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本申请主张2017年9月11日申请的美国临时专利申请第62/557,028号的优先权，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
折射率匹配(rim)配制物、其在将生物样本(例如细胞和组织)封固到衬底的用途，和观测包埋于rim配制物中的生物样本的方法。
背景技术：
生物样本通常封固在光学澄清衬底(例如，玻璃显微镜载片)上以用于通过光学显微检查。典型地，封固过程涉及将生物样本(例如，固定细胞或组织)悬浮于封固溶液(亦称为“封固介质”或“封固剂”)中，且接着将样本沉积到衬底表面上，从而将样本包埋于封固溶液中。封固溶液和所包埋样本在研究之前，典型地在盖玻片下任选地干燥。封固介质保护样本免于物理损坏并且允许样本的长期储存。
封固介质的选择由样品和衬底的类型指定。封固介质可以是液体或可以硬化到永久性封固剂中。另外，封固介质理想地不与样本反应并且不随时间推移结晶或变暗。如果样本用染料染色，那么封固剂也不应使染料褪色或漂白。对于用荧光染料标记的生物样本，通常由封固剂最小化光漂白的能力支配适合封固剂的选择。适合封固剂应有效地减少荧光团的光漂白，同时最小化初始荧光强度的淬灭。通过不可逆光漂白的荧光损失可引起灵敏度的显著降低，尤其当目标分子具有低丰度时或当激发光具有高强度或较长持续时间时。选择适当封固剂的另一因素为其光学澄清度。光学澄清度不仅受封固剂的澄清程度影响，而且受封固剂、样品和玻璃或其它衬底的折射率(ri)匹配的程度影响。对于生物样本，一般选择水性封固介质。然而，市售水性封固介质无法充分匹配样本的折射率。例如细胞和组织典型地具有1.35-1.42的ri。因为这些封固介质的ri低于显微镜载片和盖玻片中使用的玻璃的ri(1.50-1.54)，并且还不匹配生物样本的ri，所以这些封固介质不准许最优光学澄清度。因此，需要具有与研究中的玻璃和/或生物样本的ri更紧密匹配的ri的用于封固生物样本的改进的配制物。
技术实现要素：
提供折射率匹配(rim)溶液，其包含水溶性聚合物，其中聚合物的摩尔折射度(rll)与摩尔体积(vm)的比率为0.27到0.34；和多元醇。在一个方面中，提供一种折射率匹配(rim)溶液，其包含水溶性聚合物，其中聚合物的摩尔折射度(rll)与摩尔体积(vm)的比率为0.27到0.34；和多元醇，其中水溶性聚合物与多元醇的重量比为0.125:1到4:1。在某些实施例中，水溶性聚合物与多元醇的重量比为0.318:1到4:1。rim溶液可以进一步包含水或缓冲剂。rim溶液的折射率(ri)可为1.33或更大(例如，1.333到1.530；或1.330到1.420)。在某些实施例中，rim溶液的ri为1.36或更大。在某些实施例中，rim溶液的ri为1.38或更大。在另外其它实施例中，rim溶液的ri为1.47或更大。典型地，rim溶液的ri为1.60或更小。
在另一方面中，提供一种将生物样本封固在衬底上的方法，其包含将生物样本沉积在衬底上；以及使生物样本与本文所公开的rim溶液接触以提供经封固样品。在本文所述的方法、经封固生物样本或试剂盒中的任一种中，衬底可以是显微镜载片、比色杯、孔、成像室或皿。生物样本的代表性实例包含细胞、组织、3d细胞培养物(例如，球体/类器官)或完整生物体(例如，果蝇、蠕虫、斑马鱼)。任选地，生物样本用荧光染料或荧光蛋白质标记。所述方法可以进一步包含干燥经封固样品，从而水溶性聚合物固化以提供固化聚合物。水溶性聚合物可在约48小时或更短时间；或在室温下24小时或更短时间；或在约40℃的温度下约4小时或更短时间内固化。固化聚合物的ri可超过1.47。在某些实施例中，固化聚合物的ri为1.48到1.54。在特定实施例中，固化聚合物的ri为1.50到1.525。所述方法可以进一步包含用显微镜观测衬底上的生物样本。
在又一方面中，提供一种固化封固剂，其包含水溶性聚合物，其中聚合物的摩尔折射度(rll)与摩尔体积(vm)的比率为0.27到0.34；和多元醇，其中水溶性聚合物与多元醇的重量比为0.125:1到4:1。在固化封固剂中水溶性聚合物与多元醇的重量比可以是0.5:1或更大。固化封固剂的折射率可为1.47或更大。在一些实施例中，固化封固剂的折射率大于1.47。在某些实施例中，提供一种固化封固剂，其包含水溶性聚合物，其中聚合物的摩尔折射度(rll)与摩尔体积(vm)的比率为0.27到0.34；和多元醇，其中水溶性聚合物与多元醇的重量比是0.318:1到4:1；并且其中固化封固剂的折射率为1.48或更大。本文所公开的rim溶液或固化封固剂的ri理想地适合于匹配钠钙玻璃、硼硅玻璃或浸油的折射率(例如1.48-1.50；或1.50到1.52；或1.52到1.54)。
用于所公开的配制物中的水溶性聚合物可以不带电。举例来说，不带电水溶性聚合物可以是聚(丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基乙烯基醚)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚乙烯醇(pva)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)或聚(2-甲基-2-噁唑啉)。在某些实施例中，不带电水溶性聚合物包含n-r丙烯酰胺或n-r甲基丙烯酰胺的单体残基，其中r为甲基、乙基、丙基、异丙基或h；n,n-二甲基丙烯酰胺、n,n-二甲基甲基丙烯酰胺、n,n-二乙基丙烯酰胺、n,n二乙基甲基丙烯酰胺；n-2-羟丙基甲基丙烯酰胺)；或其组合。在某些实施例中，不带电水溶性聚合物为聚(n-甲基甲基丙烯酰胺)(pmmam)。或者，用于所公开的配制物中的水溶性聚合物可以带电。代表性带电水溶性聚合物包含例如，聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚(氯化二烯丙基二甲基铵)、聚(钠-4-苯乙烯磺酸盐)、聚(亚乙基亚胺)、聚(丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯)、聚(n,n-二乙基乙基氨基丙烯酸酯)、聚(烯丙胺)、聚[双(2-氯乙基)醚-共-1,3-双[3-(二甲胺基)丙基]脲]；或聚(乙烯基磺酸钠)。在某些实施例中，水溶性聚合物不是多元醇。水溶性聚合物的重均分子量可为约1kda到约100kda。在某些实施例中，重均分子量为约1kda到约20kda；或约20kda到约100kda；或约48kda到约80kda。水溶性聚合物还可为由本文所述的带电或不带电单体中的两种或更多种形成的共聚物，其中共聚物可为例如无规、梯度、嵌段或接枝共聚物。
本文所公开的封固配制物还可包含多元醇，如聚乙烯醇、甘油、二甘油、聚甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、赤藻糖醇、硫二乙醇、硫二丙醇或其组合。任选地，配制物可进一步包含抗氧化剂(例如约1重量％或更小)，如例如6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸、3-羧基丙氧基、对苯二酚、对甲氧酚、亚硫酸钠、异抗坏血酸钠、抗坏血酸、没食子酸丙酯、咖啡酸、对苯二胺、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷或其组合。
在又一方面中，提供一种经封固生物样本，其包含安置于衬底上的生物样本，其中生物样本包埋于如本文所公开的固化封固剂中。
在又一方面中，提供一种用于将生物样本封固在衬底上的试剂盒，其包含如本文所公开的折射率匹配(rim)溶液；以及用于将生物样本封固在衬底上的说明书。
附图说明
图1为展示样品8和13的随时间推移的折射率改变的曲线图。
图2为展示样品8、10和13的随焦深而变的轴向分辨率的曲线图。
图3为展示样品8、10和13的随焦深而变的横向分辨率的曲线图。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。本文中所提及的所有专利、申请、公布申请和其它公开都以全文引用的方式并入。如果此部分中阐述的定义与以引用的方式并入本文中的专利、申请、公布的申请和其它公开中阐述的定义相反或以其它方式不一致，那么此部分中阐述的定义优先于以引用的方式并入本文中的定义。
如本文所用，“一(a)”或“一(an)”意味着“至少一个”或“一或多个”。
如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则术语“约”在用于描述数值时涵盖所述数值的至多±15％的范围。
虽然组合物和方法是以“包括”各种组分或步骤(解释为意味“包含但不限于”)的形式描述的，但组合物和方法也可“基本上由各种组分和步骤组成”或“由各种组分和步骤组成”，此类术语应该被解释为定义基本上封闭的成员群组。
如本文所用，“折射率”或“ri”为光行进通过特定介质快速程度的量度。光在具有不同ri值的两个介质，如空气和水之间行进时，其行进的路径弯曲，使图像失真。折射率还为辐射的速度和波长相对于真空中的光的波长减小多少的量度。因为ri为两个速度的比率，所以其无量纲。
本文中使用“水溶性”意味着化合物可溶于或可分散于水性基溶液中，如于水或基于水的溶液或缓冲溶液中，包含所属领域的技术人员已知的生物或分子检测系统中使用的那些溶液或缓冲溶液中。如果化合物可以10mg/ml或更高的浓度溶解于水性配制物中，那么将其视为水溶性的。可以100mg/ml或更大的浓度溶解于水性系统中的化合物被视为高度水溶性的。可以1mg/ml或更小的浓度溶解于水性系统中的化合物被视为具有较差的水溶性。
如本文所用，“生物样本”或“生物样品”涵盖血液、细胞和组织样本，例如细胞、3d细胞培养物(例如球体和类器官)、组织、完整生物体(例如蝇、蠕虫、斑马鱼)、无细胞提取物或流体样品(例如血液或痰液)。组织样本可以是任何类型的神经、上皮、肌肉和结缔组织，包含器官组织。生物样品可以来自植物或动物(例如人类、小鼠、蝇、蠕虫、鱼、蛙、真菌等)。
本文中描述了用于将样本封固在衬底上的配制物。所描述的配制物是提供用于保护和储存样本的硬结封固介质的水性基系统。配制物可以直接施用到任选地可以荧光标记的细胞和组织样品，其在衬底上并且可以在干燥时硬化。配制物可以在无盖玻片的情况下硬化，因此消除了盖玻片用于保护经封固样本的要求。本文所公开的封固配制物将样本固持在衬底上的适当位置，由此稳定化和保存衬底上的生物样本以用于后续研究。举例来说，一旦封固，就可在显微镜下使生物样本成像。所公开的配制物具有使这些配制物理想地用作生物样品的封固介质的有利光学特征。确切地说，所公开的配制物展现高折射率。已知样本和封固介质的ri可显著影响图像质量。举例来说，样本与周围封固剂的ri之间的差异可影响样本在显微镜下呈现的方式。如果样本与周围介质的ri之间的差异较大，那么可发生样本和封固介质界面处的强的光折射。随着光折射，ri的较大差异可引起假影，这可使样本的细节模糊。相比之下，样本与封固介质之间的小的ri差异可减少光折射，使得许多类型的样本在显微镜下呈现更亮和/或更透明。
本文提供可匹配生物样品的折射率的配制物，以及显微镜中常用的衬底、透镜、盖玻片和其它组件。因此，本文所描述的配制物的折射率(ri)与显微镜的物镜的玻璃，以及显微镜盖玻片的玻璃或样品的显微成像中常用的其它组件(如浸油)的ri匹配。由于具有高ri，所公开的配制物使由光折射产生的显微镜图像的失真最小化，使得这些配制物适合于在高放大率下和/或与浸油(如典型地用于使显微镜图像的失真最小化)使用。一旦干燥，本发明配制物的ri超过现有的硬封固配制物的ri，同时减少样品和染料(如果存在)的光漂白。举例来说，本文所述的特定配制物可具有1.47或更大的ri，其显著高于所属领域的技术人员已知的标准硬封固配制物。
本文所提供的配制物为光学澄清的(即使一旦干燥)，与生物样本化学相容，并且不会伤害或降解生物样本(甚至在长期储存之后)。所描述的配制物还改进较高放大率和3d重构(z堆叠)图像的清晰性，且可减少球面像差或散射光，进而允许捕获多个深度的更清晰图像。归因于有利的物理和光学特性，可以使用一系列显微镜技术在各种类型的生物样本(例如，组织和细胞)的三维成像中实施本发明的配制物，所述显微镜技术如用于在样本内的深处观测荧光团的那些显微镜技术(例如，共焦荧光显微法)。此外，所公开的配制物与其它市售的硬结封固剂相比，还展现低气泡形成，干燥时的较少收缩，并且在干燥和/或冷冻时不会开裂。封固剂在固化时不褪色或收缩，使得有可能在封固载片数周或甚至数月之后获得高质量图像。本文所公开的配制物还可使细胞成像应用中常用的荧光染料的淬灭最小化。包含例如抗褪色试剂的配制物可抵抗染料淬灭，且尤其可用于使用荧光探针染色的细胞和组织成像。上文所描述的属性的独特组合使得所描述的配制物尤其可用于经染色生物样品的长期储存。
本文所提供的折射率匹配(rim)配制物可包含一或多种水溶性组分(例如水溶性聚合物)。本文所提供的rim配制物可包含多于一种水溶性组分。在某些实施例中，配制物包含至少两种水溶性组分。水溶性组分可含于水性介质中，使得配制物适合与生物样本一起使用。含有生物样本的配制物可直接成像或在成像之前干燥以从配制物中去除水。
本文所提供的rim配制物展现匹配典型地用于成像应用的衬底(例如显微镜载片，如由钠钙玻璃或硼硅玻璃制成的显微镜载片)或浸油的折射率的折射率。本文所描述的配制物的rim特性可改进图像质量，使得所描述的配制物理想地用于成像应用。本文所提供的rim配制物展现相对于所属领域的技术人员已知的标准封固配制物格外高的ri。典型地，所公开的配制物一旦固化，折射率超过1.45。意外地，所公开的配制物可提供ri为1.45或更大的光学澄清封固配制物。在某些实施例中，封固剂的ri为1.45到1.47。在其它实施例中，封固剂具备1.47或更大(例如1.47到1.50；或1.50到1.52；或1.52到1.54)的ri。在某些实施例中，配制物的ri为约1.47到约1.53。在某些实施例中，封固剂的ri为约1.50到约1.52。
对于展现约1.50到1.52的ri范围的生物样品(如组织)，可能需要利用可以提供具有相同ri范围的固化封固剂的配制物。因此，用于所公开的rim组合物的适合的水溶性组分一旦干燥，典型地具有1.45或更大，例如1.45到1.60的ri。在一些实施例中，ri为1.45到1.50。在其它实施例中，ri为1.50到1.53。在其它实施例中，ri为1.53到1.55。在另外其它实施例中，水溶性组分的ri为1.55到1.60。典型地，用于制备封固剂的溶液的ri略低于固化封固剂的ri。因此，本文还提供rim溶液，其中rim溶液的折射率为1.33或更大(例如，1.333到1.530；或1.330到1.420)。
一或多种水溶性组分可以是水溶性聚合物。在某些实施例中，配制物可进一步包含多元醇。许多类型的聚合物的ri值可在文献中找到。在ri数据不可用的情况下，可以测量或可以使用方程1基于洛仑兹-洛仑慈理论(lorenz-lorentztheory)计算特定聚合物的ri，其中n为折射率；并且rll和vm分别为聚合物重复单元的摩尔折射度和摩尔体积。由方程1计算的ri是波长依赖性的，并且典型地在589nm的波长(钠d-线)下报告。
rll/vm＝(n2-1)/(n2 2)(方程1)
许多类型的聚合物的rll和vm值可在文献中找到或使用所属领域的技术人员已知的方法从基团贡献效应估计。适用于如本文所述rim配制物的水溶性聚合物的rll/vm比典型地在约0.27到约0.34范围内。在某些实施例中，本文提供一种包含水溶性聚合物的折射率匹配(rim)配制物，其中聚合物的摩尔折射度(rll)与摩尔体积(vm)的比率为0.27到0.34，使得rim溶液的折射率为1.45到1.60。在某些实施例中，包含rll/vm比在0.284到0.314范围内的水溶性聚合物的配制物提供折射率为约1.48到约1.54的rim配制物。
用于所公开的rim配制物中的水溶性聚合物和共聚物可以是中性或带电的。举例来说，水溶性聚合物可以是中性(即，不带电)聚合物，使得其与存在于样品中的染料和/或细胞蛋白质具有最小相互作用。示范性中性水溶性聚合物包含聚(丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基乙烯基醚)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚乙烯醇(pva)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)和聚(2-甲基-2-噁唑啉)。示范性基于丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺的聚合物可包含以下单体单元的残基：如例如n-r丙烯酰胺或n-r甲基丙烯酰胺，其中r为甲基、乙基、丙基、异丙基或h；n,n-二甲基丙烯酰胺、n,n-二甲基甲基丙烯酰胺、n,n-二乙基丙烯酰胺、n,n二乙基甲基丙烯酰胺；n-2-羟丙基甲基丙烯酰胺)；或这些单体单元的组合。在某些实施例中，不带电水溶性聚合物为聚(n-甲基甲基丙烯酰胺)(pmmam)。包含中性聚合物(如例如，pmmam)的配制物不会发泡或形成长期气泡，如在现有商业硬封固配制物的情况下通常发生的，并且因此可在气泡形成的风险极小的情况下用移液管移取到样品上。含有中性聚合物的配制物可在小于24小时内固化，使得此类聚合物尤其可用于制备如本文所公开的rim溶液。举例来说，包含pmmam的配制物可在约3小时内固化以提供具有1.52的ri的固化封固剂。
或者，水溶性聚合物可以是带电聚合物(例如聚电解质)。与具有相等mw的中性聚合物相比，带电聚合物可在水中的溶解性更高，并且粘度更高。因此，带电聚合物当用于需要此类特性的封固配制物时可具有某些优点。带电聚合物可携带正或负的总体电荷。示范性带电水溶性聚合物包含聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚(氯化二烯丙基二甲基铵)、聚(钠-4-苯乙烯磺酸盐)、聚(亚乙基亚胺)、聚(丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯)、聚(n,n-二乙基乙基氨基丙烯酸酯)、聚(烯丙胺)、聚[双(2-氯乙基)醚-共-1,3-双[3-(二甲胺基)丙基]脲]或聚(乙烯基磺酸钠)。
水溶性聚合物的分子量可以基于封固剂的所要特性和其预期用途来选择。举例来说，聚合物的分子量影响配制物的粘度。一般来说，选择分子量以实现可易于处置且又足够粘稠以使得其保持在衬底上的适当位置的配制物。用于所公开的配制物中的聚合物典型地包含一系列分子量。分子量(mw)范围的下部末端可基于聚合物在配制物中的所要溶解性来选择，且mw范围的上部末端可基于其在干燥时形成硬化表面的能力来选择。举例来说，如果mw过低，那么配制物在干燥时可能不形成刚性膜。一般来说，水溶性聚合物的重均分子量可为约1kda到约100kda，例如1kda到15kda；或15kda到20kda；或20kda到40kda；或40kda到80kda；或80kda到100kda。在某些实施例中，水溶性聚合物的重均分子量为约48kda到约80kda。包含较高分子量聚合物(例如大于约15kda)的配制物可在维持生物样本的完整性的温和条件下容易地固化。在一些实施例中，rim配制物可实施较低分子量水溶性聚合物(例如小于20kda)以提供更软、更有粘性的封固剂。取决于应用和用于封固某些类型的样品，较软的封固剂可提供某些优点。举例来说，当需要最小化延长的干燥时间时，或当期望从配制物回收样品时，较软封固剂可以与具有>200微米厚度的样本一起使用。
rim配制物可进一步包含一或多种多元醇。“多元醇”是指包含两个或更多个羟基的化合物。在某些实施例中，多元醇具有100个或更多个羟基。在其它实施例中，多元醇具有1000个或更多个羟基。在某些实施例中，多元醇具有2500个或更少个羟基。配制物中可以包含多元醇以帮助塑化rim聚合物，使得当封固膜干燥时，其不会变得太脆或开始开裂。未蒸发的多元醇还可向膜提供一些永久体积，由此防止膜变得太薄。理想地，干燥的膜维持类似于未干燥的膜的体积。这可防止样本由于干燥材料的收缩而变形。维持干燥膜的结构对于在各种温度(例如，室温、4℃和-20℃)下的样品存档和储存也是重要的。多元醇还应具有与所封固系统中的生物样本和/或衬底或其它组件的ri接近的ri(例如1.46到1.60)。在一些实施例中，ri为1.47到1.54。示范性多元醇包含甘油、二甘油、聚甘油、聚乙烯醇、糖(如甘露糖醇、山梨糖醇、赤藻糖醇)、硫二乙醇、硫二丙醇等。典型地，多元醇不同于水溶性聚合物。然而，预期在某些配制物中，聚合物和多元醇具有相同组成。聚合物和多元醇的分子量可相同或不同。在代表性实施例中，例如pva可用作多元醇和水溶性聚合物两者，但pva的两种形式的分子量不同。
本文所提供的rim配制物可包含水溶性聚合物与多元醇的组合。在配制物中水溶性聚合物与多元醇的比率可变化且可影响经干燥的硬封固剂的折射率。典型地，打算用于制备硬封固剂的配制物包含0.125或更大的水溶性聚合物与多元醇的重量比。在某些实施例中，水溶性聚合物与多元醇的重量比在0.125:1到4:1范围内。在某些实施例中，水溶性聚合物与多元醇的重量比是或0.125:1到1:1；1:1到2:1；2:1到3:1；或3:1到4:1。在某些配制物中，水溶性聚合物与多元醇的重量比是1:1到3:1。在某些配制物中，水溶性聚合物与多元醇的重量比是约0.5:1。
rim配制物可以进一步包含水性组分(例如，水或缓冲剂)，并且一或多种水溶性聚合物和一或多种多元醇溶解于水性组分中。水性组分用以溶解和/或水合封固配制物的生物样本和组分。所属领域的技术人员已知的任何生物相容缓冲剂可用于本文所述的配制物，如例如tris、pbs、硼酸盐等。维持配制物的ph值高于7.4的缓冲剂尤其适用于某些配制物，例如当存在荧光染料时。
所描述的配制物可改进样品透明度而不需要额外的澄清剂(clearingagent)。然而，澄清剂任选地可用于使组织样品成像，到进一步改进图像质量。因此，在某些实施例中，本文所公开的rim配制物可与澄清剂结合使用。对于包含荧光材料的样品，鉴于水性澄清剂与许多荧光团和荧光蛋白，以及本发明之rim配制物的相容性，可优选实施水性澄清剂。示范性澄清剂包含例如基于有机溶剂的和基于水性清洁剂的试剂、甘油或硫代甘油溶液、单和多醣(例如果糖和蔗糖)、脲溶液和市售试剂。
本文所提供的rim配制物抵抗沉淀物的形成，与已知在样品上在少到2-3天的过程中形成沉淀物的常用的封固剂相反。本文所描述的rim配制物还防止样品和/或荧光标记材料(如果存在)光漂白。适用于封固和使用荧光染料染色的生物样本成像的配制物任选地可进一步包含抗褪色试剂，以最小化在储存或研究时染色样品的降解或光漂白。因此，在某些实施例中，本文所提供的rim配制物任选地包含一或多种抗褪色试剂，并且可以约1重量％或更少包含于rim配制物中。抗褪色试剂为所属领域的技术人员熟知的，且包含抗氧化剂，如例如6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸、3-羧基丙氧基、对苯二酚、对甲氧酚、亚硫酸钠、异抗坏血酸钠、抗坏血酸、没食子酸丙酯、咖啡酸、对苯二胺、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷]、其它氮氧化物或其组合。
rim配制物可进一步包含额外组分，如例如防腐剂，以防止在长期储存期间聚合物和/或多元醇降解和/或防止或最小化细菌生长。适合防腐剂包含不吸收大量可见光或降低配制物的ri的那些防腐剂。代表性防腐剂包含例如苯甲酸钠、苯甲酸或叠氮化钠，并且典型地以小于2重量％的浓度存在于配制物中。额外组分(如染料)也可包含于本文所提供的rim配制物中。在某些实施例中，rim配制物可包含用于染色细胞的荧光染料。在某些实施例中，染料可以染色细胞的细胞核，例如hoechst33342或dapi。
本文还提供封固在rim封固介质中的衬底上的样品。举例来说，如本文所述，生物样本可以封固在衬底上并且包埋于rim配制物中。衬底可以是具有适合于支撑或含有rim溶液的表面的任何材料。举例来说，衬底可具有光滑或粗糙的表面，且可为平坦的或含有空腔或凹陷(例如，用于含有配制物的孔)。在某些实施例中，衬底具有相对光滑并且无孔的表面，使得rim溶液不会被吸收到衬底中。衬底取决于最终用途可以是光学透明或非透明的，并且可以由多种材料制成。对于显微法应用，例如，衬底可以是光学透明的。衬底可以由任何适当的材料，包含例如玻璃或聚合物制成。代表性衬底包含但不限于光学和成像应用中常用的那些衬底，如例如显微镜载片、比色杯、孔、盖玻片或皿。在某些实施例中，经封固样品可包含透明衬底(例如显微镜载片)、生物样本(例如组织)和包围样品且将其粘附到衬底的固化rim配制物。任选地，盖玻片可以安置在固化经封固样品上。所封固的载片上的固化配制物的量足以包围生物样本且将其粘附到衬底和/或盖玻片。
如本文所公开，经封固生物样品当在室温或更低温度下储存时可稳定持续许多月(例如，5个月或更长)，而不会使样品或荧光染色(如果存在)降解或褪色。
样品可以是任何生物材料，包含但不限于组织、细胞、血液等。生物样品可在封固于衬底上之前用一或多种荧光染料或荧光蛋白质染色。适合于生物样品染色的荧光蛋白质在所属领域中为熟知的，并且包含例如但不限于gfp、rfp、mcherry等。用于生物样本的常用荧光染料包含例如二吡咯亚甲基硼(4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-二环戊二烯并苯)、花青、呫吨、磺化芘、罗丹明(rhodamine)、香豆素(coumarin)和其衍生物。示范性有机染料包含bodipy染料、香豆素(例如，pacific蓝、pacific绿和pacific橙(可购自thermofisherscientific；马萨诸塞州沃尔瑟姆(waltham,ma)))、罗丹明、对甲氨基酚(rhodol)、荧光素(fluorescein)、硫荧光素、氨基荧光素、羧基荧光素、氯荧光素、甲基荧光素、磺基荧光素、氨基对甲氨基酚、羧基对甲氨基酚、氯对甲氨基酚、甲基对甲氨基酚、磺基对甲氨基酚；氨基罗丹明、羧基罗丹明、氯罗丹明、甲基罗丹明、磺基罗丹明、硅罗丹明和硫罗丹明、花青、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫杂羰花青、部花青、花青(例如花青2、花青3、花青3.5、花青5、花青5.5、花青7)、噁二唑衍生物、吡啶噁唑、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑、芘衍生物、级联蓝、噁嗪衍生物、尼罗红(nilered)、尼罗蓝、甲苯基紫、噁嗪170、吖啶衍生物、原黄素、吖啶橙、吖啶黄、芳基次甲基衍生物、呫吨染料、磺化呫吨染料、磺化芘、金胺、结晶紫、孔雀绿、四吡咯衍生物、卟啉、酞菁、胆红素和双苯甲酰亚胺(hoechst染色剂)。在某些实施例中，有机染料为近红外染料，如例如cy5.5(gehealthcarelifesciences；宾夕法尼亚州匹兹堡(pittsburgh,pa))、irdye800(li-cor；内布拉斯加州林肯(lincoln,ne))、dylight750(thermofisherscientific)或靛氰绿(icg)，或花青染料，如例如花青2，花青3，花青3.5，花青5，花青5.5，花青7。在某些实施例中，有机染料为呫吨或磺化呫吨染料，如以以下商标名市售的那些染料：alexafluor594，alexafluor633，alexafluor647和alexafluor700(thermofisherscientific)。适合的市售染料的额外实例包含alexafluor405，alexafluor488和alexafluorplus二级抗体(thermofisherscientific)。
经封固样品可直接研究，或可使用本文所描述的方法固化以提供包埋在固化封固剂中的生物样本。有利地，经封固和固化样品的折射率匹配衬底(例如显微镜载片)和盖玻片的ri，并且通常超过1.47并且典型地在1.48到1.54范围内。举例来说，含有样本的固化封固剂可具有1.48到1.54(例如1.48到1.50；或1.50到1.52；或1.52到1.54)范围内的折射率。
本文进一步提供将生物样本封固在衬底上的方法。代表性方法包含将生物样本沉积在衬底上，且接着使生物样本与rim溶液接触以提供经封固样品。一旦封固，就可直接研究(例如，使用显微镜成像)样品。然而，样品典型地被覆盖(例如，用盖玻片)以用于在使用和后续储存期间的保护。接着可使含有生物样本的配制物成像或随后干燥。样品干燥(在本文中也称为“固化”)从rim配制物去除水，从而引起封固剂的硬化。对于包含水溶性聚合物的配制物，去除水提供在本文中称为“硬封固剂”或“硬封固”配制物的固化配制物。应了解，硬化封固剂仍可维持某一水平的粘度和/或弹性，使得其不会变得太脆或开裂。
取决于配制物的类型和所要固化水平，经封固样品可经历一系列不同固化方案。固化特定配制物所需的温度和时间取决于各种因素，包含例如配制物中的水溶性组分的类型、分子量和浓度，以及所要固化程度。另外，用于固化的条件取决于样品是否覆盖有盖玻片或对空气敞开。
干燥可以在环境(例如，室温)温度下或在高温下进行。在某些实施例中，固化在低于约40℃的温度下进行以防止对生物样本的损坏和/或对配制物中的水溶性组分的降解。在含有水溶性聚合物的配制物中，聚合物可在24小时或更短时间；或在一些情况下10小时或更短时间；或甚至4小时或更短时间内固化。如本文所公开，在包含分子量为20kda或更大的水溶性聚合物的某些配制物中，可在不存在盖玻片的情况下在4小时或更短时间内在低于约40℃的温度下实现干燥。
本文所提供的封固配制物可用于各种组织化学、免疫化学和细胞化学应用，包含但不限于将血液、组织和细胞样品封固在显微镜载片上，包含组织和血液。所描述的rim配制物可用于提供封固在衬底上的样本，如血液、细胞、组织或其它生物流体或材料的样品，包含但不限于已经染色以辅助针对研究和/或诊断目的的显微检查的材料。可使用所属领域中熟知的成像技术来观测根据本文所公开的方法制备的经封固生物样本。可以例如使用光学显微镜进行成像。本文所描述的封固配制物的高ri和光学澄清度允许将生物样品成像为与使用标准封固剂时相比，更大的深度(例如，100μm或更小；例如1-100μm)和更高的分辨率。举例来说，荧光标记的目标在小至100μm为可检测的，且分辨率维持为类似深度。
可以使用标准icc/ihc方案制备样品。在封固之前醇(例如甲醇和乙醇)中的额外脱水可减少干燥时间。在样品封固之后在干燥剂存在下干燥也可加快干燥时间。样品可涂布有封固剂以覆盖其并在无盖玻片的情况下干燥。经封固样品然后可以在无盖玻片的情况下直接成像，或用小体积的甘油覆盖，并且在成像之前覆盖。可以使用本文所公开的方法评价任何适合的生物样品，包含但不限于基于溶液或悬浮液的样品和组织样品。在某些实施例中，样品包含细胞或消化的细胞和其片段。细胞可以是死的(例如，固定的)或活的。可以用本文所公开的rim配制物处理的生物材料的额外实例包含3d细胞培养物(球体/类器官)或完整生物体(例如果蝇、蠕虫、斑马鱼)。
本文所描述的rim配制物可用于鉴别不同材料的特征，所述材料包含但不限于植物、微生物、动物、泥土、血液和血浆样品，以及其它类型的非活有机和无机材料，包含但不限于土壤粒子和地质样品，而不损失物镜结构的澄清度、清晰度或分辨率。
为了鉴别细胞中的不同组分，可以使用染色以提供在特定结构之间基于其化学组成的对比。本文所公开的rim溶液不干扰典型地用于染色细胞的荧光染料。因此，在某些实施例中，生物样本可以用荧光染料标记，所述荧光染料包含但不限于本文所公开的那些荧光染料。举例来说，样品可以包含表达可以由特异性亲和分子(例如抗体)识别并且结合到所述特异性亲和分子的表面抗原(例如细胞表面受体)的细胞。细胞可以用包含在用于将细胞表面上的抗原结合到亲和分子的条件下，与亲和分子(例如抗原)连接的荧光团的结合物处理，以形成用结合物标记的细胞。或者，荧光团可含于细胞内，例如细胞质中或细胞器或细胞膜内。此外，本文所提供的rim配制物可用于染色细胞和组织的成像，且尤其可用于荧光免疫组织化学(ihc)应用。
制备样本的通用方法涉及将可任选地染色的样本浸泡于足够量的封固溶液中以将样本完全浸没于溶液内。然后将样本施加到衬底(例如显微镜载片、比色杯或孔)。任选地，经封固样本可干燥(例如，在室温到至多约40℃下)直到硬化。可以在使样品硬化之前或之后在样本上施加盖玻片。可无限地储存固化的经封固样品。或者，可以例如在显微镜下观测来研究经封固样品。封固配制物与荧光显微镜和物镜相容，例如epi-荧光、宽视场、共焦、受激发射耗尽(sted)和结构化照明显微镜(sim)。由于rim配制物的优良光学特性，样本呈现为透明的，允许观测细胞和较深组织层而不损失清晰性。
所描述的rim配制物还理想地适合于将组织样品封固在衬底上。迄今为止，完整组织封固和成像具有挑战性，这是因为样品厚度、细胞外材料的存在和试剂穿透可产生背景荧光和不良图像分辨率和减小的成像深度。所描述的配制物可减少光的折射，因为其穿过盖玻片和组织样品，从而允许较高分辨率和成像为较大深度的能力。因为所公开的配制物改进样品透明度，所以其对于与组织样品一起使用是尤其有利的。
提供一种代表性方法，其用于使用如本文所描述的rim配制物将组织样品封固在显微镜载片上。组织可以是可以固定或不固定的切片或完整样品。一般来说，将组织样品沉积到显微镜载片的表面上，并且将如本文所公开的rim配制物施加到样品。接着干燥经封固样品以去除过量水，使得配制物固化。方法中使用的封固介质的量可变化，但一般经选择以湿润组织的表面。必要时，可以使用已知方法去除过量的封固介质。一旦封固到载片表面上，就可在施加或不施加热量的情况下(例如，在室温或在高温下)干燥经封固样品。干燥可以通过使用真空泵和/或干燥剂来加速。一旦干燥，组织就牢固地粘附在载片上，且样品将包埋在封固剂内。如果需要，可添加额外量的配制物，且可重复干燥过程。
本文进一步提供用于将生物样品封固到衬底以用于后续样品成像和/或储存的试剂盒。因此，在又一方面中，提供一种用于将生物样本封固在衬底上的试剂盒，其包含如本文所公开的折射率匹配(rim)溶液；以及用于将生物样本封固在衬底上的说明书。额外组分任选地可包含于试剂盒中，包含例如共封固剂，如甘油。
包含以下实例以展现本发明的某些实施例。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，因此可认为是构成用于其实践的优选模式。然而，根据本公开，所属领域的技术人员应了解，在不脱离本发明的范围的情况下，可对所公开的特定实施例作出许多改变，且仍获得相同或类似结果。
实例
除非另外指示，否则本文中所提供的实例利用以下通用方法。用配备有操作波长为钠d线(589.3nm)的灯的abbe-3l折射计(thermofisherscientific)测量在干燥之前和之后的所有封固剂配制物的折射率。聚(n-甲基甲基丙烯酰胺)(pmmam)的分子量报告为重均分子量(mw)，其如通过以下测量：使用5mmlibr甲醇/二甲基甲酰胺(50/50v/v％)作为洗脱剂的标准凝胶渗透色谱(gpc)方法、
实例1
测量封固剂样品的折射率
对干燥样品的折射率测量通过将300μl样品小心地扩展到折射计棱镜上，并且接着使封固剂干燥至多24小时来测量。一旦将封固剂溶液干燥为透明膜，就测量折射率。
实例2
封固程序
生物样本(例如，培养的单层细胞和厚度小于30μm的组织切片)通过向安置于衬底上的样本施加足够量的封固剂(典型地1-3滴(30到100μl)，直到完全覆盖或浸没，而封固到衬底上。生物样本可以是未染色的或可以在封固之前使用所属领域的技术人员熟知的程序染色。然后用18mm×18mm盖玻片覆盖样本，并且从盖玻片的边缘擦除或吸掉任何过量的封固剂。使经封固样本在室温下干燥24-96小时，但高达40℃的温度也是可接受的。在经封固样本完全干燥之后，可使用所属领域的技术人员熟知的荧光显微法技术使样本成像。或者，可以在施加盖玻片之前干燥经封固样本。无盖玻片的干燥可以加快硬结封固剂的干燥。在无盖玻片的情况下，干燥可花费在40℃下约30分钟到在室温下约4小时。在封固剂干燥之后，可以通过将如水、较多封固剂、乙醇或甘油的接触液体放在干燥封固剂上，并且接着将盖玻片放在样本上而将盖玻片施加在经封固样本上。
以下方案可以用于封固30-100μm和更厚的生物样本。在封固盖玻片之前使封固剂升温到室温2小时。通过在实验室擦拭物上温和地轻触盖玻片或载片的边缘，从样品去除过量的液体。对于载片封固的样本，将2-3滴或60-100μl的封固剂直接施加到样本，接着将盖玻片小心地降低到封固剂上以避免捕获任何气泡。对于在孔盘或培养皿中染色的样本，将样品小心地移动到显微镜载片。将10μl的封固剂添加到载片可辅助将样品操纵到适当的位置。对于3d培养的细胞或球体，使用去除尖端末端的1ml移液管将3d培养物或球体移动到显微镜载片。将具有缓冲剂的3d培养物置放在用适当间隔物制备以确保样品的完整性的显微镜载片上。间隔物应允许样品具有足够的空间，同时使所需封固剂的体积最小化。允许开放边缘的间隔物减小样品的固化时间。如果需要，温和地轻触盖玻片以去除气泡。如果封固剂并未填满盖玻片的边缘，那么使用移液管在盖玻片下施加额外封固剂。温和地轻触以从样品周围去除气泡。未能充分覆盖样品可引起封固剂收缩且减小成像区域。将经封固样品放在平坦的干燥表面上，并且允许其在室温下在暗处固化。对于最优结果，使样品固化至少48小时。
30-100μm和更厚的样本可以使用以下方案更快速地固化。在封固盖玻片之前使封固剂升温到室温2小时。通过在实验室擦拭物上温和地轻触盖玻片或载片的边缘，从样品去除过量的液体。对于载片封固的样本，将2-3滴或60-100μl的封固剂直接施加到样本。小心地将载片来回倾斜以使封固剂在样本上均匀地分布。旨在在18mm×18mm的面积上扩展2-3滴或60-100μl封固剂。移液管尖端的边缘可用于温和地辅助去除任何气泡且扩展封固剂。对于在孔盘或培养皿中染色的样本，将样品小心地移动到显微镜载片。将10μl的封固剂添加到载片可辅助将样品操纵到适当的位置。对于3d培养的细胞或球体，使用去除尖端末端的1ml移液管将3d培养物或球体移动到显微镜载片。将具有缓冲剂的3d培养物置放在用适当间隔物制备以确保样品的完整性的显微镜载片上。间隔物应允许样品具有足够的空间，同时使所需封固剂的体积最小化。从培养物中去除过量缓冲剂，接着取决于间隔物高度和表面积，将2-3滴或60-100μl封固剂直接施加到样本。在此时不施加盖玻片。使样品在室温下在无盖玻片的情况下避光固化16-24小时。在16-24小时之后，跨越固化封固剂和样本的顶部施加10μl甘油。施加盖玻片并且按压到适当的位置，轻触以去除气泡(如果存在)。使盖玻片固化到适当的位置，持续1-3小时或直到盖玻片不再移动为止。
实例3
用聚乙烯吡咯啶酮(pvp)配制封固介质
通过以下配制封固介质：将0.50g甘油(fisherscientific，新泽西州费尔劳恩(fairlawn,nj))、1.00gpvp(mw＝55,000g/mol；tci美国，俄勒冈州波特兰(portland,or))、61mg2-氨基-2-(羟基甲基)-1,3,丙二醇(tris碱；sigma-aldrich，密苏里州圣路易斯(st.louis,mo))和3.8ml去离子水添加到配备有磁性搅拌棒的20ml闪烁瓶中。在水浴中在60℃下在500rpm下搅拌溶液并且加热直到观察到pvp完全溶解为止。聚合物溶解后，在使用前将瓶冷却至室温。ri如实例1中所述测量(参见表1，样品2)。
实例4
用聚乙烯醇(pva)配制封固介质
通过以下配制封固介质：将0.50g甘油、61mgtris碱、1.00gpva(mw约23,000g/mol；sekisui美国公司，美国新泽西州斯考克斯(secaucus,nj,usa))和3.8ml去离子水添加到配备有磁性搅拌棒的20ml闪烁瓶中。如实例3中所描述搅拌并且加热溶液直到观察到pva完全溶解为止。聚合物溶解后，在使用前将瓶冷却至室温。ri如实例1中所述测量(参见表1，样品8)。
实例5
用聚(n-甲基甲基丙烯酰胺)(pmmam)配制封固介质
通过以下配制封固介质：将0.50g甘油、61mgtris碱、1.00gpmmam(mw＝100,000g/mol)和3.8ml去离子水添加到配备有磁性搅拌棒的20ml闪烁瓶中。如实例3中所描述搅拌并且加热溶液直到观察到pmmam完全溶解为止。聚合物溶解后，在使用前将瓶冷却至室温。ri如实例1中所述测量(参见表1，样品14)。
实例6
具有变化的聚合物/甘油重量比的封固介质的配制
使用pvp、pva和pmmam作为水溶性聚合物配制封固介质，如实例3-5中所描述。此外，聚合物与甘油的重量比在0.5到2.0范围内变化。将封固剂的最终体积用去离子水稀释到5ml的恒定体积。如实例3中所描述搅拌并且加热溶液直到观察到聚合物完全溶解为止。聚合物溶解后，在使用前将瓶冷却至室温。如实例1中所描述测量ri(参见表1，对于pvp的样品1、2、3和样品4；对于pva的样品7、8和10；以及对于pmmam的样品14、15、17、18和20)。参考表1中的样品1、2、3、4、7、8、10、14、15、17、18和20的数据，随着聚合物与甘油的比率增加，干燥封固介质的ri显著增加，这是受到预期的，因为文献中报告的所测试聚合物的ri(即，1.530pvp；1.50pva；和1.540pmmam)超过纯甘油的ri(1.4722，在25℃下)。然而，发现一旦聚合物浓度超出某一阈值，干燥封固剂的物理和光学特性显著劣化，并且取决于聚合物，甚至可产生变得不可用于显微法应用的膜(参见例如样品23)。然而，配制物中的过多多元醇可产生油腻或油性的干燥材料，并且盖玻片将不会很好地粘附于样品。对于某些聚合物，此阈值为约0.125:1或更大(例如pvp和pva)，且仅需要微量的聚合物以产生可使用的高rim膜。然而，对于其它聚合物，配制物中的太多聚合物可引起较差膜质量且具有其它缺点。对于实施pmmam的配制物，例如一些多元醇在配制物中的存在有助于使聚合物塑化，使得其不会变得太脆或开裂，尤其当储存于较低温度下时。因此，对于基于pmmam的配制物，水溶性聚合物与多元醇的重量比是约4:1或更小(例如，0.125:1到4:1)。不管聚合物类型如何，多元醇还可将一定水平的永久体积赋予干燥封固剂，且可阻止生物样品(例如，细胞)压缩太多。举例来说，即使不含多元醇的pva膜在干燥时典型地不开裂，但膜收缩过多，使得细胞压缩。
实例7
具有变化的聚合物/二甘油重量比的封固介质的配制
如实例6中所描述来配制封固介质，不同之处在于使用二甘油(alfaaesar，马萨诸塞州图克斯伯里(tewksbury,ma))代替甘油作为多元醇。聚合物与二甘油的重量比在0.5到2.0范围内变化。将封固剂的最终体积用去离子水稀释到5ml的恒定体积。如实例3中所描述搅拌并且加热溶液直到观察到聚合物完全溶解为止。聚合物溶解后，在使用前将瓶冷却至室温。根据实例1中所描述的程序测量ri(参见表1，对于pvp的样品5和6；对于pva的样品9、11和12；以及对于pmmmam的样品13、16和19)。参考表1，干燥封固介质的ri随着聚合物与二甘油的比率增加而增加，因为所测试的聚合物的ri超出纯二甘油的ri(在20℃下1.4850)。另外，用二甘油制备的封固介质的ri略高于使用甘油制备时的ri。
实例8
具有变化的聚合物分子量的封固介质的配制
如实例3-5中所述配制封固介质，不同之处在于聚合物的重量如下变化：pvp(10,000g/mol到55,000g/mol)；pva(13,000g/mol到31,000g/mol)；和pmmam(33,000g/mol到100,000g/mol)。聚合物与多元醇的重量比在0.5到2.0范围内变化。将封固剂的最终体积用去离子水稀释到5ml的恒定体积。如实例3中所描述搅拌并且加热溶液直到观察到聚合物完全溶解为止。聚合物溶解后，在使用前将瓶冷却至室温。根据实例1中所描述的程序测量ri(参见表1，对于pvp的样品1-6；对于pva的样品7-12；以及对于pmmmam的样品13-20)。有趣的是，当多元醇类型和聚合物与多元醇的比率保持恒定时，聚合物的分子量对ri没有统计学上显著的影响。
实例9
仅用聚合物配制封固介质
如实例3-5中所描述来配制封固介质，不同之处在于从配制物中省略甘油或二甘油添加剂。将封固剂的最终体积用去离子水稀释到5ml的体积。如实例3中所描述搅拌并且加热溶液直到观察到聚合物完全溶解为止。聚合物溶解后，在使用前将瓶冷却至室温。根据实例1中所描述的程序测量ri(参见表1，样品21-23)。由于干燥封固剂的开裂，样品23的ri不可测量(nm)。不含甘油或二甘油的样品的数据表明，配制物中多元醇的存在可以防止膜变得太脆或收缩太多，这可能是因为多元醇塑化或软化干燥聚合物膜。
表1在室温下干燥24小时后，各种封固剂配制物的折射率
实例10
用聚合物和抗褪色试剂配制封固介质
通过以下配制封固介质：将0.55g二甘油、1.10gpmmam(mw＝60,000g/mol)、122mg2-氨基-2-(羟基甲基)-1,3,丙二醇(tris碱)和5.0ml去离子水添加到配备有磁性搅拌棒的20ml闪烁瓶中。如实例3中所描述搅拌并且加热溶液直到观察到pmmam完全溶解为止。在聚合物完全溶解之后，分别添加9.7mg苯甲酸(7.94mmol)和19mg亚硫酸钠(15mmol)作为防腐剂和抗褪色试剂。在60℃下再搅拌溶液30分钟直到所有苯甲酸溶解为止。一旦溶解，将瓶冷却到室温，并且用去离子水将体积稀释到10ml。根据实例1中所描述的程序测量ri(在24小时之后，在21℃下，ri＝1.5146)。此配制物的ri值最类似于表1中所呈现的样品18或样品13。实例8指示mw不在统计学上影响ri值，并且二甘油的使用对比甘油稍微增加ri值。与样品13和样品18相比，当前样品的ri值1.5146表明添加抗褪色和防腐试剂对最终ri值具有可忽略的作用(如果存在)。
实例11
随着时间推移的折射率测量
在5天时段内监测折射率以追踪ri随时间而变的变化。如实例1中所述评价各种封固配制物，且在5天时段内在各种时间点重复测量。折射率在前5小时内显著增加，且接着在24小时之后稳定且保持类似(对于样品8和13参见图1)。
实例12
针对使用共焦显微法的轴向分辨率测量的封固亚微米荧光微球体
使用亚分辨率荧光微球体的点扩散函数，用共焦显微镜检测本文所公开的封固配制物的各种焦深的轴向分辨率。将来自ps-specktm显微镜点源试剂盒(thermofisherscientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)的1.7μl175nm绿色荧光微球体(505/515激发/发射)分散于200μl封固剂样品中，且接着超声处理20分钟。在超声处理之后，将100μl的每个样品用移液管移取到经乙醇清洁的18mm乘18mm盖玻片上，并且通过用镊子来回倾斜盖玻片而在整个区域上扩展。封固介质样品在盖玻片上在40℃下干燥1小时。一旦干燥，通过将10μl甘油放在载片上，将盖玻片固定到标准显微镜载片上，并且接着将每个盖玻片温和地放在甘油小液滴上。使盖玻片在室温下在载片上固定约20分钟。
通过共焦显微法测定每一样品的轴向和横向分辨率。使用平面-复消色差透镜63×/1.4na油目标在zeisstmlsm710共焦显微镜上收集个别微球体的z堆叠，以42nm(x，y维度)和100nm(z维度)的比率取样。在对每个样品成像之前，首先用ri为1.518(用e线(546nm)在23℃下测量)的carlzeissimmersoltm518f浸油(carlzeiss公司，纽约索恩伍德(thornwood,ny))覆盖目标。对于每一样品，使所包埋微球体在盖玻片下到100μm范围内的焦深下成像。在跨越经封固样品的整个区域的不同位置(即，左、中和右)，对于每个样品在每个焦深下对三个微球体成像。使用imagejmetroloj插件计算每一样品的轴向(z)和横向(x，y)分辨率。所标绘的数据(图2和图3)展示样品8、10和13的随焦深而变的轴向和橫向分辨率。如图2中所见，轴向分辨率改进(即，较低的值)，ri越接近浸油的ri。改进的轴向分辨率遵循样品13(1.5172)>样品8(1.4927)>样品10(1.4687)，其中在100μm焦深下样品13相比于样品10具有1.54倍改进的轴向分辨率。正如所预期，在每一焦深下每一样品之间存在极少到不存在横向分辨率差异(图3)。在此实例中展现，通过操控聚合物类型和聚合物/多元醇比率以匹配浸油的ri，调节ri以实现最大轴向分辨率，同时维持干燥封固介质的完整性。
本说明书中提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。必要时可以修改实施例的方面以采用各种专利、申请以及公开的概念来提供又另外的实施例。
可根据上文详细描述对实施例作出这些和其它改变。一般来说，在以下条款和权利要求书中，所使用的术语不应解释为将条款和权利要求限制于说明书和权利要求书中所公开的特定实施例，但应解释为包含所有可能的实施例以及此类条款和权利要求所授权的等效物的完整范围。因此，条款和权利要求不受本发明的限制。实施例可根据以下编号的条款：
1.一种折射率匹配(rim)溶液，其包括：
a)水溶性聚合物，其中聚合物的摩尔折射度(rll)与摩尔体积(vm)的比率为0.27到0.34；
b)多元醇，其中水溶性聚合物与多元醇的重量比为0.318:1到4:1；以及
c)水或缓冲剂，其中rim溶液的折射率为1.36或更大。
2.根据条款1的rim溶液，其中折射率为1.60或更小。
3.一种将生物样本封固在衬底上的方法，其包括：
将生物样本沉积在衬底上；以及
使生物样本与根据条款1或条款2的rim溶液接触以提供经封固样品。
4.根据条款3的方法，其进一步包括干燥经封固样品，从而水溶性聚合物固化以提供固化聚合物。
5.根据条款4的方法，其中水溶性聚合物在室温下在约48小时或更短时间内固化；或在室温下在24小时或更短时间内固化；或在约40℃的温度下在约4小时或更短时间内固化。
6.根据条款4的方法，其中固化聚合物的折射率超出1.47(例如1.48到1.54；或1.50到1.525)。
7.根据前述条款中任一项的方法，其进一步包括用显微镜观测衬底上的生物样本。
8.一种固化封固剂，其包括水溶性聚合物，其中聚合物的摩尔折射度(rll)与摩尔体积(vm)的比率为0.27到0.34；和多元醇，其中水溶性聚合物与多元醇的重量比是0.318:1到4:1；并且其中固化封固剂的折射率为1.48或更大。
9.根据条款8的固化封固剂，其中水溶性聚合物与多元醇的重量比为0.5:1或更大。
10.根据条款8或9的固化封固剂，其中折射率大于1.47。
11.根据前述条款中任一项的rim溶液或固化封固剂，其中水溶性聚合物不带电。
12.根据条款11的rim溶液，其中不带电水溶性聚合物为聚(丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基乙烯基醚)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚乙烯醇(pva)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)或聚(2-甲基-2-噁唑啉)。
13.根据条款11的rim溶液，其中不带电水溶性聚合物包括n-r丙烯酰胺或n-r甲基丙烯酰胺的单体残基，其中r为甲基、乙基、丙基、异丙基或h；n,n-二甲基丙烯酰胺、n,n-二甲基甲基丙烯酰胺、n,n-二乙基丙烯酰胺、n,n二乙基甲基丙烯酰胺；n-2-羟丙基甲基丙烯酰胺)；或其组合。
14.根据条款11的rim溶液或固化封固剂，其中不带电水溶性聚合物为聚(n-甲基甲基丙烯酰胺)(pmmam)。
15.根据前述条款中任一项的rim溶液或固化封固剂，其中水溶性聚合物带电。
16.根据条款15的rim溶液或固化封固剂，其中带电水溶性聚合物为聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚(氯化二烯丙基二甲基铵)、聚(钠-4-苯乙烯磺酸盐)、聚(亚乙基亚胺)、聚(丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯)、聚(n,n-二乙基乙基氨基丙烯酸酯)、聚(烯丙胺)、聚[双(2-氯乙基)醚-共-1,3-双[3-(二甲胺基)丙基]脲]或聚(乙烯基磺酸钠)。
17.根据前述条款中任一项的rim溶液或固化封固剂，其中水溶性聚合物的重均分子量为约1kda到约100kda。
18.根据前述条款中任一项的rim溶液或固化封固剂，其中水溶性聚合物的重均分子量为约1kda到约20kda。
19.根据前述条款中任一项的rim溶液或固化封固剂，其中水溶性聚合物的重均分子量为约20kda到约100kda。
20.根据前述条款中任一项的rim溶液或固化封固剂，其中水溶性聚合物的重均分子量为约48kda到约80kda。
21.根据前述条款中任一项的rim溶液或固化封固剂，其中折射率为1.48-1.50；或1.50到1.52；或1.52到1.54。
22.根据前述条款中任一项的rim溶液或固化封固剂，其中rim溶液或固化封固剂的折射率匹配钠钙玻璃、硼硅玻璃或浸油的折射率。
23.根据前述条款中任一项的rim溶液或固化封固剂，其中水溶性聚合物不是多元醇。
24.根据前述条款中任一项的rim溶液或固化封固剂，其中多元醇为聚乙烯醇、甘油、二甘油、聚甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、硫二乙醇、硫二丙醇或其组合。
25.根据前述条款中任一项的rim溶液或固化封固剂，其进一步包括抗氧化剂。
26.根据条款25的rim溶液或固化封固剂，其包括1重量％或更少的抗氧化剂。
27.根据条款26的rim溶液，其中抗氧化剂为6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸、3-羧基丙氧基、对苯二酚、对甲氧酚、亚硫酸钠、异抗坏血酸钠、抗坏血酸、没食子酸丙酯、咖啡酸、对苯二胺、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷或其组合。
28.一种经封固生物样本，其包括安置于衬底上的生物样本，其中生物样本包埋于根据前述条款中任一项的固化封固剂中。
29.一种用于将生物样本封固在衬底上的试剂盒，其包括：
a)根据前述条款中任一项的折射率匹配(rim)溶液；以及
b)用于将生物样本封固在衬底上的说明书。
30.根据前述条款中任一项的方法、经封固生物样本或试剂盒，其中衬底为显微镜载片、比色杯、孔或皿。
31.根据前述条款中任一项的方法、经封固生物样本或试剂盒，其中生物样本为细胞、组织、3d细胞培养物(例如球体/类器官)或完整生物体(例如果蝇、蠕虫、斑马鱼)。
32.根据前述条款中任一项的方法、经封固生物样本或试剂盒，其中生物样本用荧光染料或荧光蛋白质标记。
1.一种折射率匹配(rim)溶液，其包括：
a)水溶性聚合物，其中所述聚合物的摩尔折射度(rll)与摩尔体积(vm)的比率为0.27到0.34；
b)多元醇，其中所述水溶性聚合物与所述多元醇的重量比为0.318:1到4:1；以及
c)水或缓冲剂，其中所述rim溶液的折射率为1.36或更大。
2.根据权利要求1所述的rim溶液，其中所述折射率为1.60或更小。
3.一种将生物样本封固在衬底上的方法，其包括：
将所述生物样本沉积在所述衬底上；以及
使所述生物样本与根据权利要求1或权利要求2所述的rim溶液接触以提供经封固样品。
4.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括干燥所述经封固样品，从而所述水溶性聚合物固化以提供固化聚合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述水溶性聚合物在室温下在约48小时或更短时间内固化；在室温下在24小时或更短时间内凝固化，或在约40℃的温度下在约4小时或更短时间内固化。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述固化聚合物的折射率超过1.47。
7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括用显微镜观测所述衬底上的所述生物样本。
8.一种固化封固剂，其包括水溶性聚合物，其中所述聚合物的摩尔折射度(rll)与摩尔体积(vm)的比率为0.27到0.34；和多元醇，其中所述水溶性聚合物与所述多元醇的重量比是0.318:1到4:1；并且其中所述固化封固剂的折射率为1.48或更大。
9.根据权利要求8所述的固化封固剂，其中所述水溶性聚合物与所述多元醇的所述重量比是0.5:1或更大。
10.根据权利要求8或9所述的固化封固剂，其中所述折射率大于1.47。
11.根据权利要求1所述的rim溶液或根据权利要求8所述的固化封固剂，其中所述水溶性聚合物不带电。
12.根据权利要求11所述的rim溶液，其中不带电水溶性聚合物为聚(丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基乙烯基醚)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚乙烯醇(pva)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)或聚(2-甲基-2-噁唑啉)。
13.根据权利要求11所述的rim溶液，其中所述不带电水溶性聚合物包括n-r丙烯酰胺或n-r甲基丙烯酰胺的单体残基，其中r为甲基、乙基、丙基、异丙基或h；n,n-二甲基丙烯酰胺、n,n-二甲基甲基丙烯酰胺、n,n-二乙基丙烯酰胺、n,n二乙基甲基丙烯酰胺；n-2-羟丙基甲基丙烯酰胺)；或其组合。
14.根据权利要求1所述的rim溶液或根据权利要求8所述的固化封固剂，其中所述不带电水溶性聚合物为聚(n-甲基甲基丙烯酰胺)(pmmam)。
15.根据权利要求1所述的rim溶液或根据权利要求8所述的固化封固剂，其中所述水溶性聚合物带电。
16.根据权利要求1所述的rim溶液或根据权利要求8所述的固化封固剂，其中带电水溶性聚合物为聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚(氯化二烯丙基二甲基铵)、聚(钠-4-苯乙烯磺酸盐)、聚(亚乙基亚胺)、聚(丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯)、聚(n,n-二乙基乙基氨基丙烯酸酯)、聚(烯丙胺)、聚[双(2-氯乙基)醚-共-1,3-双[3-(二甲胺基)丙基]脲]或聚(乙烯基磺酸，钠盐)。
17.根据权利要求1所述的rim溶液或根据权利要求8所述的固化封固剂，其中所述水溶性聚合物的重均分子量为约1kda到约100kda。
18.根据权利要求1所述的rim溶液或根据权利要求8所述的固化封固剂，其中所述水溶性聚合物的重均分子量为约1kda到约20kda。
19.根据权利要求1所述的rim溶液或根据权利要求8所述的固化封固剂，其中所述水溶性聚合物的重均分子量为约20kda到约100kda。
20.根据权利要求1所述的rim溶液或根据权利要求8所述的固化封固剂，其中所述水溶性聚合物的重均分子量为约48kda到约80kda。
21.根据权利要求8所述的固化封固剂，其中所述折射率为1.48-1.50；或1.50到1.52；或1.52到1.54。
22.根据权利要求8所述的rim固化封固剂，其中所述固化封固剂的所述折射率匹配钠钙玻璃、硼硅玻璃或浸油的折射率。
23.根据权利要求1所述的rim溶液或根据权利要求8所述的固化封固剂，其中所述水溶性聚合物不是多元醇。
24.根据权利要求23所述的rim溶液或固化封固剂，其中所述多元醇为聚乙烯醇、甘油、二甘油、聚甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、赤藻糖醇、硫二乙醇、硫二丙醇或其组合。
25.根据权利要求1所述的rim溶液或根据权利要求8所述的固化封固剂，其进一步包括抗氧化剂。
26.根据权利要求25所述的rim溶液或固化封固剂，其包括1重量％或更少的所述抗氧化剂。
27.根据权利要求25所述的rim溶液或固化封固剂，其中所述抗氧化剂为6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸、3-羧基丙氧基、对苯二酚、对甲氧酚、亚硫酸钠、异抗坏血酸钠、抗坏血酸、没食子酸丙酯、咖啡酸、对苯二胺、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷或其组合。
28.一种经封固生物样本，其包括安置于衬底上的生物样本，其中所述生物样本包埋于根据权利要求8所述的固化封固剂中。
29.一种用于将生物样本封固在衬底上的试剂盒，其包括：
c)根据权利要求1所述的折射率匹配(rim)溶液；以及
d)将所述生物样本封固在所述衬底上的说明书。
30.根据权利要求3所述的方法，根据权利要求28所述的经封固生物样本或根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述衬底为显微镜载片、比色杯、孔或皿。
31.根据权利要求3所述的方法，根据权利要求28所述的经封固生物样本或根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述生物样本为细胞、组织、3d细胞培养物或完整生物体。
32.根据权利要求3所述的方法，根据权利要求28所述的经封固生物样本或根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述生物样本用荧光染料或荧光蛋白质标记。
技术总结