点)检测多核苷酸扩增产物-snp基因分型此实施方案利用如上文所描述的相同荧光团和淬灭剂标记的寡核苷酸对。snp基因分型利用至少两个标记的寡核苷酸对，例如2、3或4对，其中每对优选包含不同的荧光团，所述荧光团可彼此光谱分辨，例如fam和hex。标记的引物(每个对应于不同的寡核苷酸引物组，如上所述)用不同的序列标记，引物的非标记部分(通常称为正向)指向所关注的dna。在引物的3'目标特异性部分中，其可以仅通过单核苷酸，例如在其3'碱基处彼此不同。如本领域技术人员所公知的，每个引物针对所关注的dna中的多晶型碱基。进行引物延伸，由此引物仅在其与所关注的目标序列匹配时(例如当3'碱基完全匹配时)引发合成。当发生不匹配时，合成不会进行。在反应期间，取决于基因型的3'目标特异性部分能够引发合成(或这两者在异合子的情况下)。这使得引物的不同标记部分并入多核苷酸扩增产物中，从而阻碍了淬灭剂寡核苷酸与相应的荧光寡核苷酸的杂交。因此，根据等位基因特异性寡核苷酸中的哪一个已引发合成，产生信号。然后可以在荧光板读数器上读取并入一种或多种荧光团的扩增产物。然后可以绘制所得数据，并且生成一个荧光团与另一个荧光团的聚类图。然后可以基于聚类图确定所得的基因型。在本说明书和所附的权利要求书中，单数形式的“一个(a/an)”和“所述”包括复数形式，除非上下文另外明确指出。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。在提供值的范围时，应理解，除非上下文明确另外指出，所述范围上限和下限之间的至下限单位的十分之一的每个中间值，和任何其它叙述的值或该叙述的范围的中间值之间包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含于范围中并且也涵盖于本发明内，在所述范围内受到任何特定排他性限制。在所陈述的范围包括一个或两个限值时，排除了那些被包括的限值的任一个或两者的范围也被包括在本发明之内。除非上下文另有说明，否则本发明的给定方面、特征或参数的偏好和选项应被视为已经结合本发明的所有其它方面、特征和参数的任何和所有偏好和选项而公开。本文所提及的所有公开案均以最大可能的程度通过引用并入本文，以描述和公开公开案中所描述的那些组件，这些组件可能与当前描述的发明结合使用。将在以下实施例中进一步说明本发明，但不限于此。实施例1：在lamp反应中的线粒体snp基因分型由于线粒体dna是纯合子，因此单个样品仅具有一个snp等位基因，从而可以在多重反应中检测单个等位基因特异性扩增产物。线粒体snp基因分型分析(人类mtdna11719)用于证明使用lamp分析进行通用检测的概念验证。从人血中提取线粒体dna，并且相关的目标部分具有以下dna序列，其中snp以粗体显示：acaaaacacatagcctaccccttccttgtactatccctatgaggcataattataacaagctccatctgcctacgacaaacagacctaaaatcgctcattgcatactcttcaatcagccacatagccctcgtagtaacagccattctcatccaaaccccctgaagcttcaccggcgcagtcattctcataatcgcccacgg[a/g]cttacatcctcattactattctgcctagcaaactcaaactacgaacgcactcacagtcgcatcataatcctctctcaaggacttcaaactctactcccactaatagctttttgatgacttctagcaagcctcgctaacctcgccttaccccccactattaacctactgggagaactctctgtgctagtaaccacgttctc反向(bip)lamp引物bipkaspal1和bipkaspal2被设计成分别并入与fam(荧光素)或hex标记的盒寡核苷酸序列的一部分一致的通用标签序列，并且包括对应于待检测的等位基因的3'核苷酸。lamp引物如下表所示，标记序列用下划线标出，并且snp序列用粗体标出。表1：用于mtdna11719lamp测定的引物。如下将引物组合成整体混合物：表2：制备以产生250μl反应体积的lamp寡核苷酸的整体混合物。寡核苷酸起始浓度增加的体积161-6fip100μm75μl161-6f3100μm25μl161-6b3100μm25μl161-6lf100μm50μl161-6lb100μm50μl161-6bipkaspal1100μm37.5μl161-6bipkaspal2100μm37.5μl超纯水纯的637.5μl盒寡核苷酸序列如下所示：表3：盒寡核苷酸序列。fam荧光剂/56fam/tcagaaggtgaccaagttcatgchex荧光剂/5hex/actgaaggtcggagtcaacggafam淬灭剂catgaacttggtcaccttcgga/3dab/hex淬灭剂cgttgactccgaccttcag/3dab/如下制备20×盒混合物：表4：盒混合物。寡核苷酸起始浓度增加的体积fam荧光剂100μm11.6μlhex荧光剂100μm11.6μlfam淬灭剂500μm18.93μlhex淬灭剂500μm18.93μltris/edtaph8.310mmtris，0.1mmedta938.94μl购入等温预混液，其包含链置换dna聚合酶、无机焦磷酸酶、反应缓冲液，mgso4和dntps(optigeneltd，英国，目录号iso-001nd)，并且按以下方式组合试剂(每个反应)：表5：反应混合物。试剂浓度体积等温预混液随附，约为1.7倍15μl引物混合物如上3.75μl荧光剂/淬灭剂混合物20x1.25μl样品约5ng/μl5μl扩增在25μl反应物中在罗氏lightcycler480仪器上在96孔白色板中进行。在65℃下进行90分钟的扩增，每分钟(一个循环)进行荧光检测。在90分钟培育之后，将反应物冷却到37℃并且进行最终荧光读数。实时扩增数据显示在图2a(fam检测)和2b(hex检测)中。这些数据表明扩增可以在二十分钟内完成。图2c中的终点分析显示，即使在90分钟后，fam或hex荧光产品的聚类组仍可区分，这反映了不同样品中mtdna11719snp的不同等位基因的存在。实施例2：线粒体snp基因分型的其它lamp反应使用不同的链置换dna聚合酶重复实施例1的线粒体snp基因型分析。如下将如关于实施例1所描述的引物组合到整体引物混合物中：表6：整体引物混合物寡核苷酸起始浓度增加的体积161-6fip100μm100μl161-6f3100μm25μl161-6b3100μm25μl161-6lf100μm50μl161-6lb100μm50μl161-6bipkaspal1100μm50μl161-6bipkaspal2100μm50μl超纯水纯的775μl使用实施例1中所描述的盒寡核苷酸序列的20×盒混合物如下制备：表7：盒混合物。寡核苷酸起始浓度增加的体积fam荧光剂500μm2.32μlhex荧光剂500μm2.32μlfam淬灭剂500μm18.93μlhex淬灭剂500μm18.93μltris/edtaph8.310mmtris,0.1mmedta938.94μl使用bst3.0dna聚合酶(neb目录号m0374)和从新英格兰生物实验室购买的随附试剂，按照表8制备等温预混液。如在最后的反应混合物中等温扩增缓冲液ii(neb目录号b0374s)随后稀释到1x，提供20mm的tris-hcl，10mm的(nh4)2so4，150mmkcl，2mmmgso4，0.1％20，(ph8.8在25℃下)。预混液中包含的额外mgso4使mgso4的最终浓度达到4mm，这是反应的最佳浓度。mgso4最终浓度的优选范围是3.5mm-5.5mm。表8：25个反应的等温预混液。组分起始浓度增加的体积等温扩增缓冲液ii10x62.5μlmgso4100mm12.5μlbst3.0dna聚合酶8000u/ml25μldntps25mm35μl无核酸酶水纯的215μl如下组合试剂(每25μl反应物)：表9：反应混合物。试剂浓度体积等温预混液如上14μl引物混合物如上4.5μl荧光剂/淬灭剂混液20x1.5μl样品约5ng/μl5μl如实施例1中进行扩增并且来自若干实验的代表性结果展示于图3a-c中。当前第1页1 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技术特征：1.一种检测一种或多种多核苷酸扩增产物的方法，所述方法包含以下步骤：
a)提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个组包含一个或多个寡核苷酸引物集合，每个集合的特征在于：
i)第一寡核苷酸引物(正向引物)，其包含荧光盒特异性部分和3'下游目标特异性部分；和
ii)一种或多种目标特异性寡核苷酸引物；
其中具体集合中的寡核苷酸引物各自适合于与目标多核苷酸的链杂交，以允许在等温多核苷酸扩增反应中形成所述目标多核苷酸的扩增产物；
并且其中相同组中的每个集合中的所述第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，其能够与所述相同组中的任何集合中的所述第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的补体杂交；
b)提供一个或多个盒寡核苷酸集合，每个集合的特征在于：
i)第一盒寡核苷酸，其用荧光部分(供体部分)标记并且具有能够与给定寡核苷酸引物组中的任何集合中的所述第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的补体杂交的序列；和
ii)第二盒寡核苷酸，其用受体部分(例如淬灭剂部分)标记；
其中每个集合的盒寡核苷酸彼此杂交以形成荧光淬灭对；
c)在链置换dna聚合酶存在下引发等温多核苷酸扩增反应，由此产生(如果存在目标多核苷酸)相关第一寡核苷酸引物的至少一部分的互补序列，使得相关第二(受体，例如淬灭剂，标记的)盒寡核苷酸不太可能与相关第一(荧光标记的)盒寡核苷酸杂交，由此产生信号；和
d)检测所产生的所述信号。
2.根据权利要求1所述的方法，其中相对于所述荧光盒特异性部分，所述第一寡核苷酸引物(正向引物)具有5'上游目标特异性或自退火部分。
3.根据权利要求2所述的方法，其中相对于所述荧光盒特异性部分，所述第一寡核苷酸引物(正向引物)具有5'上游目标特异性部分，如其中所述等温多核苷酸扩增反应是环介导的等温扩增(lamp)、交叉引发扩增(cpa)或智能扩增(smap)。
4.根据权利要求2所述的方法，其中相对于所述荧光盒特异性部分，所述第一寡核苷酸引物(正向引物)具有5'上游自退火部分，如其中所述等温多核苷酸扩增反应是智能扩增(smap)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个集合中的所述第一和第二盒寡核苷酸不包含目标特异性部分。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个或多个所述荧光淬灭对的tm(tma)在扩增反应的ta的(±)20℃内，如(±)10℃内。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个或多个所述荧光淬灭对的tm(tma)高于所述等温多核苷酸扩增反应的ta，如比所述等温多核苷酸扩增反应的ta高最多15℃、最多10℃或1到10℃。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个集合中的第一或第二寡核苷酸盒中的一个具有等于或低于所述等温多核苷酸扩增反应的ta的tm。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述反应的终点处检测所述信号。
10.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其中实时检测所述信号。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一个寡核苷酸的至少一个碱基，例如至少一个所述盒寡核苷酸，任选地荧光标记的盒寡核苷酸，是硫代磷酸酯。
12.根据权利要求11所述的方法，其中至少一个所述寡核苷酸，例如至少一个所述盒寡核苷酸，任选地所述荧光标记的盒寡核苷酸中的20到80％的所述碱基是硫代磷酸酯。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中存在至少2个和任选地3、4、5、6、7、8、9或10个寡核苷酸引物组和对应的盒寡核苷酸集合。
14.一种适用于检测一种或多种多核苷酸扩增产物的方法中的试剂盒，所述试剂盒包含：
i)第一寡核苷酸引物(正向引物)，其包含5'上游目标特异性或自退火部分、荧光盒特异性部分和3'下游目标特异性部分；和
ii)一种或多种目标特异性寡核苷酸引物；
其中具体集合中的寡核苷酸引物各自适合于与目标多核苷酸的链杂交，以允许在等温多核苷酸扩增反应中形成所述目标多核苷酸的扩增产物；
并且其中相同组中的每个集合中的所述第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，其能够与所述相同组中的任何集合中的所述第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的补体杂交；
b)一种或多种盒寡核苷酸集合，每个集合的特征在于：
i)第一盒寡核苷酸，其用荧光部分(供体部分)标记并且具有能够与给定寡核苷酸引物组中的任何集合中的所述第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的补体杂交的序列；和
ii)第二盒寡核苷酸，其用受体部分(例如淬灭剂部分)标记；
其中每个集合的所述盒寡核苷酸彼此杂交以形成荧光淬灭对。
15.一种适用于检测一种或多种多核苷酸扩增产物的方法中的试剂盒，所述试剂盒包含：
i)第一寡核苷酸引物(正向引物)，其包含荧光盒特异性部分和3'下游目标特异性部分；和
ii)一种或多种目标特异性寡核苷酸引物；
其中具体集合中的寡核苷酸引物各自适合于与目标多核苷酸的链杂交，以允许在等温多核苷酸扩增反应中形成所述目标多核苷酸的扩增产物；
并且其中相同组中的每个集合中的所述第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，其能够与所述相同组中的任何集合中的所述第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的补体杂交；
b)一种或多种盒寡核苷酸集合，每个集合的特征在于：
i)第一盒寡核苷酸，其用荧光部分(供体部分)标记并且具有能够与给定寡核苷酸引物组中的任何集合中的所述第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的补体杂交的序列；和
ii)第二盒寡核苷酸，其用受体部分(例如淬灭剂部分)标记；
其中每个集合中的所述盒寡核苷酸彼此杂交以形成荧光淬灭对；和
c)链置换dna聚合酶。
16.根据权利要求14或15所述的试剂盒，其适用于根据权利要求1到13中任一项所述的方法。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法或试剂盒，其用于等位基因特异性snp基因分型、体细胞突变检测、病原体检测、基因表达研究或拷贝数变异研究。
技术总结一种检测一种或多种多核苷酸扩增产物的方法，在一个实施方案中，所述方法包含以下步骤：a)提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个组包含：i)正向引物，其包含荧光盒特异性部分和3"下游目标特异性部分；和ii)一种或多种目标特异性引物；b)提供一个或多个荧光淬灭对，每对的特征在于：i)第一盒寡核苷酸，其用荧光部分标记并且具有能够与给定寡核苷酸引物组中的正向引物的荧光盒特异性部分的补体杂交的序列；和ii)用淬灭剂部分标记的第二盒寡核苷酸；c)在链置换DNA聚合酶存在下引发等温多核苷酸扩增反应，由此产生相关正向引物的至少一部分的互补序列，使得相关第二盒寡核苷酸不太可能与相关第一盒寡核苷酸杂交，从而产生信号；和d)检测所述信号。
技术研发人员：R·L·霍华德
受保护的技术使用者：LGC基因组学有限公司
技术研发日：2018.08.20
技术公布日：2020.06.05
