本发明涉及一种基于使用多细胞微生物自动检测溶液中分子化合物的装置和方法，该装置和方法有效、可靠、简单且便宜。
具体地，该装置基于线虫类秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans或c.elegans)在识别并且与显示出高化学敏感性和趋化性的某些分子化合物相互作用方面(根据单细胞或多细胞生物体根据周围环境中化学物质的存在而指引它们的运动的现象)高效的用途。这类分子化合物与秀丽隐杆线虫的感觉-嗅觉系统相互作用，由此它们也被称为气味物质或气味剂。
本发明可以应用于不同的应用环境中，例如在医学领域中用于筛选以便早期检测肿瘤标记物和其他疾病，控制环境污染以检测某些化合物或毒素的存在，通过检测与行为动力学相关联的分子来开发人工智能和人-机器人互动，仍然保持在所附权利要求限定的保护范围内。
拥有转基因谱系的秀丽隐杆线虫，在吸引趋向特定分子靶点方面的高效性在文献中已经为人所知，自然能够响应于刺激其嗅觉系统的分子而产生神经元活动。它的大部分神经系统和超过5％的基因专用于识别环境中的化学物质。化学感觉刺激可以诱导趋化性、整体运动性的改变，以及进入和退出各同发育阶段。这些行为由含有11对化学感觉神经元的感觉器官头感器调节。每个感觉神经元表达一组特异性候选受体基因并识别一组特异性引诱剂分子、驱避剂分子或信息素。在化学感觉神经元中表达约500至1000种不同的g蛋白偶联受体(gpcr)。因此，秀丽隐杆线虫具有高度发育的化学感觉系统，而使其同样能够识别多种挥发性或水溶性化合物。在n.bakhtina，j.korvink的论文“microfluidiclaboratoriesforc.elegansenhancefundamentalstudiesinbiology”，rscadv.，2014，4，4691中，作者指出秀丽隐杆线虫识别了一大类分子，例如氯化钠nacl、乙醇、异戊醇、氯化铜cucl2、伊维菌素、氰化物、甘油、抗生素、重金属。在hirotsut.等人(2015年)，ahighlyaccurateinclusivecancerscreeningtestusingcaenorhabditiselegansscentdetection，plosone10(3)：e0118699，doi：10.1371/journal.pone.0118699一文中，秀丽隐杆线虫对肿瘤代谢物的敏感性已被证明。关于似乎不足以刺激神经元活动的分子，可能开发出线虫的转基因变体，其中必要的受体在一些嗅觉神经元中表达。也就是说，由于将基因工程技术应用于秀丽隐杆线虫，因而可能创造出对预定义的气味高度敏感的转基因蠕虫系。
目前识别气味物质的技术是基于测量当线虫从由于被检查的气味物质而引起的刺激(神经元活动)分离时产生的荧光脉冲。主要的缺点是线虫高速繁殖，因此几个小时后以前选择的种群也将是极其异种的。秀丽隐杆线虫的生命周期可以概括如下：胚胎期、4个幼虫期(l1-l4)、成虫期。在成虫期，可以区分年轻成虫期和开始产卵成虫期。卵、产卵的成虫或濒临死亡(或已经死亡)的个体的存在涉及线虫特有的非常高水平的自体荧光，因此使得对神经元响应的测量特别复杂。因此，与单次测量相比，同步化线虫饲养需要1或2小时的精度，而化合物的检测不可能与线虫饲养无关。上述缺点使得基于使用多细胞微生物诸如线虫类秀丽隐杆线虫的分子化合物检测技术的扩展和自动化使用(即工业规模的实验室的使用)变得困难。
本发明的目的是克服目前已描述的缺点，允许通过使用微型多细胞微生物诸如线虫类秀丽隐杆线虫以可靠、安全和廉价的方式来检测某些分子化合物。
本发明的具体主题是一种基于线虫的使用来检测气味物质的自动化装置，其包括：机械选择单元，配置成从初始线虫种群中选择处于成虫期的线虫以获得中间线虫种群；线虫光学选择单元，配置成从中间种群中选择处于成虫期的线虫最终种群并且从处于产卵的成虫期的线虫中选择处于年轻成虫期的线虫，以送至测量单元，所述测量单元配置成检测最终种群的线虫对气味物质的刺激的响应，所述机械选择单元通过具有至少三路分支的连接通道而连接到所述光学选择单元，并且所述光学选择单元通过装载微通道而连接到所述测量单元，其中：
—机械选择单元包括收集容器，所述收集容器设置有至少一个第一可关闭入口喷嘴和至少一个第二可关闭入口喷嘴，所述至少一个第一可关闭入口喷嘴配置成将含有线虫的维持缓冲液引入容器中，所述至少一个第二可关闭入口喷嘴配置成将附加缓冲液引入容器中，其中容器设置有可关闭的出口孔和机动化的双格栅，配置成采取第一打开构型和第二关闭构型，其中所述至少一个第一喷嘴和所述至少一个第二喷嘴被定位在容器的基部附近并且配置成从基部开始填充容器，机动化的双格栅被放置成平行于容器的基部，与基部相距的距离大于所述至少一个第一喷嘴和所述至少一个第二喷嘴并且配置成仅使线虫的卵或幼虫穿过其自身的孔；
—光学选择单元包括：至少三个测量微流体通道，所述至少三个测量微流体通道配置成逐个输送中间种群的线虫；三个光学传感器，所述三个光学传感器配置成执行对输送的线虫的长度测量；照明器，所述照明器配置成照射至少三个测量微流体通道并且与双光电二极管相关联，所述双光电二极管配置成对逐个输送的线虫进行自体荧光测量，光学选择单元配置成将线虫导向测量单元或导向废料罐；以及阻断阀，所述阻断阀配置成阻断在测量单元中线虫的通路；
—测量单元包括：中心层，所述中心层包括具有柱状微流体回路的微流体芯片，所述柱状微流体回路设置有装载孔以及排放孔，所述装载孔连接到装载微通道，所述装载微通道配置成将线虫引入微流体回路中，所述排放孔配置成从微流体回路移除线虫，所述芯片配置成经由第一入口通道接收测试液体并且经由第二输入通道接收中性缓冲液；第一端层，所述第一端层包括光源，所述光源配置成发射连续光以及调制光以照射微流体回路，发射的调制光配置成激发线虫的荧光，并且该光源与配置成接收线虫的荧光的光电二极管相关联；第二端层，所述第二端层包括相对于中心层而与第一端层相对的光学传感器，所述光学传感器配置成当微流体回路被发射的连续光照射时获取微流体回路的透射光图像，并且在气味物质存在和不存在的情况下分析运动线虫；
所述装置还包括控制单元以控制机械选择单元、光学选择单元和测量单元。
根据本发明的另一方面，连接通道的所述至少三路和所述装载微通道可以具有不小于100μm的部分。
根据本发明的另一方面，双格栅的所述孔可以具有50μm至500μm的尺寸。
根据本发明的另一个方面，对于所述至少三个测量微流体通道中的每一个，所述三个光学传感器可以被定位成沿着通道的纵向，并且可以以这样的距离从彼此平移，以便第一光学传感器的、第二光学传感器的和第三光学传感器的通道上的正交投影分别识别第一目标位置、第二目标位置和第三目标位置，所述第二光学传感器和所述第三光学传感器可选地分别相对于所述第一光学传感器平移大约900μm和1000μm。
根据本发明的另一方面，对于所述至少三个测量微流体通道中的每一个，每个光学传感器可以定位在第一高度，并且所述照明器可以定位在与所述第一高度相对的第二高度，所述照明器相对于三个目标位置定位在中心位置，可选地相对于第一目标位置和第二目标位置居中。
根据本发明的另一方面，第一端层的所述光源可以是以双阵列布置的led，以发射连续光和调制光，可选地分别为550nm和470nm，可选地调制频率不超过1khz。
本发明的另一具体主题是使用本发明的自动检测装置基于线虫的使用来自动检测气味物质的方法，该方法包括以下步骤：
将初始量的含有线虫初始种群的维持缓冲液经由超压系统通过微通道结构注射到机械选择单元的容器中，其中所述至少一个第一可关闭入口喷嘴被打开，所述初始量的维持缓冲液使得在打开构型中接触双格栅；
在时间间隔之后，以脉冲方式将一定量的附加缓冲液通过微通道的结构注射到机械选择单元的容器中，其中所述至少一个第二可关闭入口喷嘴被打开，以将初始线虫种群推向打开的双格栅，以便初始种群的成员穿过双格栅，所述成员具有最低比重和比打开的双格栅的孔的尺寸更小的特定尺寸；
关闭双格栅以及至少一个第一可关闭入口喷嘴和至少一个第二可关闭入口喷嘴，由此收集容器包括中间量的维持缓冲液，所述维持缓冲液含有线虫中间种群，所述线虫中间种群的大部分处于成虫期；
打开可关闭的出口孔，并且通过具有至少三路分支的连接通道而将中间量的液体注射到光学选择单元中，以将线虫逐个地输送到至少三个测量微流体通道中；
光学选择逐个输送的线虫，所述光学选择包括以下子步骤：
—光学测量逐个输送的线虫的长度l并且检查长度l是否被包括在确定的长度范围δl中，其中如果长度l不被包括在确定的范围δl中，则在至少三个测量通道的输出处朝向废料罐丢弃逐个输送的线虫；
—测量逐个输送的线虫的绿色自体荧光f绿和红色自体荧光f红，并且检查比率
—如果长度l在范围δl内并且比率
检查n是否等于或大于确定值ntot，其中如果数量n等于或大于ntot，则通过激活阻断阀而阻断在测量单元中线虫的通路；
通过以下子步骤分析柱状微流体回路中的n个线虫对气味物质的响应：
—用由第一端层的光源发射的光照射柱状微流体回路的区域；
—通过与光源相关联的光电二极管测量在柱状微流体回路的区域上集成的第一自体荧光信号以获得荧光背景值，并通过柱状微流体回路的区域的光学传感器scmos或ccd获取透射光图像以检查微流体回路中线虫的数量和运动性；
—将来自第三罐的可能含有至少一种气味物质的测试液体注射到芯片中；
—将来自第四罐的中性缓冲液注射到芯片中以将测试液体排放到出口罐；
—通过与第一端层的光源相关联的光电二极管来测量第二集成荧光信号；
—计算第二荧光信号的参数，例如上升时间τ上升和下降时间τ下降；
—检查τ上升是否被包括在第一时间范围t1内，τ上升∈t1，以及τ下降是否被包括在第二时间范围t2内，τ下降∈t2，其中t1和t2是神经元中钙浓度重排的标准时间范围，所述神经元是通过缺乏在气味物质存在下由线虫感受到的刺激而激活的，其中如果
—通过微流体回路的区域的scmos或ccd光学传感器获取透射光图像；
—分析所获取的图像以确定线虫的运动性以检查是否存在由于趋化性所致的运动性，其中
—如果不存在由于趋化性所致的运动性，则该方法识别到测试液体中不存在气味物质，而
—如果存在由于趋化性所致的运动性，则该方法识别到测试液体中存在气味物质；
—将中性缓冲液从芯片排放到出口罐中。
根据本发明的另一方面，分析n线虫响应的所述步骤可以在所述方法结束之前执行m次，m＝1、2、…，可选地等于2。
根据本发明的另一方面，所述长度范围δl可以分别在第一光学传感器到第二光学传感器的距离和第一光学传感器到第三光学传感器的距离之间的范围内，可选地在900μm到1000μm的范围内。
根据本发明的另一方面，所述阈值ε可以等于0.5。
根据本发明的另一方面，所述ntot可以在20到50的范围。
根据本发明的另一方面，分析所获取的图像的所述步骤可以通过比较随后的透射图像并通过产生二进制图像的差分阈值过程来执行，由此根据强度是否超过确定的阈值，可以将像素与背景或者与线虫相关联。
根据本发明的装置相对于现有技术解决方案所提供的优点是众多且显著的。
线虫的分离单元基于它们的生命阶段在其分离单元下游根据尺寸和比重分离，相对于异种种群，确保了高效线虫种群以供检测分子化合物。这具有第一个优点，即克服了同步化线虫饲养的问题，例如通过组织饲养和分配线虫的系统实现，该系统允许向位于距饲养中心合理距离处的多个测量实验室提供日常递送。第二个优点是随着线虫对分子化合物的神经元响应的测量中的信噪比增加，检测分子化合物的可靠性也增加。测量对气味物质刺激的响应的单元允许行为测量，即趋化性行为测量，和神经元活动测量，即钙成像测量。这有利地增加了装置的可靠性，即其在检测分子化合物中的灵敏度，减少了假阳性或假阴性。另一个显著的优点是所述装置是完全自动化的，并且提供大约几分钟的响应时间，这与现今在花费多于一天来选择和准备的实验室测试中发生的情况相反。另一个优点是该装置结构紧凑、便于携带，因此用途极其广泛。还有另一个优点是，秀丽隐杆线虫作为原料可以大量获得，或者也可以以低成本大量生产，并且不会造成任何伦理问题。
现在将根据本发明的优选实施例，通过具体地参考附图的图，以说明而非限制的方式来描述本发明，在附图中：
图1示意性地示出了根据本发明的装置的优选实施例；
图2示出了图1的装置的用于机械选择线虫的单元的示意图；
图3示出了图1的装置的用于光学选择线虫的单元的示意图；
图4示出了图1的装置的用于测量线虫对气味物质刺激的响应的单元的示意图；
图5示出了图1的装置的微流体芯片的透视图(a)和前视图(b)；
图6示出了根据本发明的方法的优选实施例的示意性流程图。
在附图中，相同的附图标记将用于相同的元件。
图1示出了根据本发明的装置1000的优选实施例，其包括单元100，以便从初始线虫种群中机械选择成虫线虫以获得中间线虫种群。这种机械选择单元100连接到单元200，所述单元200用于从中间种群光学选择线虫以获得最终种群，继而连接到测量单元300，所述测量单元300配置成检测最终种群的线虫对气味物质的刺激的响应。下面将参照图2至图4详细描述这种第一单元、第二单元和第三单元。装置1000还包括用于流体管理的服务单元(例如液体存储罐)和至少一个控制模块(图中未示出)，以便控制和调节液体流，以便控制机械选择单元100和光学选择单元200和测量单元300，也以便于分析从测量单元300获得的数据。参考图2，装置1000包括第一储罐5和第二储罐10，所述第一储罐5用于将秀丽隐杆线虫存储在维持缓冲液(例如m9、s基液)的溶液中，所述第二储罐10用于储存附加缓冲液(即不含线虫)。第一储罐5和第二储罐10在第一端处连接到由泵操作的超压系统(图中未示出)，在第二端处连接到入口微通道结构11。具有不小于100μm(可选地等于200μm)的部分的第一微通道结构11将第一储罐5和第二储罐10连接到线虫机械选择单元100。这种入口微通道结构11具有的功能是使含有线虫的维持缓冲液或附加缓冲液通过由图中未示出的泵操作的超压系统从相应的储罐到达单元100。图中未示出的控制单元控制该泵。机械选择单元100配置成从初始线虫种群中选择成虫期的线虫。机械选择单元包括收集容器12，收集容器12设置有第一可关闭入口喷嘴和第二可关闭入口喷嘴，所述第一可关闭入口喷嘴配置成将含有线虫的维持缓冲液引入容器12中，所述第二可关闭入口喷嘴配置成将附加缓冲液引入容器12中。第一和第二可关闭入口喷嘴(图中未示出)定位于容器基部上并由控制单元控制。在其他实施例中，容器12可以设置有多于两个可关闭入口喷嘴。在进一步的实施方案中，至少两个喷嘴可以放置在容器12的基部附近。通过由受控于控制单元的泵操作的超压机构，使含有初始线虫种群的初始量的维持缓冲液从第一储罐5排出，进入入口微通道结构11，并通过打开的第一可关闭入口喷嘴注入收集容器12中。容器12被调整尺寸以使得其容量大于从第一罐5排出的液体的初始量。收集容器12设置有双格栅14，所述双格栅14被布置成平行于容器12的基部在与该基部相距一定距离处。在至少两个可关闭入口喷嘴位于容器基部附近的实施例中，双格栅布置成与基部的距离大于至少两个可关闭入口喷嘴的距离。双格栅配置成仅让线虫的卵或幼虫通过其自身。双格栅14是机动化的并且由控制单元控制。双格栅14由第一格栅和与其平行的第二格栅构成。这样的第一和第二格栅可以通过线性致动器19而从彼此平移，以便就位于第一位置和第二位置，在该第一位置处相应的孔对准，即双格栅14打开，由此容纳在容器12中的溶液可以从容器12的内部向外通过所述孔，在该第二位置处相应的孔不对准，即双格栅14关闭，由此容纳在容器12中的溶液不能通过所述孔。在本发明的其他实施例中，第一穿孔格栅是固定的，而由线性致动器操作的第二滑动格栅打开和关闭双格栅14。它是具有孔的正方形阵列格栅，所述孔可以在50μm到500μm的范围。在其他实施例中，所述孔可以采用与正方形不同的形状。双格栅14被布置在容器12的接触高度处，以便接触与引入容器12中的初始量的维持液体的体积相等的液体体积。因此，一旦引入初始量的维持液体，双格栅14接触这样的液体量。当附加缓冲液被注入含有初始量的维持液的容器12中时，附加缓冲液将初始线虫种群推向打开的双格栅14。附加缓冲液被设计成使得溶液从容器12的下部流动并推动其通过打开的双格栅14。因此，初始种群的成员(所述成员具有最低比重和比打开的双格栅14的孔的尺寸低的特定尺寸)，即卵和幼虫，穿过所述格栅，直到含有中间线虫种群(其中大部分处于成虫期)的中间量的维持液保留在容器12中。事实上，尺寸(长度)在900-940μm范围内的年轻成虫期线虫和尺寸(长度)在1110-1150μm范围内的成虫期线虫，具有大于孔尺寸的尺寸，不能向外穿过打开的双格栅。容器12包括出口孔15，所述出口孔15可由第一电磁阀组装件20关闭，如图3可见，配置成使得液体从容器12排出而排空容器12。在本发明的优选实施例中，注射溶液的量为约200μl，等于约200mm3体积，容器12具有约6×6mm2的正方形基部，其中双格栅14定位于约6mm的高度，以便接触容器12中初始溶液的量。在另一优选实施例中，容器12具有较大面积的正方形或矩形基部，以便使双格栅14定位于较低高度，更靠近容器12的下部，具有能更容易制造的较大面积。容器在格栅上方延伸额外的11mm高度以容纳约400μl的附加缓冲液。其他实施例具有不同尺寸的装置，由此根据装置尺寸，注射溶液的量可以小于或大于200μl。机械选择单元100通过具有三路分支(图中未示出)的连接通道而连接到线虫的光学选择单元200，每个部分不小于100μm，通过第一电磁阀组装件20而连接到容器14的可关闭出口孔15。在进一步的实施例中，连接通道可以具有分支，该分支具有大于三的多个支路。连接通道具有的功能是使中间量的液体(即大部分处于成虫期的中间线虫种群)通过由受控于控制单元的泵操作的超压机构从机械选择单元100传递到线虫光学选择单元200，如图3所示。此后，所述控制单元已关闭第一可关闭入口喷嘴和第二可关闭入口喷嘴和双格栅14。光学选择单元200配置成通过对包括在中间种群中的每个单独线虫的第一光学测量和第二光学测量，从中间种群中选择成虫期的线虫的最终种群，并且从产卵成虫期的线虫中选择年轻成虫期的线虫。光学选择单元200包括三个彼此平行的测量微流体通道，其中三通连接通道分支并且其中线虫通过由泵操作的超压系统而被逐个地输送。至少三个测量微流体通道的存在避免了由其中一个通道本身中的线虫阻塞引起的可能的装置操作中断。在另外的实施例中，光学选择单元的测量通道的数量大于三。在线虫在三个测量微流体通道之一中通过期间，进行第一和第二光学测量以确定线虫生命阶段。第一光学测量识别输送的线虫的长度，而第二光学测量识别其相对于红色自体荧光的绿色自体荧光强度。事实上，一旦已知线虫长度，就可以从产卵成虫期的线虫中选择年轻成虫期的线虫。相反，对绿色和红色自体荧光的比率的测量选择线虫，因为自体荧光的比率随着线虫年龄的增加而增加。根据所进行的第一和第二光学测量的结果，而选择要被送到单元300的线虫，所述单元300测量线虫对气味物质刺激的响应。光学选择单元200包括第一光学传感器22、第二光学传感器23和第三光学传感器24，以便三个测量微流体通道中的每一个执行线虫长度的第一光学测量。对于每个测量通道，第一、第二和第三光学传感器22、23和24定位于自通道起的第一高度处并且沿着通道的纵向方向，它们从彼此平移，以便第一光学传感器22在相关通道上的正交投影识别第一目标位置，第二光学传感器23在相关通道上的正交投影识别第二目标位置，并且第三光学传感器24在相关通道上的正交投影识别第三目标位置。在装置的优选实施例中，第二光学传感器和第三光学传感器距第一光学传感器的距离分别等于约900μm和1000μm。三个光学传感器22、23和24由控制单元控制。对于三个测量微流体通道中的每一个，由第一光学测量给出并在下面示出的线虫选择的逻辑的条件是，一旦由于输送的线虫个体到达第一目标位置而激活第一传感器22，则来自第一光学传感器22的电信号就必须直到由输送的线虫个体在到达第二目标位置时引起第二光学传感器23的激活时才开始下降到零，并且必须在由输送的线虫个体在到达第二目标位置时引起第三光学传感器24的激活之前回到零。只有当这些条件发生时，即当输送的被测量的线虫个体具有从第一长度到第二长度的范围中的长度时，所述第一长度由第一目标位置和第二目标位置之间的距离标识，所述第二长度由第一目标位置和第三目标位置之间的距离标识并且可归属于年轻成虫的长度，输送的线虫个体才可从离开机械选择单元100的中间种群中选择。光学选择单元200包括照明器25、可选地led照明器，所述照明器具有在400-440nm波长范围内的白光或蓝光，配置成照射三个测量微流体通道并与用于每一个测量微流体通道的双光电二极管26相关联，所述双光电二极管26配置成执行对输送的线虫的自体荧光的第二光学测量。双光电二极管26具有：两个感测元件以分别检测绿色和红色波长的光；在所述感测元件的表面上设置的两个干涉滤光器；以及两个收聚光学器件以将发射的光聚焦到两个感测元件中的每一个上。由第二光学测量给出并在下面说明的线虫选择逻辑的条件是，绿色自体荧光与红色自体荧光之间的比率小于确定的阈值，可选地小于0.5。只有当这种条件和上述关于长度的条件发生时，才将输送的线虫个体从离开机械选择单元100的中间种群中选择在最终种群中。照明器25定位于自三个测量微流体通道起的第二高度处。在图3的本发明的优选实施例中，第二高度与三个光学传感器22、23和24的第一高度相反，并且照明器25处于这样的位置，以便当线虫相对于三个目标处于中心位置时，可选地相对于第一目标和第二目标处于中心位置时，执行自体荧光的第二光学测量。光学传感器22、23和24由控制单元控制。在其他实施例中，在第一长度测量之后，级联地执行荧光的第二测量。由控制单元控制的第二电磁阀组装件21定位于三个测量微流体通道的出口处，以将输送的线虫导向到装载微通道中，导向测量单元300或导向废料罐16，该装载微通道将光学选择单元200连接到测量单元300，可选地具有不小于约100μm的直径。附加的计数光学传感器定位成与线虫装载微通道相对应并由控制单元控制。装置1000包括阻断阀，以便在确定数量(可选地在20至50个的范围内)的线虫通过之后，阻断线虫在测量单元300中的通路。被阻断阀阻断的中间种群的线虫在介于单元200和单元300之间的装载通道中保留大约几分钟的时间，以等待由测量单元300执行的下一次测量，或者通过第二电磁阀组装件21而被送到废料罐16。图4示出了测量线虫对气味物质刺激的响应的单元300的示意图。测量单元300配置成通过测量趋化性和神经元活动，即测量运动和荧光，来检测线虫对气味物质刺激的响应。测量单元300包括至少三层的装置。中心层包括微流体芯片50，在其中形成柱状微流体回路51，在该柱状微流体回路51中引入最终种群的线虫。图5示出了微流体芯片50的实施例。在柱状微流体回路51的第一边缘附近，微流体芯片50设置有装载孔52，所述装载孔52连接到装载微通道，并配置成将线虫引入微流体回路51中。在第一边缘附近，微流体芯片50还设置有第一入口孔53和第二入口孔54，所述第一入口孔53配置成通过第一入口通道而从第三储罐17接收测试液体，所述第二入口孔54配置成通过第二入口通道而从第四储罐18接收中性缓冲液。测试液体是其中可能存在必须检测的气味物质的液体，并且缓冲液是不含有气味物质的液体，例如m9、s基液。在柱状微流体回路的与第一边缘相对的第二边缘附近，微流体芯片50设置有排放孔55，所述排放孔通过出口通道而连接到废料罐16，配置成使得液体从回路51排出。在另外的实施例中，出口通道连接到不同于废料罐16的出口罐。在根据本发明的装置的优选实施例中，微流体芯片具有高达20mm×20mm的尺寸，柱为70μm高度，具有200μm的直径和300μm的间距，并且液体入口通道具有大约100μm的直径。本发明的其他实施例可以具有不同的尺寸和间距。第一端层包括连续光源和调制光源以照射中心层的微流体芯片，并且第二端层(相对于中心层而与第一端层相对)包括光学传感器，例如scmos或ccd，以便在来自第一端层的光源照射时获取微流体芯片的透射光图像，即测量透射光成像，所述光学传感器配置成测量趋化性。具体地，为了获得趋化性测量，在已将测试液体注入到蠕虫装载微通道中之后，分析通过比较随后的图像获得阴影的图像。在装置的优选实施例中，第二端层的光学传感器和层的芯片之间的距离为约300μm。在装置的优选实施例中，第一端层的光源是以双阵列布置的led，并且配置成发射550nm的连续光，以获取透射图像，即透射光成像的测量，并且发射470nm的调制光，可选地具有不超过1khz的调制频率，以刺激由所使用的特定转基因线虫系表达的绿色荧光蛋白gfp的荧光。在装置的其他实施例中，连续光源可以是发射白光的灯或led。测量响应的第三单元300还包括光电二极管，所述光电二极管与调制光源相关联，具有适当的收聚光学器件，在所述光电二极管的感测表面上设置了大约525/50nm的干涉滤光器，所述干涉滤光器与所使用的转基因系的特异性gfp的发射峰对应。事实上，在适当的遗传修饰后，使用的线虫在受体神经元中表达特异性蛋白结合钙。参考图6所示的流程图，下面描述根据本发明基于线虫的使用而自动检测测试液体中的气味物质的方法的优选实施例的步骤。通过使用上述装置1000来执行这种方法。在初始步骤600中，通过由泵操作的超压系统，将含有初始线虫种群的初始量的维持缓冲液从第一储罐5排出并注入到机械选择单元100中以从初始种群中选择成虫线虫。初始线虫种群通过入口微通道结构11而被注射到具有打开的第一可关闭入口喷嘴的收集容器12中。初始量对应于液体体积，所述液体体积当被容纳在收集容器12中时接触打开的双格栅14。在步骤610中，在大约几分钟(可选地等于1分钟)的确定时间间隔之后，通过由泵操作的超压系统以脉冲方式从第二储罐10排出一定量的不含线虫的附加缓冲液，并且它们通过入口微通道结构11被注入到收集容器12中，第二可关闭入口喷嘴是打开的。以此方式，附加的缓冲液推动容器12中包括的初始量的液体通过打开的双格栅14，以便线虫卵和幼虫通过双格栅14。在使用本发明装置的优选实施例执行所述方法时，脉冲数为4，并且附加缓冲液的量的体积流量等于大约100μl/s。在其他实施例中，脉冲的数量和附加缓冲液的体积流量可以根据机械选择单元100的尺寸而变化，具体地根据收集容器12的尺寸而变化。在脉冲结束时，在步骤611中，关闭双格栅14以避免刚刚已通过双格栅14的成员下落，并且关闭收集容器12的第一入口喷嘴和第二入口喷嘴。因此，收集容器12包括中间量的含有中间线虫种群(其中大部分处于成虫期)的维持液体。在随后的步骤612中，第一电磁阀组装件20打开可关闭的出口孔15，并且借助于由泵操作的超压系统，通过具有三路分支的连接通道而将中间量的液体注入到光学选择单元200中，在光学选择单元200中，中间种群的线虫被逐个地输送到三个测量微流体通道中。在随后的步骤620中，成虫期的线虫和年轻成虫期的线虫可选地选自产卵成虫期的线虫。这种选择通过光学分析在中间种群中包括的线虫个体来进行。线虫的光学选择步骤620包括两个光学测量621和623，它们可以同时或级联地进行。在子步骤621中，如前所述，光学测量输送的线虫个体的长度l，并且在子步骤622中，检查这种长度l是否被包括在确定的长度范围δl内。如果长度l不被包括在所确定的范围δl中，则流程继续通过“否”分支到达丢弃线虫的步骤630，由此在光学选择单元200的测量通道的出口处，第二电磁阀组装件21将输送的线虫个体导向废料罐16。如果长度l被包括在所确定的范围δl中，则流程继续通过“是”分支到达子步骤623，在该子步骤623中，如前所述，测量输送的线虫个体的绿色自体荧光f绿和红色自体荧光f红，并且在子步骤624中，检查绿色自体荧光f绿和红色自体荧光f红之间的比率，
在子步骤674之后并且与子步骤675同时，在子步骤678中，通过测量单元300的第二端层的光学传感器，即scmos或ccd，获取柱状微流体回路51的区域的透射图像。在子步骤679中，分析所获取的图像以在子步骤680中检查由于线虫趋化性所致的可能的运动性，由此如果存在由于趋化性所致的运动性，则所述方法识别到测试液体中存在有气味物质，而如果线虫保持无差异，即不存在由于趋化性所致的运动性，则所述方法识别到测试液体中不存在气味物质。如果在步骤677中确定τ上升∈t1并且τ下降∈t2并且在步骤680中确定不存在由于趋化性所致的运动性，该方法识别出其为假阳性。在优选实施例中，通过蠕虫追踪(worm-tracing)技术执行子步骤679的分析，由此分析所获得的阴影的图像，即比较随后的透射图像。利用此技术，然后用不同图像之间的差分阈值程序从背景噪声外推线虫的形状，以提高信噪比并丢弃微流体芯片的固定背景。这样的过程允许优化视频质量，从而线虫可以容易地被识别为白色背景上的高对比度(黑色)对象。上述差分阈值操作根据强度是否超过所确定的阈值而将像素分配给线虫或背景，从而生成二进制图像以允许从头部到尾部界定线虫。已获得此二进制图像，因此可以获得不同的参数，如线虫的数量或线虫的质心，由此还可以以质心随时间的位移速率的方式获得它们的速度。在检查680由于趋化性所致的运动性结束时，流程继续进行到步骤690，在该步骤中，中性缓冲液从芯片排出在出口罐中。在所述方法的优选实施例中，步骤670在所述方法结束之前执行m次，其中m＝1、2、...，即，在所述方法结束之前，流程m次从所述方法的步骤690返回到步骤670。在优选的实施例中，m＝2，液体的流量为约
已经描述了本发明的优选实施例，并且在上文中已提出了许多变化形式，但是应当理解，本领域技术人员可以进行其他变化和改变而不脱离由所附权利要求限定的本发明的保护范围。
1.基于线虫的使用来检测气味物质的自动化装置(1000)，包括：机械选择单元(100)，所述机械选择单元配置成从初始线虫种群中选择处于成虫期的线虫，以获得线虫中间种群；线虫光学选择单元(200)，所述线虫光学选择单元配置成从所述中间种群中选择处于成虫期线虫的最终种群并且从处于产卵成虫期的线虫中选择处于年轻成虫期的线虫，以送至测量单元(300)，所述测量单元(300)配置成检测所述最终种群的线虫对气味物质的刺激的响应，所述机械选择单元(100)通过具有至少三路分支的连接通道而连接到所述光学选择单元(200)，并且所述光学选择单元(200)通过装载微通道而连接到所述测量单元(300)，其中：
—所述机械选择单元(100)包括收集容器(12)，所述收集容器设置有至少一个第一可关闭入口喷嘴和至少一个第二可关闭入口喷嘴，所述至少一个第一可关闭入口喷嘴配置成将含有线虫的维持缓冲液引入所述容器(12)中，所述至少一个第二可关闭入口喷嘴配置成将附加缓冲液引入所述容器(12)中，其中所述容器(12)设置有可关闭的出口孔(15)和机动化的双格栅(14)，配置成采取第一打开构型和第二关闭构型，其中所述至少一个第一喷嘴和所述至少一个第二喷嘴被定位在所述容器(12)的基部附近并且配置成从所述基部开始填充所述容器(12)，所述机动化的双格栅(14)被放置成平行于所述容器的所述基部，与所述基部相距的距离大于所述至少一个第一喷嘴和所述至少一个第二喷嘴并且配置成仅使线虫的卵或幼虫穿过其自身的孔；
—所述光学选择单元(200)包括：至少三个测量微流体通道，所述至少三个测量微流体通道配置成逐个输送所述中间种群的线虫；三个光学传感器(22、23、24)，所述三个光学传感器配置成执行对输送的所述线虫的长度测量；照明器(25)，所述照明器配置成照射所述至少三个测量微流体通道，并且与双光电二极管(26)相关联，所述双光电二极管(26)配置成对逐个输送的所述线虫进行自体荧光测量，所述光学选择单元(200)配置成将线虫导向所述测量单元(300)或导向废料罐(16)；以及阻断阀，所述阻断阀配置成阻断在所述测量单元(300)中线虫的通路；
—所述测量单元(300)包括中心层、第一端层、第二端层，所述中心层包括具有柱状微流体回路(51)的微流体芯片(50)，所述柱状微流体回路(51)设置有装载孔以及排放孔，所述装载孔与所述装载微通道连接，所述装载微通道配置成将线虫引入所述微流体回路(51)中，所述排放孔配置成从所述微流体回路(51)移除线虫，所述芯片(50)配置成经由第一入口通道接收测试液体且经由第二输入通道接收中性缓冲液，所述第一端层包括光源，所述光源配置成发射连续光以及调制光以照射所述微流体回路(51)，发射的所述调制光配置成激发线虫的荧光，并且所述光源与配置成接收线虫的荧光的光电二极管相关联，所述第二端层包括相对于所述中心层与所述第一端层相对的光学传感器，所述光学传感器配置成当所述微流体回路(51)被发射的所述连续光照射时获取所述微流体回路(51)的透射光图像，并且在气味物质存在和不存在的情况下分析运动线虫；
所述装置(1000)还包括控制单元以控制所述机械选择单元(100)、所述光学选择单元(200)和所述测量单元(300)。
2.根据权利要求1所述的装置(1000)，其中所述连接通道的所述至少三路和所述装载微通道具有不小于100μm的部分。
3.根据权利要求1或2所述的装置(1000)，其中所述双格栅(14)的所述孔具有50μm至500μm的尺寸。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的装置(1000)，其中，对于所述至少三个测量微流体通道中的每一个，所述三个光学传感器(22、23、24)被定位成沿着所述通道的纵向，并且以这样的距离从彼此平移，以便第一光学传感器(22)的、第二光学传感器(23)的和第三光学传感器(24)的所述通道上的正交投影分别识别第一目标位置、第二目标位置和第三目标位置，所述第二光学传感器和所述第三光学传感器(23、24)可选地分别相对于所述第一光学传感器(23)平移大约900μm和1000μm。
5.根据权利要求4所述的装置(1000)，其中，对于所述至少三个测量微流体通道中的每一个，每个光学传感器(22、23、24)被定位在第一高度，并且所述照明器(25)处在与所述第一高度相对的第二高度，所述照明器(25)相对于所述三个目标位置被定位在中心位置，可选地相对于所述第一目标位置和所述第二目标位置居中。
6.根据以上权利要求中的任一项所述的装置(1000)，其中，所述第一端层的所述源是以双阵列布置的led，以发射连续光和调制光，可选地分别为550nm和470nm，可选地调制频率不超过1khz。
7.使用根据权利要求1所述的装置基于线虫的使用来自动检测气味物质的方法，所述方法包括以下步骤：
将初始量的含有线虫初始种群的维持缓冲液经由超压系统通过微通道结构(11)而注射(600)到所述机械选择单元(100)的所述容器(12)中，其中所述至少一个第一可关闭入口喷嘴被打开，所述初始量的维持缓冲液为如此以至在打开构型中接触所述双格栅(14)；
在时间间隔之后，以脉冲方式将一定量的附加缓冲液通过微通道的所述结构(11)注射(610)到所述机械选择单元(100)的所述容器(12)中，其中所述至少一个第二可关闭入口喷嘴被打开，以将所述初始线虫种群推向打开的所述双格栅(14)，以便所述初始种群的成员穿过所述双格栅，所述成员具有最低比重和比打开的所述双格栅(14)的所述孔的尺寸更小的特定尺寸；
关闭(611)所述双格栅(14)以及所述至少一个第一可关闭入口喷嘴和所述至少一个第二可关闭入口喷嘴，由此所述收集容器(12)包括中间量的维持缓冲液，所述维持缓冲液含有线虫中间种群，所述线虫中间种群的大部分处于成虫期；
打开(612)所述可关闭的出口孔(15)，并且通过具有至少三路分支的所述连接通道将所述中间量的液体注射到所述光学选择单元(200)中，以将线虫逐个输送到所述至少三个测量微流体通道中；
光学选择(620)逐个输送的线虫，所述光学选择包括以下子步骤：
—光学测量(621)逐个输送的线虫的长度l并且检查(622)所述长度l是否被包括在确定的长度范围δl中，其中如果所述长度l不被包括在确定的所述范围δl中，则在所述至少三个测量通道的输出处朝向所述废料罐(16)丢弃(630)逐个输送的所述线虫；
—测量(623)逐个输送的所述线虫的绿色自体荧光f绿和红色自体荧光f红，并且检查(624)比率
—如果所述长度l在所述范围δl内并且所述比率
检查(650)n是否等于或大于确定值ntot，其中如果所述数量n等于或大于ntot，则通过激活所述阻断阀而阻断(660)在所述测量单元(300)中线虫的所述通路；
分析(670)在所述柱状微流体回路(51)中所述n线虫对气味物质的所述响应是通过所述以下子步骤：
—用由所述第一端层的所述光源发射的光照射(671)所述柱状微流体回路(51)的区域；
—通过与所述光源相关联的所述光电二极管测量(672)在所述柱状微流体回路(51)的所述区域上集成的第一自体荧光信号以获得荧光背景值，并通过所述柱状微流体回路(51)的所述区域的光学传感器scmos或ccd获取透射光图像以检查所述微流体回路(51)中所述线虫的数量和运动性；
—将来自第三罐(17)的可能含有至少一种气味物质的测试液体注射(673)到所述芯片(50)中；
—将来自第四罐(18)的中性缓冲液注射(674)到所述芯片(50)中以将所述测试液体排放到所述出口罐；
—通过与所述第一端层的所述光源相关联的所述光电二极管测量(675)第二集成荧光信号；
——计算(676)所述第二荧光信号的参数，例如上升时间τ上升和下降时间τ下降；
——检查(677)τ上升是否被包括在第一时间范围t1内，τ上升∈t1，以及τ下降是否被包括在第二时间范围t2内，τ下降∈t2，其中t1和t2是神经元中钙浓度重排的标准时间范围，所述神经元是通过缺乏在气味物质存在下由线虫感测的刺激而激活的，其中如果
—通过所述微流体回路(51)的所述区域的所述scmos或ccd光学传感器获取(678)透射光图像；
—分析(679)所获取的所述图像以确定线虫的运动性以检查(680)是否存在由于趋化性所致的运动性，其中
—如果不存在由于趋化性所致的运动性，则所述方法识别到所述测试液体中不存在气味物质，而
—如果存在由于趋化性所致的运动性，则所述方法识别到所述测试液体中存在气味物质；
—将所述中性缓冲液从所述芯片(50)排放(690)到所述出口罐中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中分析所述n线虫响应的所述步骤(670)在所述方法结束之前执行m次，m＝1、2…，可选地等于2。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述长度范围δl分别在所述第一光学传感器(22)到所述第二光学传感器(23)的距离和所述第一光学传感器(22)到所述第三光学传感器(24)的距离之间的范围内，可选地在900μm到1000μm的范围内。
10.根据权利要求7至9中的任一项所述的方法，其中所述阈值ε等于0.5。
11.根据权利要求7至10中的任一项所述的方法，其中ntot为20至50。
12.根据权利要求7至11中的任一项所述的方法，其中，分析获取的所述图像的所述步骤(679)通过比较随后的透射图像并通过产生二进制图像的差分阈值过程来执行，由此根据强度是否超过确定的阈值，而将像素与背景或线虫相关联。
技术总结