相关申请的交叉引用
本申请要求2017年6月20日提交的美国临时申请序列号62/522,628的权益，其全部内容通过引用并入本文中。
背景技术：
各种多核苷酸测序技术涉及在局部支撑表面上或在预定反应室内进行大量受控反应。然后可以观察或检测指定的反应，并且随后的分析可以帮助鉴定或揭示参与反应的多核苷酸的性质。已经开发了另一种多核苷酸测序技术，其利用可以提供离子电流的通道的纳米孔。多核苷酸被驱动通过纳米孔，并且当多核苷酸通过纳米孔时，其扰动了通过纳米孔的电流。每个经过的核苷酸或一系列核苷酸产生特征电流，并且电流水平的记录对应于多核苷酸的序列。
技术实现要素：
本文公开的纳米孔测序仪的示例包括顺式孔；反式孔；流体连接顺式孔和反式孔的纳米孔；以及在顺式孔、或反式孔、或顺式孔和反式孔中的改性电解质，所述改性电解质包括电解质和阳离子络合剂。
本文公开的纳米孔测序仪的另一个示例包括顺式孔；反式孔；流体连接顺式孔和反式孔的纳米孔；以及在顺式孔、或反式孔、或顺式孔和反式孔中呈凝胶态的聚电解质。
纳米孔测序仪的又另一个示例包括顺式孔；反式孔；流体连接顺式孔和反式孔的纳米孔；与顺式孔相关联的顺式孔电极结构，所述顺式孔电极结构包括第一基部电极和固定于第一基部电极的氧化还原固体；与反式孔相关联的反式孔电极结构，所述反式孔电极结构包括第二基部电极和固定于第二基部电极的氧化还原固体；以及，电解质，其包括在第一电极结构和第二电极结构处响应于各自的氧化还原反应而被消耗或释放的阳离子。
附图说明
通过参照以下详细描述和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，其中，相似的附图标记对应于相似但可能不相同的组件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标记或特征可以结合或可以不结合出现它们的其他附图来描述。
图1是本文公开的纳米孔测序仪的示例的示意性局部截面图；
图2是本文公开的纳米孔测序仪的另一个示例的示意性局部截面图；
图3是说明本文公开的方法的两个示例的流程图，一个涉及图1的纳米孔测序仪，且另一个涉及图2的纳米孔测序仪；
图4是本文公开的纳米孔测序仪的又另一个示例的示意性局部截面图；
图5是示出涉及图4的纳米孔测序仪的本文公开的方法的又另一示例的流程图；和
图6a、6b和6c是说明对于下述而言的电流(i，pa)对电压(v)的图：a)没有添加冠醚的2个纳米孔测序仪(1，2)；b)没有添加冠醚的纳米孔测序仪(2)和在顺式孔和反式孔中均加入了冠醚和所述纳米孔测序仪(2)；以及c)没有添加冠醚的纳米孔测序仪(2)和在从顺式室灌注冠醚后的来自图6b的纳米孔测序仪(2)；
图7a是说明对于在没有添加冠醚的情况下通过单个耻垢分枝杆菌孔蛋白a(mspa)孔的发夹易位的离子电流(pa)对时间(ms)的图；
图7b是图7a中呈现的数据的直方图(计数对振幅)；
图8a是说明对于在添加了冠醚的情况下通过单个mspa孔中的发夹易位的离子电流(pa)对时间(ms)的图；和
图8b是图8a中呈现的数据的直方图(计数对振幅)。
发明简介
在第一方面中，纳米孔测序仪包含顺式孔；反式孔；流体连接顺式孔和反式孔的纳米孔；以及在顺式孔、或反式孔、或顺式孔和反式孔中的改性电解质，所述改性电解质包括电解质和阳离子络合剂。
在该第一方面的一个示例中，所述改性电解质在顺式孔中，所述纳米孔测序仪在反式孔中还包含未改性电解质，并且所述未改性电解质包括不具有阳离子络合剂的电解质；或者所述改性电解质在反式孔中，所述纳米孔测序仪在顺式孔中还包含未改性电解质，所述未改性电解质包括不具有阳离子络合剂的电解质。
在该第一方面的另一个示例中，纳米孔测序仪进一步包括在基材中限定的多个反式孔，其每一个孔通过相应的纳米孔流体连接到顺式孔，其中多个反式孔的密度是约10个反式孔/mm2基材至约1,000,000个反式孔/mm2基材。
在该第一方面的又另一个示例中，电解质包括钾阳离子和相关的阴离子、钠阳离子和相关的阴离子、或它们的组合；且阳离子络合剂选自冠醚、杯芳烃(calixarene)、和缬氨霉素。
在该第一方面的又一个示例中，改性电解质包括大于0mm至约500mm的阳离子络合剂。
要理解的是，纳米孔测序仪的该第一方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或构型组合在一起。
在第二方面中，纳米孔测序仪包含顺式孔；反式孔；流体连接顺式孔和反式孔的纳米孔；以及在顺式孔、或反式孔、或顺式孔和反式孔中呈凝胶态的聚电解质。
在该第二方面的一个示例中，聚电解质在顺式孔中，并且纳米孔测序仪进一步在反式孔中包含电解质；或聚电解质在反式孔中，并且纳米孔测序仪进一步在顺式孔中包含电解质。在一个示例中，所述聚电解质选自：聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚亚乙基亚胺的离子形式、线性聚亚乙基亚胺的离子形式、聚(烯丙胺盐酸盐)、和聚(4-乙烯基吡啶)的离子形式；且电解质包括钾阳离子和相关的阴离子、钠阴离子和相关的阴离子、或它们的组合。
在该第二方面的另一个示例中，纳米孔测序仪进一步包括在基材中限定的多个反式孔，其每一个孔通过相应的纳米孔流体连接到顺式孔，其中多个反式孔的密度是约10个反式孔/mm2基材至约1,000,000个反式孔/mm2基材。
在该第二方面的又一个示例中，聚电解质存在于顺式孔和反式孔中；且所述聚电解质选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚亚乙基亚胺的离子形式、线性聚亚乙基亚胺的离子形式、聚(烯丙胺盐酸盐)、和聚(4-乙烯基吡啶)的离子形式。
要理解的是，纳米孔测序仪的第二方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，要理解的是，可以使用纳米孔测序仪的第一方面和/或纳米孔测序仪的第二方面的特征的任意组合，和/或可以将来自这些方面中的一个或两个的任意特征与本文公开的任一示例组合。
在第三方面中，纳米孔测序仪包含顺式孔；反式孔；流体连接顺式孔和反式孔的纳米孔；与顺式孔相关联的顺式孔电极结构，所述顺式孔电极结构包括第一基部电极和固定于第一基部电极的氧化还原固体；与反式孔相关联的反式孔电极结构，所述反式孔电极结构包括第二基部电极和固定于第二基部电极的氧化还原固体；以及，电解质，其包括在顺式电极结构和反式电极结构处响应于各自的氧化还原反应而被消耗或释放的阳离子。
在该第三方面的示例中，氧化还原固体选自四氰基对苯二醌二甲烷(tcnq)、普鲁士蓝和聚吡咯。
在该第三方面的另一个示例中，第一基部电极和第二基部电极独立地选自石墨、铂、金、银、铜、碳纤维、金刚石和钯。
要理解的是，纳米孔测序仪的第三方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，要理解的是，可以使用纳米孔测序仪的第三方面和/或纳米孔测序仪的第二方面和/或纳米孔测序仪的第一方面的特征的任意组合，和/或可以将来自这些方面中的一个或两个的任意特征与本文公开的任一示例组合。
在第四方面中，使用根据第一方面的纳米孔测序仪的方法包括：通过在纳米孔测序仪的顺式孔和纳米孔测序仪的反式孔之间施加约-1v至约1v的电压偏置，从而控制纳米孔测序仪中电解质的氧化还原反应物的耗尽。
在该第四方面的一个示例中，该方法进一步包括对所述纳米孔测序仪：在顺式孔中提供改性电解质，且在反式孔中提供不具有阳离子络合剂的电解质；或者，在反式孔中提供改性电解质，且在顺式孔中提供不具有阳离子络合剂的电解质。
在该第四方面的另一个示例中，该方法还包括：将阳离子络合剂掺入电解质中以形成改性电解质；和，将改性电解质引入顺式孔、或反式孔、或顺式孔和反式孔中。
在该第四方面的又一个示例中，电解质包括钾阳离子和相关的阴离子、钠阴离子和相关的阴离子、或它们的组合；且阳离子络合剂选自冠醚、杯芳烃、和缬氨霉素。
要理解的是，方法的第四方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，要理解的是，可以使用方法的第四方面和/或纳米孔测序仪的第三方面和/或纳米孔测序仪的第二方面和/或纳米孔测序仪的第一方面的特征的任意组合，和/或可以将来自这些方面中的一个或两个的任意特征与本文公开的任一示例组合。
在第五方面中，使用根据第二方面的纳米孔测序仪的方法包括：通过在纳米孔测序仪的顺式孔和纳米孔测序仪的反式孔之间施加约-1v至约1v的电压偏置，从而控制纳米孔测序仪中聚电解质的氧化还原反应物的耗尽。
要理解的是，方法的第五方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，要理解的是，可以使用方法的第五方面和/或方法的第四方面和/或纳米孔测序仪的第三方面和/或纳米孔测序仪的第二方面和/或纳米孔测序仪的第一方面的特征的任意组合，和/或可以将来自这些方面中的一个或两个的任意特征与本文公开的任一示例组合。
在第六方面中，使用根据第三方面的纳米孔测序仪的方法包括通过下述方式控制纳米孔测序仪中电解质的氧化还原反应物的耗尽：对顺式孔电极结构施加第一电压，由此引发消耗纳米孔测序仪中电解质的阳离子的阴极反应；和，对反式孔电极结构施加第二电压，由此引发释放电解质的阳离子的阳极反应。
在第六方面的示例中，氧化还原固体选自四氰基对苯二醌二甲烷(tcnq)、普鲁士蓝和聚吡咯。
要理解的是，方法的第六方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，要理解的是，可以使用方法的第六方面和/或方法的第五方面和/或方法的第四方面和/或纳米孔测序仪的第三方面和/或纳米孔测序仪的第二方面和/或纳米孔测序仪的第一方面的特征的任意组合，和/或可以将来自这些方面中的一个或两个的任意特征与本文公开的任一示例组合。
详细描述
纳米孔测序仪技术使用电流的变化来区分核苷酸碱基。在纳米孔测序仪中，一种电解质氧化还原反应物可能会在反式孔(或室)电极上部分消耗，以支撑通过系统的法拉第电流。部分消耗的电解质氧化还原反应物可能无法有效地补充到相应的顺式孔电极上，这部分是由于离子通过一个或多个纳米孔的迁移抑制。例如，由于镀覆，氯阴离子可能在反式侧部分耗尽，而可能无法在顺式侧完全补充。两种电解质氧化还原反应物(例如，阳离子和阴离子)均会形成浓度梯度，并且在反式侧部分耗尽的试剂的低得多的浓度下建立新的平衡。电解质氧化还原反应物通过纳米孔传输相对于反式电极上一种试剂的部分消耗的失衡会导致电流漂移，这可能会不利地影响区分核苷酸碱基的能力。
电解质氧化还原反应物的部分消耗取决于几个因素，包括电解质氧化还原反应物的起始浓度、通过纳米孔的电流、以及反式室的尺寸(例如，较大的室通常与较少的试剂消耗相关，且较小的室通常与较多的试剂消耗相关)。
部分消耗可以通过初始试剂浓度的降低来证明，其中该降低大于10倍系数。在某些情况下，该降低为20倍系数至100倍系数。例如，具有在10μm反式孔中初始氯化物浓度为约300mm的电解质的氯化物浓度可能被耗尽至约10mm，因此初始浓度降低约30倍系数。又例如，具有在10μm反式孔中初始氯化物浓度为约10mm的电解质的氯化物浓度可能被耗尽至约0.1mm，因此初始浓度降低约100倍系数。要理解的是，部分消耗/耗尽可以接近100％(即系统中剩余的电解质氧化还原反应物接近0％)，但即使在这样的部分消耗试剂的低水平下，电解质氧化还原反应物之间也会建立平衡。
本文公开的纳米孔测序仪和方法的示例有效地降低一种或多种电解质氧化还原反应物在测序仪的一个或多个反式孔(或室)电极处的局部消耗或耗尽。在本文的示例中公开，初始试剂浓度的减少仍然可能发生，但是减少量少于10％、且可能少于1％。像这样，随时间经过存在更多的试剂(例如，与以上提供的示例相比)，因此减少了试剂的消耗或耗尽。一些示例通过减轻电化学被动物种(例如，电解质阳离子)通过测序仪的一个或多个纳米孔的扩散来减少部分电解质氧化还原反应物的消耗/耗尽。在一些示例中，电化学被动物种是电解质阳离子。减轻阳离子的扩散能够使电荷仅被电解质的阴离子负载。通过仅使用阴离子作为电荷载体(与电荷同时被阴离子和阳离子负载相对)，可以至少减少阴离子供应与阴离子消耗之间的任何电荷失衡。其结果是，也减少了纳米孔测序仪的一个或多个反式孔中的阴离子消耗。其它示例至少通过并入电极系统来减少电解质阴离子消耗/损耗，所述电极系统不消耗阴离子，而是在一个电极生成电解质阴离子、并在另一个电极消耗相同的电解质阴离子。
如上所述，纳米孔测序仪技术使用电流变化来区分核苷酸碱基。电解质物种的耗尽导致电流的耗尽(或不希望的偏移)，这有害地影响了获得核苷酸碱基的准确电流读数的能力。通过使离子物种通过纳米孔的传输与该物种在反式电极处的消耗达到平衡，可以减轻电流漂移，并且可以增加电解质、顺式电极和顺式孔的寿命。
要理解的是，除非另外说明，否则本文中使用的术语将具有相关领域中的普通含义。下面列出本文中使用的几个术语及其含义。
所述的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另有明确规定。
术语包含、包括、含有以及这些术语的各种形式是彼此同义的，并且含义等同地宽泛。此外，除非有相反的明确说明，否则包含、包括或具有一个或多个具备特定特性的元素的示例可以包括其他元素，无论该其他元素是否具有该特性。
如本文使用的，术语“流体连接”、“流体连通”、“流体耦合”等是指两个空间区域连接在一起，使得液体或气体可以在两个空间区域之间之间流动。例如，一个顺式孔可以流体连接到一个或多个反式孔，使得电解质的至少一部分可以自由地在连接的孔之间流动。两个空间区域可以通过纳米孔、或通过用于控制或调解通过系统的流体流量的一个或多个阀、节流器或其他流体部件流体连通。
如本文使用的，术语“间隙区域”是指基材/固体支撑物或膜中的区块(area)，或表面上的与支撑物或膜或表面相关的其他区块、区域、特征分开的区块。例如，膜的间隙区域可以将阵列的一个纳米孔与阵列的另一纳米孔分开。又例如，基材的间隙区域可以将一个反式孔与另一个反式孔分开。彼此分开的两个区域可以是离散的，即彼此之间没有物理接触。在许多示例中，间隙区域是连续的，而区块是离散的，例如对于在其他连续的膜中限定的多个纳米孔，或对于在其他连续的支撑体中限定的多个孔。由间隙区域提供的分隔可以是部分分隔或完全分隔。间隙区域可以具有与在表面中限定的特征的表面材料不同的表面材料。例如，在间隙区域处的表面材料可以是脂质材料，并且在脂质材料中形成的纳米孔的多肽的量或浓度可以大于在间隙区域处存在的量或浓度。在一些示例中，在间隙区域处可能不存在多肽。
如本文使用的，术语“膜”是指将其中可以包含相同组成或不同组成的两个液体/凝胶室(例如，顺式孔和反式孔)分开的非渗透性或半渗透性的屏障或其他片材。膜对任何给定物种的渗透性取决于膜的性质。在一些示例中，该膜可以是对离子、电流、和/或流体是非渗透性的。例如，脂质膜可以对离子是非渗透性的(即，不允许任何离子传输通过)，但对水可以至少部分渗透性的(例如，水扩散率为约40μm/s至约100μm/s)。又例如，诸如氮化硅的固态膜可以是对离子、电荷和流体非渗透性的(即，所有这些物质的扩散为零)。根据本公开，可以使用任何膜，只要该膜可以包括跨膜纳米孔开口并且可以保持跨膜电势差即可。该膜可以是单层或多层膜。多层膜包括数层，每层是非渗透性或半渗透性的材料。
膜可以由生物或非生物来源的材料形成。生物来源的材料是指源自或分离自诸如生物体或细胞之类的生物环境的材料，或生物可利用结构的合成制造版本。
由生物来源的材料制成的示例性膜包括由勃拉脂质(bolalipid)形成的单层。由生物来源的材料制成的另一示例膜包括脂质双层。合适的脂质双层包括例如细胞膜、细胞器的膜、脂质体、平面脂质双层和负载的脂质双层。脂质双层可以例如由两个相反的磷脂层形成，它们被布置成其疏水性尾基彼此相对以形成疏水内部，而脂质的亲水性头基在双层的每一侧朝外朝向水性环境。脂质双层也可以例如通过以下方法形成：其中脂质单层负载在水溶液/空气界面上经过垂直于该界面的孔的任一侧。通常通过首先将脂质溶解在有机溶剂中，然后在孔的任一侧上在水溶液的表面上蒸发一滴溶剂，从而将脂质添加到电解质水溶液的表面。一旦有机溶剂至少部分地蒸发，则在孔的任一侧上的溶液/空气界面物理地经过孔上下移动，直到形成双层。双层形成的其他合适方法包括尖端浸渍、涂漆双层、和脂质体双层的膜片钳。也可以使用任何其他获得或产生脂质双层的方法。
非生物来源的材料也可以用作膜。这些材料中的一些是固态材料，并且可形成固态膜，以及这些材料中的其他可形成薄的液体薄膜或膜。固态膜可以是单层，例如在支撑基材(即，固体支撑物)上的涂层或膜，或者是独立式元件。固态膜也可以是夹心构造中的多层材料的络合物。可以使用任何非生物来源的材料，只要所得膜可以包括跨膜纳米孔开口并且可以保持跨膜电势差即可。膜可包括有机材料、无机材料或两者。合适的示例的固态材料包括例如微电子材料、绝缘材料(例如，氮化硅(si3n4)、氧化铝(al2o3)、和氧化硅(sio))、一些有机和无机聚合物(例如聚酰胺、塑料诸如聚四氟乙烯(ptfe)、或弹性体诸如双组分加成固化硅橡胶)、和玻璃。此外，固态膜可以由紧密堆积成二维蜂窝晶格的碳原子的原子级薄片的单层石墨烯、多层石墨烯、或与一层或多层其他固态材料混合的一层或多层石墨烯制成。含石墨烯的固态膜可以包括至少一个作为石墨烯纳米带或石墨烯纳米间隙的石墨烯层，其可以被用作电传感器来表征目标多核苷酸。固态膜可以通过任何合适的方法制成。作为示例，可以通过化学气相沉积(cvd)或从石墨上剥离来制备石墨烯膜。可以使用的合适的薄的液体薄膜材料的示例包括二嵌段共聚物、三嵌段共聚物，诸如两亲性pmoxa-pdms-pmoxaaba三嵌段共聚物。
如本文使用的，术语“纳米孔”意指从膜中分离并延伸穿过膜的中空结构，其允许离子、电流、和/或流体从膜的一侧穿过至膜的另一侧。例如，抑制了离子或水溶性分子的通道的膜可包括延伸穿过膜的纳米孔结构，其允许离子或水溶性分子从膜的一侧穿过至膜的另一侧。纳米孔的直径可沿其长度(即，从膜的一侧至膜的另一侧)变化，但在任何点是纳米级(即，约1nm至约100nm)。纳米孔的示例包括例如生物纳米孔、固态纳米孔、以及生物和固态杂化纳米孔。
如本文使用的，术语“生物纳米孔”意指其结构部分由生物来源的材料制成的纳米孔。生物来源是指衍生自或分离自生物环境、诸如生物体或细胞的材料，或生物可用的结构的合成制造版本。生物纳米孔包括例如多肽纳米孔和多核苷酸纳米孔。
如本文使用的，术语“多肽纳米孔”旨在意指延伸穿过膜、并允许离子、电流、和/或流体从膜的一侧流动到膜的另一侧的多肽。多肽纳米孔可以是单体、均聚物、或杂聚物。多肽纳米孔的结构包括例如α-螺旋束纳米孔和β-桶纳米孔。示例多肽纳米孔包括α-溶血素、耻垢分枝杆菌孔蛋白a(mspa)、短杆菌肽a、麦芽糖孔蛋白、ompf、ompc、phoe、tsx、f-菌毛等。耻垢分枝杆菌孔蛋白a(mspa)是由分枝杆菌产生的膜孔蛋白，其允许亲水性分子进入细菌。mspa形成紧密相连的八聚体和跨膜β-桶，类似于酒杯并包含中央通道/孔。
多肽纳米孔可以是合成的。合成的多肽纳米孔包括自然界中不存在的蛋白样氨基酸序列。蛋白质样氨基酸序列可以包括一些已知存在但不形成蛋白质基础的氨基酸(即非蛋白原性氨基酸)。蛋白质样氨基酸序列可以人工合成，而不是在生物体中表达，然后进行纯化/分离。
如本文使用的，术语“多核苷酸纳米孔”旨在包括延伸穿过膜、并允许离子、电流、和/或流体从膜的一侧流动到膜的另一侧的多核苷酸。多核苷酸孔可包括例如多核苷酸折纸(例如dna的纳米级折叠以产生纳米孔)。
另外如本文使用的，术语“固态纳米孔”旨在意指其结构部分包括非生物来源的(即，不是生物来源的)材料的纳米孔。固态纳米孔可以由无机或有机材料形成。固态纳米孔包括例如氮化硅纳米孔、二氧化硅(sio2)纳米孔、和石墨烯纳米孔。
本文公开的纳米孔可以是杂化纳米孔。“杂化纳米孔”是指包括生物来源和非生物来源的材料的纳米孔。杂化纳米孔的一个示例包括多肽-固态杂化纳米孔、和多核苷酸-固态纳米孔。
如本文使用的，术语“纳米孔测序仪”是指可用于纳米孔测序的本文公开的任一装置。在本文公开的示例中，在纳米孔测序期间，将纳米孔浸入本文公开的一个或多个电解质示例中，并且跨膜施加势能差。在一个示例中，势能差是电势差或电化学势能差。电势差可以经由电压源而跨膜赋予，所述电压源将电流注入或给予包含在顺式孔或者一个或多个反式孔中的电解质的至少一种离子。电化学势能差可以通过顺式孔和反式孔的离子组成的差异与电势的组合来建立。不同的离子组成可以是例如每个孔中不同的离子、或每个孔中的相同离子的不同浓度。
跨纳米孔施加势能差可迫使核酸通过纳米孔易位。生成一个或多个信号，其对应于核苷酸通过纳米孔的易位。因此，由于目标多核苷酸、或者作为衍生从目标多核苷酸或单核苷酸的单核苷酸活探针转移通过纳米孔，因此跨膜的电流例如由于碱基依赖性(或探针依赖性)的缩窄阻塞而发生变化。可以使用各种方法中的任何一种来测量来自电流变化的信号。每个信号对于纳米孔中的一个或多个核苷酸(或探针)的物种而言是独特的，使得所得到的信号可以被用于确定多核苷酸的特性。例如，可以确定产生特征信号的一种或多种核苷酸(或探针)的确认。
如本文使用的，“核苷酸”包括含氮的杂环碱基、糖和一个或多个磷酸酯基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。核苷酸的示例包括例如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在核糖核苷酸(rna)中，糖是核糖，而在脱氧核糖核苷酸(dna)中，糖是脱氧核糖，即缺少存在于核糖的2'位的羟基的糖。含氮杂环碱基可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)、及其改性的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)、及其改性的衍生物或类似物。脱氧核糖的c-1原子与嘧啶的n-1或嘌呤的n-9键合。磷酸酯基团可以呈单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯形式。这些核苷酸是天然的核苷酸，但要进一步理解的是，也可以使用非天然核苷酸、改性核苷酸或前述核苷酸的类似物。
如本文使用的，术语“信号”旨在意指代表信息的标识。信号包括例如电信号和光信号。术语“电信号”是指表示信息的电质量的标识。标识可以是例如电流、电压、隧穿、电阻、电势、电压、电导或横向电效应。“电流(electroniccurrent)”或“电流(electriccurrent)”是指电荷的流动。在一个示例中，电信号可以是通过纳米孔的电流，并且当跨纳米孔施加电势差时电流可以流动。
术语“基材”是指不溶于水性液体并且在不存在孔、端口或其他类似液体导管的情况下液体无法通过的刚性固体支撑物。在本文公开的示例中，基材可具有在其中限定的孔或室。合适的基材的示例包括玻璃和改性或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯、以及苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(ptfe)(例如来自chemours的
本文使用术语顶部、底部、下部、上部、上面等来描述纳米孔测序仪和/或纳米孔测序仪的各种组件。要理解的是，这些方向性术语并不意味着暗指特定的取向，而是用于指定部件之间的相对取向。方向性术语的使用不应解释为将本文公开的示例限制为任何的一个或多个特定方向。
在本文中使用的术语“孔”和“室”同义使用，并且是指在测序仪中限定的离散特征，其可以容纳流体(例如，液体、凝胶、气体)。“顺式孔”是包含顺式电极或由顺式电极部分限定的共用室，并且还通过各自的纳米孔流体连接到多个反式孔中的每一个。测序仪可以具有一个顺式孔或多个顺式孔。每个“反式孔”是一个单独的室，其包含其自己的反式电极或由其自己的反式电极部分限定，并且还与一个顺式孔流体连接。每个反式孔彼此电隔离，并且各个反式电极连接到各个放大器(例如，axopatch200b放大器)，以放大通过与每个反式孔相关的各个纳米孔的电信号。孔的取平行于基材表面的至少部分地限定所述孔的截面可以是弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角等
鉴于以上定义，可以理解本文中阐述和权利要求中陈述的方面和示例。
参照图1，描绘了纳米孔测序仪10的一个示例。纳米孔测序仪10包括顺式孔14、反式孔16、流体连接顺式孔14和反式孔16的纳米孔18、以及顺式孔14、或反式孔16、或顺式孔和反式孔14,16中的改性电解质20。在改性电解质20处于顺式孔14或反式孔16中的一者的示例中，未改性电解质22可以存在于反式孔16或顺式孔14中的另一者中。
如图1所示，基材12可包括限定在其中的多个反式孔16。每个反式孔16可通过各个纳米孔18而流体连接到共用顺式孔14。虽然图1中示出一个共用顺式孔14，但要理解的是，测序仪10可以包括若干个顺式孔14，其彼此流体隔离，并流体连接到基材12中限定的各组反式孔16。例如，可能需要多个顺式孔14，以能够在单个基材12上测量多个样品。
通过一个或多个纳米孔18的流体连通由图1中的箭头指示。另外，如图1所示，膜24可以被定位在顺式孔14和一个或多个反式孔16之间的基材12上，并且一个或多个纳米孔18可以被定位在膜24中并延伸穿过膜24，以建立顺式孔14和一个或多个反式孔16之间的流体连接。
顺式孔14是流体室，其通过与基材12连接的一个或多个侧壁13而定义在基材12的一部分上。在一些示例中，一个或多个侧壁13和基材12可以一体地形成，使得这些13,12由连续的一块材料(例如，玻璃或塑料)形成。在其他示例中，一个或多个侧壁13和基材12可以是彼此耦合的单独组件。在一个示例中，一个或多个侧壁是可光图案化的聚合物。
在图1所示的示例中，顺式孔14具有通过一个或多个13限定的内壁26,26'、通过顺式电极30限定的上表面28、和通过膜24限定的下表面28'。因此，顺式孔14形成在通过顺式电极30、基材12的一部分和膜24限定的空间内。要理解的是，下表面28'具有通过被定位在膜24中的一个或多个纳米孔18的一个或多个开口。顺式孔14可以具有任何合适的尺寸。在一个示例中，顺式孔14为约1mm×1mm至约5mm×5mm。
内表面是顺式孔14的上表面28的顺式电极30可以被物理地连接到一个或多个侧壁13。顺式电极30可以例如通过粘合剂或另一种合适的紧固机构而被物理地连接到一个或多个侧壁13。顺式电极30与一个或多个侧壁13之间的界面可以密封顺式孔14的上部。
所使用的顺式电极30至少部分取决于改性电解质20中的氧化还原对。作为示例，顺式电极30可以是金(au)、铂(pt)、碳(c)(例如，石墨、金刚石等)、钯(pd)、银(ag)、铜(cu)等。在一个示例中，顺式电极30可以是银/氯化银(ag/agcl)电极。
顺式孔14能够维持的改性电解质20或未改性电解质22与一个或多个纳米孔18接触。在一个示例中，顺式孔14与纳米孔18的阵列接触，因此能够保持改性电极20或未改性电解质22与阵列中的每个纳米孔18接触。
如图1所示，纳米孔测序仪10包括多个反式孔16。每个反式孔16是在基材12的一部分中限定的流体室。通常，反式孔16可延伸穿过基材12的厚度，并且可在基材12的相对端(例如，顶端38和底端40)具有开口。在图1所示的示例中，每个反式孔16具有通过基材12和/或基材12的间隙区域32限定的侧壁31,31'、通过反式电极34限定的下表面36、和通过膜24限定的上表面36'。因此，每个反式孔16形成在通过反式电极34、基材12的其他部分和/或间隙区域32、以及膜24限定的空间内。要理解的是，上表面36'具有通过被定位在膜24中的一个或多个纳米孔18的一个或多个开口。
内表面是反式孔16的下表面36的反式电极34可以被物理地连接到基材12(例如，间隙区域32或基材12的内壁)。反式电极34可以在形成基材12的过程中(例如，在形成反式孔16期间)制造。可用于形成基材12和反式电极34的微细加工技术包括光刻，金属沉积和剥离、干燥和/或旋涂膜沉积、蚀刻等。反式电极34与基材12之间的界面可以密封反式孔16的下部。
所使用的反式电极34至少部分取决于改性电解质20中的氧化还原对。作为示例，反式电极34可以是金(au)、铂(pt)、碳(c)(例如，石墨、金刚石等)、钯(pd)、银(ag)、铜(cu)等。在一个示例中，反式电极34可以是银/氯化银(ag/agcl)电极。
可以设想反式孔16的许多不同布局，包括规则的、重复的和非规则图案。在一个示例中，反式孔16布置在六边形网格中以紧密堆积并提高密度。其他布局可以包括例如直线(即，矩形)布局、三角形布局等。作为示例，布局或图案可以是呈行和列的反式孔16的x-y格式。在一些其他示例中，布局或图案可以是反式孔16和/或间隙区域32的重复布置。在又另外的示例中，布局或图案可以是反式孔16和/或间隙区域32的随机布置。图案可以包括点、柱、条纹、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、格子、格纹、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。
布局可以相对于反式孔16的密度(即，在限定的基材12的面积中的反式孔16数量)来表征。例如，反式孔16可以以约10孔/mm2至约1,000,000孔/mm2的密度存在。所述密度可以被调整为不同的密度，包括例如至少约10/mm2、约5,000/mm2、约10,000/mm2、约10万/mm2或更多的密度。替代地或附加地，密度可以被调整为不超过约1,000,000孔/mm2、约10万/mm2、约10,000/mm2、约5,000/mm2或更小。还要理解的是，支撑物12中的反式孔16的密度可以在选自上述范围的下限值之一和上限值之一之间。
布局还可以或者替代地根据平均间距来表征，即从纳米孔18的中心到相邻纳米孔18的中心的间隔(中心至中心的间隔)。图案可以是规则的，使得平均间距附近的变异系数小，或者图案可以是不规则的，在这种情况下，变异系数可以相对大。在一个示例中，平均间距可以为约100nm至约500μm。平均间距可以是例如至少约100nm、约5μm、约10μm、约100μm或更多。替代地或附加地，平均间距可以是例如最多约500μm、约100μm、约50μm、约10μm、约5μm或更小。包括纳米孔18的特定图案的一个示例阵列的平均间距可以在选自上述范围的下限值之一和上限值之一之间。在一个示例中，阵列可以具有约10μm的平均间距(中心至中心的间隔)。
反式孔16可以是微孔(具有至少一个微米量级的尺寸，例如约1μm最多到但不包括1000μm)、或纳米孔(具有至少一个纳米量级的尺寸，例如约10nm最多到但不包括1000nm)。每个孔16可以通过其长径比(例如，在该示例中是宽度或直径除以深度或高度)来表征。
在一个示例中，每个反式孔16的长径比可以为约1:1至约1:5。在另一个示例中，每个反式孔16的长径比可以为约1:10至约1:50。在一个示例中，反式孔16的长径比为约3.3。
可以选择深度/高度和宽度/直径，以获得期望的长径比。每个反式孔16的深度/高度可以是至少约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。替代地或附加地，深度可以是最多约1,000μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.1μm或更小。每个反式孔16的宽度/直径可以是至少约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约10μm、约100μm，或更多。替代地或附加地，宽度/直径可以为至多约1,000μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm、约50nm或更低。
每个反式孔16具有足够大以容纳膜24的至少一部分和与其相关的纳米孔18的开口(例如，面向顺式孔14)。例如，纳米孔18的一端可以延伸穿过膜24并进入反式孔16的开口中。
顺式孔14和反式孔16可使用多种技术制造，包括例如光刻、纳米压印光刻、冲压工艺、压花工艺、铸模技术、微蚀刻技术等。如本领域技术人员将理解的，所使用的技术将取决于支撑物12和一个或多个侧壁13的组成和形状。在一个示例中，顺式孔14可以通过在支撑物12的端部38处的一个或多个侧壁13限定，并且反式孔16可以通过支撑物12限定。
膜24可以是本文描述的任何的非渗透性或半渗透性的材料。膜24被定位在顺式孔14与反式孔16之间，因此在孔14,16之间提供屏障。膜可以被定位于基材12的间隙区域32上。
一个或多个纳米孔18可以是本文描述的生物纳米孔、固态纳米孔和杂化纳米孔中的任一者。如本文所述，每个纳米孔18将反式孔16中的相应一个流体连接到顺式孔14。像这样，纳米孔18与反式孔16的比率为1:1。
纳米孔18具有两个开口端、和连接两个开口端的中空芯或洞。当插入膜24中时，纳米孔18的开口端中的一个面向顺式孔14，并且纳米孔18的开口端中的另一个面向反式孔16并与反式孔16的开口中的至少一部分对准。纳米孔18的中空芯能够使孔14,16之间流体连接。中空芯的直径可以为约1nm最多至1μm，并且可以沿着纳米孔18的长度而变化。在一些示例中，面向顺式孔14的开口端可以大于面向反式孔16的开口端。在其他示例中，面向顺式孔14的开口端可以小于面向反式孔16的开口端。
一个或多个纳米孔18可以插入到膜24中，或者可以在一个或多个纳米孔18周围形成膜24。在一个示例中，纳米孔18可以将自身插入到所形成的脂质双层(膜24的一个示例)中。例如，呈其单分子形式或聚合形式(例如，八聚体)的纳米孔18可将其自身插入脂质双层中并组装成跨膜孔。在另一个示例中，纳米孔18可以在期望的浓度下，在其将自身插入到脂质双层的位置被添加到脂质双层的接地侧(groundedside)。在又一个示例中，脂质双层可以跨聚四氟乙烯(ptfe)膜中的孔形成，并且被定位在顺式与反式孔之间。纳米孔可以被添加到所述接地顺式隔室，且可以将自身在形成ptfe孔的区块处插入到脂质双层中。在又一个示例中，纳米孔18可以被束缚到固体支撑物(例如，硅、氧化硅、石英、氧化铟锡、金、聚合物等)。束缚分子可以是纳米孔18自身的一部分，或者可以连接到纳米孔18，可以将纳米孔18连接到固体支撑物。经由束缚分子的附接可以使得单个孔18被固定(例如，在两个室/孔之间)。然后可以在纳米孔18周围形成脂质双层。
如上所述，纳米孔测序仪10的一些示例在顺式孔14和反式孔16中都包括改性电解质20。在其他示例中，改性电解质20在反式孔16或顺式孔14中。像这样，图1所示的纳米测序仪10也可以包括两种电解质，即改性电解质20和未改性电解质22。
改性电解质20包括电解质和阳离子络合剂。电解质可以是任何能够分解成抗衡离子(阳离子及其相关的阴离子)的电解质。作为示例，电解质可以是任何能分解成钾阳离子(k )或钠阳离子(na )的电解质。这种类型的电解质包括钾阳离子和相关的阴离子、或钠阳离子和相关的阴离子、或它们的组合。含钾电解质的示例包括氯化钾(kcl)、铁氰化钾(k3[fe(cn)6]·3h2o或k4[fe(cn)6]·3h2o)或其他含钾电解质(例如，碳酸氢盐(khco3)或磷酸盐(例如，kh2po4、k2hpo4、k3po4))。含钠电解质的示例包括氯化钠(nacl)或其他含钠电解质，例如碳酸氢钠(nahco3)、磷酸钠(例如nah2po4、na2hpo4或na3po4)。作为另一个示例，电解质可以是任何能够分解成含钌阳离子的电解质(例如，六胺合钌，诸如[ru(nh3)6]2 或[ru(nh3)6]3 )。还可以使用能够分解成锂阳离子(li )、铷阳离子(rb )、镁阳离子(mg )、或钙阳离子(ca )的电解质。
在改性电解质20中使用的阳离子络合剂取决于所用电解质的阳离子。阳离子络合剂被包括以络合电解质的阳离子，因此选择阳离子络合剂的中心腔的直径以匹配阳离子的尺寸。“匹配”是指阳离子可以装配在中心腔内，并且阳离子络合剂的原子可以与阳离子络合。
合适的阳离子络合剂的示例包括冠醚、杯芳烃和缬氨霉素。合适的冠醚的示例包括：
匹配阳离子和阳离子络合剂的示例示于表1。
表1
改性电解质20中阳离子络合剂的量可以变化，至少部分取决于络合剂对阳离子的亲和力。考虑到该亲和力，可以以将导致至少99％的可用阳离子络合的任何合适量使用阳离子络合剂。通常，阳离子络合剂的摩尔浓度可以大于0mm至约1m。在一个示例中，可以以约50mm至约500mm的摩尔浓度在含钾电解质中使用18-冠-6。在一个更具体的示例中，可以以约300mm的摩尔浓度在含钾电解质中使用18-冠-6。在另一个示例中，杯芳烃可以以大于0mm至约20mm的摩尔浓度用于含钾或含钠电解质中。所使用的任何浓度可以取决于阳离子络合剂在电解质中的溶解度。
未改性电解质22包括与改性电解质20相同的电解质，但是不含阳离子络合剂。像这样，未改性电解质不包括阳离子络合剂。
当改性电解质20被引入顺式孔14和反式孔16中时，不使用未改性电解质22。当改性电解质20被引入顺式孔14中时，未改性电解质可被引入反式孔16中。当未改性电解质22被引入顺式孔14中时，改性电解质可被引入反式孔16中。
无论改性电解质20被引入孔14和/或16中，要理解的是，阳离子络合剂将络合该孔14和/或16内的可用电解质阳离子，因此将使得阳离子太蓬松而不会从该孔14和/或16中通过一个或多个纳米孔18易位出来。一个或多个被络合的阳离子的直径接近等于(例如，约5％之内)或大于一个或多个纳米孔18的开口端中的至少一个。例如，k 和18-冠-6的络合物的直径为约1.15nm，且mspa纳米孔的中空中心直径(在其最小截面处)为约1.2nm。被络合的阳离子将不能装配通过一个或多个纳米孔18，因此在纳米孔测序仪10的操作期间，阳离子通过一个或多个纳米孔18的传输将被抑制。通过限制阳离子的传输，电解质的阴离子将被迫补偿离子电流差，从而至少减少了在反式电极34处的阴离子供应与阴离子消耗之间的失衡。
现参照图3，说明利用纳米孔测序仪10,10'(其中后者示于图2)的示例的方法100,100'的示例。方法100的示例涉及纳米孔测序仪10，其包括附图标记102和104。如在附图标记102所示，方法100涉及：通过在纳米孔测序仪10的顺式孔14和纳米孔测序仪10的反式孔16之间施加约-1v至约1v的电压偏置，从而控制纳米孔测序仪10中电解质的氧化还原反应物的耗尽，并且如附图标记104所示，包括电解质和阳离子络合剂的改性电解质20存在于顺式孔14、或反式孔16、或顺式孔和反式孔14,16中。施加的偏置可取决于改性电解质20的位置，例如当与未改性电解质22组合使用时。在给定范围内的任何电压偏置可以在改性电解质20存在于每个孔14,16时被施加。这是由于下述事实：离子运动是单向的，因此当施加特定偏置时，位于膜24的一侧上被络合的离子不会影响电流传输。例如，当施加负电压偏置时，反式孔16中的被络合的离子不影响电流传输。
在一个示例中，阳离子(例如，k )与冠醚的络合通过以约2x(2倍)的系数降低流过的电流，从而减轻通过纳米孔的阳离子传输。电流流动的降低可以为约1x至约3x。
在一些示例中，方法100还可以包括对纳米孔测序仪10：在顺式孔14和反式孔16中的每一者中提供改性电解质20。在其他示例中，方法100还可以包括对纳米孔测序仪10：在顺式孔14或反式孔中的一者中提供改性电解质20，且在顺式孔14或反式孔中的另一者中提供不具有阳离子络合剂的电解质(即未改性电解质22)。
方法100还可以包括将阳离子络合剂掺入电解质中以形成改性电解质20，将改性电解质20引入顺式孔14或反式孔16中的一者中，并且将不具有阳离子络合剂的电解质(即未改性电解质22)引入顺式孔14或反式孔中的另一者中。如本文所述，阳离子络合剂的浓度可以变化，至少部分取决于络合剂对阳离子的亲和力。
方法100可以在纳米孔测序操作期间执行。施加跨纳米孔18的电势(即，由顺式电极和反式电极30,34作为电流源而提供的偏置)强迫核苷酸通过纳米孔18易位，同时阴离子携带电荷。取决于偏置，核苷酸可从顺式孔14传输至反式孔16，或从反式孔16传输至顺式孔14。当核苷酸穿过纳米孔18时，跨屏障的电流会由于例如碱基依赖性的缩窄阻塞而发生变化。来自该电流变化的信号可以使用放大器或其他已知的信号检测设备进行测量。
电压的范围可以选自约-1v至最高约1v。典型地施加电压极性，使得带负电荷的核酸被电泳驱动到纳米孔18中。在某些情况下，可以降低电压或反转极性以促进适当的功能。
现参照图2，说明了纳米孔测序仪10'的另一个示例。纳米孔测序仪10'包括顺式孔14、反式孔16、流体连接顺式孔14和反式孔16的纳米孔18、以及在顺式孔14、或反式孔16、或顺式孔和反式孔14,16中的聚电解质42。在聚电解质42在顺式孔14或反式孔16中的一者中的示例中，电解质44可以存在于反式孔16或顺式孔14中的另一者中。
如图2所示，基材12可包括限定在其中的多个反式孔16，并且可以连接到至少部分限定顺式孔14的一个或多个13。每个反式孔16可通过各个纳米孔18而流体连接到共用顺式孔14。虽然图2中示出一个共用顺式孔14，但要理解的是，测序仪10'可以包括若干个顺式孔14，其彼此流体隔离，并流体连接到基材12中限定的各组反式孔16。例如，可能需要多个顺式孔14，以能够在单个基材12上测量多个样品。
通过一个或多个纳米孔18的流体连通由图2中的箭头指示。另外，如图2所示，膜24可以被定位在顺式孔14和一个或多个反式孔16之间的基材12上，并且一个或多个纳米孔18可以被定位在膜24中并延伸穿过膜24，以建立顺式孔14和一个或多个反式孔16之间的流体连接。
纳米孔测序仪10'的顺式孔14和反式孔16可以以与本文针对纳米孔测序仪10所述的相同方式和相同构造(例如，尺寸、布局等)来限定。另外，顺式电极30和一个或多个反式电极34可以分别被物理地连接到一个或多个侧壁13和基材12，并且可以分别限定顺式孔14的上表面28和一个或多个反式孔16的下表面36。
在纳米孔测序仪10'中，顺式孔14能够维持电解质44或聚电解质42与一个或多个纳米孔18接触。在一个示例中，顺式孔14与纳米孔18的阵列接触，因此能够保持电解质44或聚电解质42与阵列中的每个纳米孔18接触。同样在纳米孔测序仪10'中，每个反式孔16具有足够大以容纳膜24的至少一部分和与其相关的纳米孔18的开口(例如，面向顺式孔14)。例如，纳米孔18的一端可以延伸穿过膜24并进入反式孔16的开口中。
本文所述的任意膜24和纳米孔18均可用于纳米孔测序仪10'。
如上所述，纳米孔测序仪10'的一些示例在顺式孔14和反式孔16中都包括聚电解质42。在其他示例中，聚电解质42在反式孔16或顺式孔14中。像这样，图2所示的纳米孔测序仪10'也可以包括两种电解质，即聚电解质42和电解质42。在图2的示例中，聚电解质42存在于反式孔16中，并且聚电解质42或电解质44存在于顺式孔14中。
聚电解质42是呈凝胶态的带电聚合物，其由于相反电荷的离子的耦合而可以传导电流。在本文公开的示例中，聚电解质42具有带正电的骨架，其与带负电的离子(即，阴离子)耦合。由于阳离子是聚电解质42的骨架的一部分，因此它们可能不易从该孔16或14易位出并穿过一个或多个纳米孔18。合适的聚电解质42的示例选自聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)、聚亚乙基亚胺(pei)的离子形式，线性聚亚乙基亚胺(lpei)、聚烯丙胺盐酸盐(pah)的离子形式、和聚(4-乙烯基吡啶)(p4vp)的离子形式。一些示例结构如下所示：
在这些示例中，线性聚亚乙基亚胺(lpei)中的-nh2 配位到cl-，且聚(4-乙烯基吡啶)(p4vp)中的-nh 配位到cl-(即，聚(4-乙烯基吡啶盐酸盐))。聚(4-乙烯基吡啶)(p4vp)的离子形式的另一个示例是聚(4-乙烯基吡啶)甲基氯，其中聚(4-乙烯基吡啶)中的-n ch3配位到cl-。可以使用除氯以外的阴离子，这取决于要在孔14、16中的另一者中使用的电解质44以及在反式电极34上的电化学反应的性质。期望在反式侧上保持电解质平衡，因此由反式电极34消耗或产生的离子应与聚电解质42匹配。
尽管聚电解质42不能像游离电解质一样容易地通过纳米孔18平移，但是已经显示出纳米孔18使带电的聚合物(例如，聚乙二醇(peg)、dna)易位。因此，非线性聚电解质42可用于进一步阻止聚电解质42通过孔18的易位。例如，支链pei、或聚电解质42与具有可交联基团的单体的共聚物。
当包含在一个或多个反式孔16中时，聚电解质42也能够改善膜24(例如，脂质双层)的机械支撑和结构稳定性。
当被包括时，电解质42可以是任何能够分解成抗衡离子(阳离子及其相关的阴离子)的电解质。作为示例，电解质可以是能够分解成钾阳离子(k )或钠阳离子(na )的任何电解质。这种类型的电解质包括钾阳离子和相关的阴离子、或钠阳离子和相关的阴离子、或它们的组合。含钾电解质的示例包括氯化钾(kcl)、铁氰化钾(k3[fe(cn)6]·3h2o或k4[fe(cn)6]·3h2o)或其他含钾电解质(例如，碳酸氢盐(khco3)或磷酸盐(例如，kh2po4、k2hpo4、k3po4))。含钠电解质的示例包括氯化钠(nacl)或其他含钠电解质，例如碳酸氢钠(nahco3)或磷酸钠(例如，nah2po4、na2hpo4、na3po4)。作为另一个示例，电解质可为任何电解质即能够分解成含钌阳离子的电解质(例如，六胺合钌，诸如[ru(nh3)6]2 或[ru(nh3)6]3 )。还可以使用能够分解成锂阳离子(li )、铷阳离子(rb )、镁阳离子(mg )、或钙阳离子(ca )的电解质。
在纳米孔测序仪10'的一个示例中，聚电解质42存在于顺式孔和反式孔14,16两者中，并且聚电解质42选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚亚乙基亚胺的离子形式、线性聚亚乙基亚胺的离子形式、聚烯丙胺盐酸盐、和聚(4-乙烯基吡啶)的离子形式。
在纳米孔测序仪10'的另一个示例中，聚电解质42选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚亚乙基亚胺的离子形式、线性聚亚乙基亚胺的离子形式、聚(烯丙胺盐酸盐)、和聚(4-乙烯基吡啶)的离子形式；并且电解质42包括钾阳离子和相关的阴离子、或钠阳离子和相关的阴离子、或它们的组合。
再次参照图3，涉及纳米孔测序仪10'的方法100'的示例包括附图标记102和106。如附图标记102所示，方法100'涉及：通过在纳米孔测序仪10'的顺式孔14和纳米孔测序仪10'的反式孔16之间施加约-1v至约1v的电压偏置，从而控制纳米孔测序仪10'中电解质的氧化还原反应物的耗尽，并且如附图标记106所示，聚电解质42存在于顺式孔14、或反式孔16、或顺式孔和反式孔14,16中。可以施加任何偏置，以在反式侧上保持电解质平衡。
在一些示例中，方法100'可以包括对纳米孔测序仪10'：在顺式孔14和反式孔16中的每一者中提供呈凝胶态的聚电解质42。在其他示例中，方法100'还可以包括对纳米孔测序仪10'：在顺式孔14或反式孔16中的一者中提供呈凝胶态的聚电解质42，且在反式孔16或顺式孔14中的另一者中提供电解质44。
方法100'还可以包括将聚电解质42(呈凝胶态)引入顺式孔14、或一个或多个反式孔16、或顺式孔和反式孔14,16中。当聚电解质42在孔14或16中的一者中时，方法100'可以包括将电解质44引入反式16或顺式孔14的另一者中。
方法100'可以在纳米孔测序操作期间执行。施加跨纳米孔18的电势(即，由顺式电极和反式电极30,34作为电流源而提供的偏置)强迫核苷酸通过纳米孔18易位，同时阴离子携带电荷。取决于偏置，核苷酸可从顺式孔14传输至反式孔16，或从反式孔16传输至顺式孔14。当核苷酸穿过纳米孔18时，跨屏障的电流会由于例如碱基依赖性的缩窄阻塞而发生变化。来自该电流变化的信号可以使用放大器或其他已知的信号检测设备进行测量。
电压的范围可以选自约-1v至最高约1v。典型地施加电压极性，使得带负电荷的核酸被电泳驱动到纳米孔18中。在某些情况下，可以降低电压或反转极性以促进适当的功能。
现参照图4，说明了纳米孔测序仪10”的又一个示例。纳米孔测序仪10”包括顺式孔14'；反式孔16'；流体连接顺式孔14'和反式孔16'的纳米孔18；与顺式孔14'相关联的顺式孔电极结构47(所述顺式孔电极结构47包括第一基部电极30'和固定于第一基部电极30'的氧化还原固体48)；与反式孔16'相关联的反式孔电极结构50(所述反式孔电极结构50包括第二基部电极34'和固定于第二基部电极34'的氧化还原固体48)；以及，电解质46，其包括在第一电极结构47和第二电极结构50处响应于各自的氧化还原反应而被消耗或释放的阳离子。
如图4所示，基材12可以包括在其中限定的多个反式孔16'。每个反式孔16'可通过各个纳米孔18而流体连接到共用顺式孔14'。虽然图4中示出一个共用顺式孔14'，但要理解的是，测序仪10”可以包括若干个顺式孔14'，其彼此流体隔离，并流体连接到基材12中限定的各组反式孔16'。例如，可能需要多个顺式孔14'，以能够在单个基材12上测量多个样品。
通过一个或多个纳米孔18的流体连通由图4中的箭头指示。另外，如图4所示，膜24可以被定位在顺式孔14'和一个或多个反式孔16'之间，并且一个或多个纳米孔18可以被定位在膜24中并延伸穿过膜24，以建立顺式孔14和一个或多个反式孔16之间的流体连接。
纳米孔测序仪10'的顺式孔14'和反式孔16'可以以与本文针对纳米孔测序仪10的顺式孔14和反式孔16所述的相同构造(例如，尺寸、布局等)来限定。
在该示例中，顺式孔14'具有通过一个或多个侧壁13'限定的内壁26,26'、通过顺式孔电极结构47的氧化还原固体48限定的上表面28、和通过膜24限定的下表面28'。因此，顺式孔14'形成在通过顺式孔电极结构47的氧化还原固体48、一个或多个侧壁13'和侧壁24限定的空间内。
顺式电极结构47可以被物理地连接到一个或多个侧壁13'。顺式电极结构47可以例如通过粘合剂或另一种合适的紧固机构而被物理地连接到一个或多个侧壁13'。顺式电极结构47与一个或多个侧壁13'之间的界面可以密封顺式孔14'的上部。
如上所述，顺式孔电极结构47包括第一基部电极30'和固定于第一基部电极30'的氧化还原固体48。第一基部电极30'可以包括选自以下的材料，或者在某些情况下由其组成：石墨、铂、金、银、铜、碳纤维、金刚石和钯。氧化还原固体48可选自四氰基对苯二醌二甲烷(tcnq)、普鲁士蓝(其可用作例如葡萄糖传感器中的固态电极)和聚吡咯。
如图4所示，纳米孔测序仪10”包括多个反式孔16'。每个反式孔16'具有足够大以容纳膜24的至少一部分和与其相关的纳米孔18的开口(例如，面向顺式孔14')。例如，纳米孔18的一端可以延伸穿过膜24并进入反式孔16'的开口中。
每个反式孔16'是在基材12中限定的流体室。在图4所示的示例中，每个反式孔16'具有通过基材12和/或基材12间隙区域32限定的侧壁31,31'、通过反式孔电极结构50的氧化还原固体48限定的下表面36、和通过膜24限定的上表面36'。因此，每个反式孔16'形成在通过反式孔电极结构50的氧化还原固体48、基材12的其他部分和/或间隙区域32、以及膜24限定的空间内。要理解的是，上表面36'具有通过被定位在膜24中的一个或多个纳米孔18的一个或多个开口。
反式电极结构50可以被物理地连接到基材12，并且可以在形成基材12的过程中(例如，反式孔16'的形成期间)制造。可用于形成基材12和反式电极34'的微细加工技术包括光刻、金属沉积和剥离、干膜和/或旋涂膜沉积、蚀刻等。反式孔电极结构50和基材12之间的界面可以密封反式孔16'的下部。
如上所述，反式孔电极结构50包括第二基部电极34'和固定于第二基部电极34'的氧化还原固体48。第二基部电极34'上的氧化还原固体48与固定于第一基部电极30'上的氧化还原固体48为相同类型。像这样，第二基部电极34'上的氧化还原固体48可以选自四氰基对苯二醌二甲烷(tcnq)、普鲁士蓝和聚吡咯。基材电极34'可以是与基材电极30'相同的材料或不同类型的材料。像这样，第二基部电极34'可以包括选自以下的材料，或者在某些情况下由其组成：石墨、铂、金、银、铜、碳纤维、金刚石和钯。
氧化还原固体48可以使用任何合适的化学或电化学沉积方法沉积在相应的基部电极30',34'上。作为一个示例，普鲁士蓝可以由含有铁离子(fe3 )和铁氰化物离子(fe3 (cn)6]3-)的混合物的水溶液，在开路区域自发沉积，或通过施加还原性电化学驱动力而沉积。
氧化还原固体48的厚度可以为约10nm至约10μm。例如，tcnq氧化还原固体可以是约100nm至5μm的厚膜。尽管已经提供了若干厚度范围，但要理解的是，厚度可以部分地取决于沉积工艺的给定极限，以及期望的一定量的氧化还原固体以维持长期测序仪操作。
本文所述的任意膜24和纳米孔18中均可用于纳米孔测序仪10”。
纳米孔测序仪10”的电解质46可以是为电解质44提供的任意示例。简而言之，电解质46可以是任何能够分解成抗衡离子(阳离子和其相关联的阴离子的)的电解质，其中阳离子还能够被基部电极30',34'上的氧化还原固体48释放和消耗。在一些情况下，电解质46是电解质44之一的水溶液。在纳米孔测序仪10”的该示例中，电解质46存在于顺式孔14'和一个或多个反式孔16'中。像这样，顺式孔14'和一个或多个反式孔16'能够保持电解质46与一个或多个纳米孔18接触。
氧化还原固体48在电解质46中是氧化还原活性的，其在水不会击穿的势能窗口中在顺式孔14'和反式孔16'中使用。本文公开的氧化还原固体48的示例在相对低的势能(例如，-1至1v)下引起氧化还原反应。氧化还原固体48(当暴露于负电势时)可经历消耗的电解质46的阳离子的阴极反应(例如，下述式1)，并且(当暴露于正电势时)可经历释放阳离子到电解质46的阳极反应(例如，下述式2)。作为一个示例，涉及具有固定于各自的基极电极30',34'的氧化还原tcnq固体的电极结构47,50的氧化还原反应包括：
tcnq(固体) e- k (水溶液)→(k tcnq-)(固体)(式1)
(k tcnq-)(固体)→tcnq(固体) e- k (水溶液)(式2)。
这些反应可以通过施加适当的势能来诱导，使得阳离子(例如，k )在一个或多个反式孔16'中被释放，并在顺式孔14'中被消耗。这将消除一个或多个反式孔16'中的阴离子耗尽。
现参照图5，涉及纳米孔测序仪10”的方法200的示例包括通过下述方式控制纳米孔测序仪10”中电解质46的氧化还原反应物的耗尽：对顺式孔电极结构47施加第一电压，由此引发消耗纳米孔测序仪10”中的电解质46的阳离子的阴极反应(如附图标记202所示)；和，对反式孔电极结构50施加第二电压，由此引发释放电解质46的阳离子的阳极反应。
方法200还可以包括对纳米孔测序仪10”：在顺式孔14'和反式孔16'中的每一者中提供电极结构47,50和电解质46。方法200还可包括将电解质46引入顺式孔14'和反式孔16'中的每一者中。
方法200可以在纳米孔测序操作期间执行。施加跨纳米孔18的电势(即，由第一电极结构和第二电极结构47,50作为电流源而提供的预定偏置)强迫核苷酸通过纳米孔18易位，同时阳离子和/或阴离子携带电荷。取决于偏置，核苷酸可从顺式孔14'传输至反式孔16'，或从反式孔16'传输至顺式孔14'。当核苷酸穿过纳米孔18时，跨屏障的电流会由于例如碱基依赖性的缩窄阻塞而发生变化。来自该电流变化的信号可以使用放大器或其他已知的信号检测设备进行测量。
电压的范围可以选自约-1v至最高约1.5v。在一个示例中，用于操作使用tcnq作为氧化还原固体48的测序仪10”的合适的电压范围为约0.4v至约1.2v。这对应于在第一基部电极和第二基部电极30',34'之间施加的电压差。可以施加电压极性，使得带负电荷的核酸被电泳驱动到纳米孔18中。在某些情况下，可以降低电压或反转极性以促进适当的功能。
为了进一步说明本公开，本文中给出实施例。要理解的是，这些实施例仅为说明性目的而提供，并且不被解释为限制本公开的范围。
非限制性工作实施例
实施例1
准备具有单个顺式孔和单个反式孔的两个纳米孔测序仪(分别在本文中称为“1”或“孔1”和“2”或“孔2”)。将没有加入任何冠醚的氯化钾引入测序仪1,2的顺式孔和反式孔中。每个纳米孔测序仪1,2在脂质双层膜中包括mspa纳米孔，所述脂质双层膜被定位于顺式孔和反式孔之间。
跨每个纳米孔测序仪1,2中的每个纳米孔施加各种电压电位，并测量电流。结果显示在图6a中。当反向偏置时，纳米孔测序仪1(孔1)显示出不对称响应，称为“门控”；并且纳米孔测序仪2(孔2)显示出对称响应。
从纳米孔测序仪2的顺式孔和反式孔两者灌注氯化钾。将冠醚18-冠-6以400mm加入氯化钾，并且该电解质引入纳米孔测序仪2的顺式孔和反式孔中。跨纳米孔测序仪2中的纳米孔施加各种电压电位，并测量电流。结果示于图6b。图6b还显示了来自图6a的纳米孔测序仪2的结果(没有冠醚)用于对比。当添加冠醚时，纳米孔测序仪2在正向和反向偏置方向上均显示出对电流的抑制。在负偏置和正偏置两者下的电导减少证实了18-冠-6阻碍k 通过纳米孔的mspa传输。该结果表明，k 离子与冠醚的络合通过将电流流动降低了预期的2倍系数而阻碍了k 离子通过纳米孔的传输。
然后从纳米孔测序仪2的顺式孔灌注氯化钾与冠醚。由于顺式孔和反式孔被脂质层分离，加入有冠醚的氯化钾留在纳米孔测序仪2的反式孔中。跨纳米孔测序仪2中的纳米孔施加各种电压电位，并测量电流。结果以标为“孔2-灌注”的线示于图6c。图6c还显示了来自图6a的纳米孔测序仪2的结果(没有冠醚)用于对比。灌注冠醚后的纳米孔测序仪2的iv曲线(图6c中标为“孔2-灌注”的线)几乎返回到标准状态(图6c中标记为“孔2”的线)。在反向偏置下，在电流传输上观察到一些残留效应，这与被捕捉在反式孔中的少量冠醚保持一致。
实施例2
在易位实验中使用具有87个核苷酸碱基的发夹结构且熔化温度为66℃的低聚物。使用了两个纳米孔测序仪。每个具有单个顺式孔和单个反式孔、以及被定位在顺式孔与反式孔之间的脂质双层膜中的mspa纳米孔。
在对比测序仪中，将没有加入任何冠醚的氯化钾引入顺式孔和反式孔中。在实施例测序仪中，将添加了400mm18-冠6的氯化钾引入顺式孔和反式孔中。相应的低聚物通过对比测序仪和实施例测序仪易位。
对比测序仪的离子电流对时间的结果显示在图7a中，结果的直方图显示在图7b中。对于对比测序仪，开孔电流为107.5pa，且中间阻塞电流为73.5pa(68％)。据信，图7a中20pa至50pa之间的读数对应于深度阻塞，其中发夹dna低聚物解压缩，并且在易位中存在停滞。在直方图中，据信在70到80的振幅之间观察到这种深层阻塞。
实施例测序仪的离子电流对时间的结果示于图8a，结果的直方图示于图8b。对于实施例测序仪，开孔电流为88.5pa，且中间阻塞电流为57.5pa(65％)。如图8a所示，在20pa至50pa之间的读数数量减少。据信，k 离子的络合使dna更加容易解压缩，从而减少深度阻塞。在图8b中，观察到在70到80的振幅之间没有信号，这也证明深度阻塞被减少或消除的理解。
总的来说，实施例测序仪的电流水平偏移与k 离子对通过纳米孔的传导的贡献减少相一致。据信，这反过来会降低cl-离子耗尽。
附加条款
要理解的是，前述概念和下面更详细讨论的附加概念的所有组合(只要这样的概念不相互矛盾)被认为是本文公开的发明主题的一部分。特别地，出现在本公开的结尾处的要求保护的主题的所有组合被认为是本文公开的发明主题的一部分。还应理解，本文明确采用的且也可能出现在通过引用并入的任何公开中的术语应被赋予与本文公开的特定概念最一致的含义。
在整个说明书中对“一个示例”，“另一个示例”，“示例”等指代是指结合该示例描述的特定元件(例如，特征、结构和/或特性)被包括在本文所描述的至少一个示例中，并且在其他示例中可以存在或不存在。另外，要理解的是，除非上下文另外明确指出，否则在各种示例中，可以以任何适当的方式来组合用于任何示例的所述元件。
要理解的是，本文提供的范围包括所述范围以及在所述范围内的任何值或子范围。例如，约50mm至约500mm的范围应被解释为不仅包括明确列举约50mm至约500mm的限值，而且还包括个体值，例如约100mm、约335mm、约400.5mm、约490mm等，以及子范围，例如约75mm至约475mm、约200mm至约300mm等。此外，当“约”和/或“基本上”用于描述一个值时，意味着涵盖所述值的微小变化(最大 /-10％)。
尽管已经详细描述了若干示例，但要理解的是，可以修改所公开的示例。因此，前述描述应被认为是非限制性的。
1.一种纳米孔测序仪，其包括：
顺式孔；
反式孔；
流体连接顺式孔和反式孔的纳米孔；和
在顺式孔、或反式孔、或顺式孔和反式孔中的改性电解质，所述改性电解质包括电解质和阳离子络合剂。
2.根据权利要求1所述的纳米孔测序仪，其中：
所述改性电解质在顺式孔中，所述纳米孔测序仪在反式孔中还包含未改性电解质，并且所述未改性电解质包括不具有阳离子络合剂的电解质；或者
所述改性电解质在反式孔中，所述纳米孔测序仪在顺式孔中还包含未改性电解质，所述未改性电解质包括不具有阳离子络合剂的电解质。
3.根据权利要求1所述的纳米孔测序仪，其进一步包括在基材中限定的多个反式孔，其每一个孔通过相应的纳米孔流体连接到顺式孔，其中多个反式孔的密度是约10个反式孔/mm2基材至约1,000,000个反式孔/mm2基材。
4.根据权利要求1所述的纳米孔测序仪，其中：
电解质包括钾阳离子和相关的阴离子、钠阳离子和相关的阴离子、或它们的组合；且
阳离子络合剂选自冠醚、杯芳烃、和缬氨霉素。
5.根据权利要求1所述的纳米孔测序仪，其中，改性电解质包括大于0mm至约500mm的阳离子络合剂。
6.一种使用权利要求1的纳米孔测序仪的方法，所述方法包括：
通过在纳米孔测序仪的顺式孔和纳米孔测序仪的反式孔之间施加约-1v至约1v的电压偏置，从而控制纳米孔测序仪中电解质的氧化还原反应物的耗尽。
7.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括对所述纳米孔测序仪：
在顺式孔中提供改性电解质，且在反式孔中提供不具有阳离子络合剂的电解质；或者
在反式孔中提供改性电解质，且在顺式孔中提供不具有阳离子络合剂的电解质。
8.根据权利要求6所述的方法，其还包括：
将阳离子络合剂掺入电解质中以形成改性电解质；和
将改性电解质引入顺式孔、或反式孔、或顺式孔和反式孔中。
9.根据权利要求6所述的方法，其中：
电解质包括钾阳离子和相关的阴离子、钠阴离子和相关的阴离子、或它们的组合；且
阳离子络合剂选自冠醚、杯芳烃、和缬氨霉素。
10.一种纳米孔测序仪，其包含：
顺式孔；
反式孔；
流体连接顺式孔和反式孔的纳米孔；以及
在顺式孔、或反式孔、或顺式孔和反式孔中呈凝胶态的聚电解质。
11.根据权利要求10所述的纳米孔测序仪，其中：
聚电解质在顺式孔中，并且纳米孔测序仪进一步在反式孔中包含电解质；或
聚电解质在反式孔中，并且纳米孔测序仪进一步在顺式孔中包含电解质。
12.根据权利要求11所述的纳米孔测序仪，其中：
聚电解质选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚亚乙基亚胺的离子形式、线性聚亚乙基亚胺的离子形式、聚(烯丙胺盐酸盐)、和聚(4-乙烯基吡啶)的离子形式；且
电解质包括钾阳离子和相关的阴离子、钠阴离子和相关的阴离子、或它们的组合。
13.根据权利要求10所述的纳米孔测序仪，其进一步包括在基材中限定的多个反式孔，其每一个孔通过相应的纳米孔流体连接到顺式孔，其中多个反式孔的密度是约10个反式孔/mm2基材至约1,000,000个反式孔/mm2基材。
14.根据权利要求10所述的纳米孔测序仪，其中：
聚电解质存在于顺式孔和反式孔中；且
聚电解质选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚亚乙基亚胺的离子形式、线性聚亚乙基亚胺的离子形式、聚(烯丙胺盐酸盐)、和聚(4-乙烯基吡啶)的离子形式。
15.一种使用权利要求10的纳米孔测序仪的方法，其包括：
通过在纳米孔测序仪的顺式孔和纳米孔测序仪的反式孔之间施加约-1v至约1v的电压偏置，从而控制纳米孔测序仪中电解质的氧化还原反应物的耗尽。
16.一种纳米孔测序仪，其包含：
顺式孔；
反式孔；
流体连接顺式孔和反式孔的纳米孔；
与顺式孔相关联的顺式孔电极结构，所述顺式孔电极结构包括第一基部电极和固定于第一基部电极的氧化还原固体；
与反式孔相关联的反式孔电极结构，所述反式孔电极结构包括第二基部电极和固定于第二基部电极的氧化还原固体；以及
电解质，其包括在顺式电极结构和反式电极结构处响应于各自的氧化还原反应而被消耗或释放的阳离子。
17.根据权利要求16所述的纳米孔测序仪，其中，氧化还原固体选自四氰基对苯二醌二甲烷(tcnq)、普鲁士蓝和聚吡咯。
18.根据权利要求16所述的纳米孔测序仪，其中，第一基部电极和第二基部电极独立地选自石墨、铂、金、银、铜、碳纤维、金刚石和钯。
19.一种使用权利要求16的纳米孔测序仪的方法，其包括通过下述方式控制纳米孔测序仪中电解质的氧化还原反应物的耗尽：
对顺式孔电极结构施加第一电压，由此引发消耗纳米孔测序仪中电解质的阳离子的阴极反应；和
对反式孔电极结构施加第二电压，由此引发释放电解质的阳离子的阳极反应。
20.根据权利要求19所述的方法，其中氧化还原固体选自四氰基对苯二醌二甲烷(tcnq)、普鲁士蓝和聚吡咯。
技术总结