本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法。
背景技术：
甘蔗是世界上重要的糖料经济作物和能源植物，甘蔗属包含细茎野生种、大茎野生种、热带种、印度种、中国种和肉质花穗种(亦称食穗种)6个种，甘蔗亚族中的斑茅、滇蔗茅和河八王等均为甘蔗的近缘植物。现代甘蔗品种大多含甘蔗属中2～3种的亲缘，遗传基础较狭窄，种性退化严重，为了培育新的优良的甘蔗品种，育种家进行了种内、种间及属间的杂交利用。期望能把野生种及近缘植物的抗性基因导入到甘蔗中，从而丰富甘蔗的遗传基础。在甘蔗种质资源分类、外源染色体的鉴定、基因的染色体定位、亲缘关系鉴定和减数分裂机理等研究中，都涉及到染色体的研究。
甘蔗染色体制片的准备，是开展甘蔗细胞遗传学、甘蔗分子细胞遗传学以及基于染色体等相关研究的基础。然而，甘蔗是最复杂的异多倍体植物，染色体数目多(范围64～128)，形态小，难于获得理想的分裂相中期细胞染色体玻片标本。目前，国内外主要采用甘蔗根尖分生区组织进行制片，但在实际操作过程中还存在以下一些问题：水培甘蔗根尖有粘稠的分泌物，影响染色体制片效果。桶栽或沙培根尖无粘稠分泌物影响，但采集时需清洗泥沙，操作较繁琐；甘蔗根细小，主根少须根多，分生区组织区域很小，一般要用1～2条根尖才能制备1个玻片标本；桶栽、沙培或水培甘蔗根尖受营养环境因素影响较大，根尖粗细、老嫩程度不一，分裂周期难于把握，1批根尖样品中往往仅有少数几条根尖处在有丝分裂时期；不能保证每张制片都能观察到分裂相中期细胞，需要重复采集根尖和重复制片观察，这导致工作量加大；试验和实验周期均较长，一般1个材料的染色体数目鉴定耗时约需1～2个星期。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，可以快速获得制片背景干净，染色体形态结构清晰，分散良好的分裂相中期细胞，便于染色体数目统计和核型分析。
本发明提供了一种高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，包括以下步骤：
1)采集生长旺盛的甘蔗或其近缘种的茎尖分生区组织切成0.3～0.5cm3的小块状，用预冷的ddh2o灭菌水浸泡，在4℃条件下预处理5～24h，得到预处理材料；
2)将所述预处理材料进行固定，固定条件为4℃，固定时间为2～3d，用ddh2o灭菌水清洗后，用解离液在50～65℃水浴条件下解离20～25min，得到解离材料；
所述解离液为1mol/lhcl溶液和体积百分浓度45％乙酸水溶液等体积混合形成的混合液；
3)将所述解离材料转移至载玻片上，去除表面水分后，用改良苯酚卡宝品红染色液染色，夹碎所述解离材料，去除组织残渣，盖上盖玻片，染色4～8min，去除所述盖玻片周围染色液，压片，制得染色体分散的玻片标本。
优选的，步骤1)中所述茎尖分生区组织包括甘蔗茎尖基部分生区组织和/或包裹茎尖的2～3层幼叶分生区组织，所述包裹茎尖的2～3层幼叶分生区组织为距离茎尖往上3cm内的幼叶分生区组织。
优选的，步骤1)中所述生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织的采集时期包括在甘蔗拔节期、伸长时期或伸长后期。
优选的，步骤1)中所述生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织的采集时间为晴天的上午9:00～11:00。
优选的，步骤2)中所述固定用固定液为卡诺固定液；
所述卡诺固定液为无水乙醇和冰醋酸按照体积比为3：1的比例混合而成。
优选的，步骤3)中所述压片的方法为用带有橡皮的铅笔的一端敲击所述盖玻片，使染色体分散，然后用大拇指压所述盖玻片，使细胞平整分散，染色体处在同一平面上。
优选的，所述甘蔗的品种包括拔地拉、57ng208、闽糖70-611、rb72-454、f1崖城96-48或bc2云蔗07-86。
优选的，所述甘蔗近缘种包括甘蔗野生种和甘蔗近缘属植物；
所述甘蔗野生种包括割手密和大茎野生种；所述甘蔗近缘属植物包括斑茅、芒、滇蔗茅和河八王。
本发明提供了所述甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法制备得到的甘蔗染色体分散的玻片标本，染色体形态结构清晰，分散不重叠的分裂相中期细胞，背景干净无杂质。
本发明提供所述甘蔗或甘蔗近缘种染色体分散的玻片标本在甘蔗或甘蔗近缘种的染色体核型分析或种质资源分类鉴定及保护利用中的应用。
本发明提供的高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，与现有技术相比，取得以下有益效果为：
1)在材料选取中，选择生长旺盛时期甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织进行制片，具有分生区组织范围大，细胞分裂周期集中，单个茎尖可以批量制备染色体玻片标本30～50张，而且每张制片上都可以观察到较多的分裂中期细胞，一般10张制片之内可以观察到便于染色体数目鉴定和核型分析的细胞20个以上，与根尖需观察50～100张制片相比，节省了制片时间和显微观察时间。
2)甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织样品具有方便采集的特点，甘蔗生长周期长(1～1.5年)，除苗期和分蘖期外，处在拔节、伸长时期及后期生长旺盛时期的甘蔗茎尖均适宜进行染色体玻片标本制备。一年约有7～8个月时间，可随时到田间采集甘蔗茎尖进行相关细胞学研究，与根尖和茎段萌动芽染色体制片技术相比，无需重复采样，避免了根尖重复采集清洗的繁琐步骤，减轻了工作量，提高了工作效率。
3)使用4℃条件下预处理甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织，有利于同步积累分裂相中期细胞，通过压片观察，可以在短时间内获得染色体形态结构清晰，分散良好的分裂相中期细胞，便于观察，2天内可完成1个甘蔗种质材料的染色体数目鉴定，与根尖和茎段萌动芽需1～2周时间相比，缩短了实验周期，提高了甘蔗染色体基因组分析的效率。
4)采用解离液进行解离20～25min，细胞易分散，染色体清晰、重叠少，解离时间过短(10～15min)细胞较难分散，染色体重叠较多，解离时间过长(30min及以上)，易造成细胞破碎，染色体丢失或重叠较多。
5)染色时间控制在4～8min，能够保证整体染色程度适中，不会产生染色不到位或染色过度情况。
本发明提供的方法简便、鉴定结果准确可靠、重复性好、稳定性好、易于操作。没有经过细胞学训练的人员采用本发明方法也可以制备出良好的甘蔗染色体制片。同时，本发明提供的方法同样适用于滴片法和涂片法。本发明制备的染色体玻片标本将对甘蔗染色体核型研究、种质资源分类及保护等提供技术支持，也为甘蔗近缘种或其它作物染色体数量及核型分析方面的研究提供帮助。
附图说明
图1为甘蔗茎尖染色体制片技术方法流程图；
图2为甘蔗茎尖分生区组织样品图片；
图3为甘蔗茎尖有丝分裂相中期细胞染色体的镜检图(放大400×，物镜40×，目镜10×)；
图4为甘蔗茎尖有丝分裂相中期细胞染色体的镜检图(放大1000×，物镜100×，目镜10×)；
图5为甘蔗根尖分生区组织样品图片；
图6为甘蔗根尖分生区组织的染色体效果观察图；
图7为甘蔗茎段萌动芽组织样品图片；
图8为甘蔗茎段萌动芽组织的染色体效果观察图；
图9为采用8-羟基喹啉溶液常温处理4h的染色体效果观察图；
图10为不同染色时间的染色体效果观察图；
图11为不同解离时间的染色体效果观察图；
图12为甘蔗亲本和杂交后代种质材料染色体观察图；
图13为甘蔗野生种和近缘植物染色体观察图
图14为甘蔗茎尖分生区组织细胞图。
具体实施方式
本发明提供了一种高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，包括以下步骤：
1)采集生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织切成0.3～0.5cm3的小块状，用预冷的ddh2o灭菌水浸泡，在4℃条件下预处理5～24h，得到预处理材料；
2)将所述预处理材料进行固定，固定条件为4℃，固定时间为2～3d，用ddh2o灭菌水清洗后，用解离液在50～65℃水浴条件下解离20～25min，得到解离材料；
所述解离液为1mol/lhcl溶液和体积百分浓度45％乙酸水溶液等体积混合形成的混合液；
3)将所述解离材料转移至载玻片上，去除表面水分后，用改良苯酚卡宝品红染色液染色，夹碎所述解离材料，去除组织残渣，盖上盖玻片，染色4～8min，去除所述盖玻片周围染色液，压片，制得染色体分散的玻片标本。
本发明提供的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法的流程图见图1。本发明制片方法获得的玻片标本中，甘蔗茎尖分生区组织细胞图如图14所示，分生区组织范围大，分裂相集中，有丝分裂细胞比例较高，易于观察到研究分析所需的分裂相中期细胞染色体图片，黑色箭头指向处在分裂时期的细胞。本发明采集生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织切成0.3～0.5cm3的小块状，用预冷的ddh2o灭菌水浸泡，在4℃条件下预处理5～24h，更优选预处理12h，得到预处理材料。
本发明提供的方法适用于所有甘蔗品种和甘蔗亲缘关系较近的植物。为了说明本发明的技术方案能够制备得到染色体形态结构清晰，分散不重叠的分裂相中期细胞，背景干净无杂质的染色体玻片标本，本发明实施例以甘蔗属的品种拔地拉、57ng208、闽糖70-611、rb72-454、f1崖城96-48或bc2云蔗07-86等为例进行说明，但这不应该理解为仅适用于上述甘蔗品种。同时本发明提供的方法也适用于所有甘蔗的近缘种；甘蔗的近缘种优选包括甘蔗野生种和甘蔗的近缘属植物；本发明实施例以甘蔗野生种割手密和大茎野生种以及甘蔗的近缘属植物优选包括斑茅、芒、滇蔗茅和河八王等为例进行说明，但这不应该理解为仅适用于上述甘蔗近缘属植物的限制。
在本发明中，所述茎尖分生区组织包括甘蔗茎尖基部分生区组织和/或包裹茎尖的2～3层幼叶分生区组织，所述包裹茎尖的2～3层幼叶分生区组织为距离茎尖往上3cm内的幼叶分生区组织。没有开花的甘蔗茎尖分生区组织，分化形成幼叶分生区组织和甘蔗茎尖基部分生区组织，幼叶分生区组织基部与茎尖基部分生区组织连在一起。本发明选取甘蔗茎尖基部分生区组织和/或包裹茎尖的2～3层幼叶分生区组织进行制片，具有分生区组织范围大，细胞分裂周期集中，适合作为制备染色体分散玻片的材料。在本发明中，生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织的采集时期优选包括在甘蔗拔节期、伸长时期或伸长后期。在本发明中，生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织的采集时间优选为晴天的上午9:00～11:00，冬季时延至下午14:00～16:00。
在本发明中，所述小块状的体积优选为0.4cm3。对甘蔗茎尖分生区组织小块用预冷的ddh2o灭菌水浸泡，在4℃条件下预处理5～24h，有利于同步积累分裂相中期细胞。比用0.002mol/l8-羟基喹啉溶液常温处理4h的常规预处理方案得到的分裂相中期细胞更多，效果更佳；采用此预处理方法，可以在2天内可完成1个甘蔗种质材料的染色体数目鉴定，与根尖和茎段萌动芽需1～2周时间相比，缩短了实验周期，提高了甘蔗染色体基因组分析的效率。
得到预处理材料后，本发明将所述预处理材料进行固定，固定条件为4℃，固定时间为2～3d，用ddh2o灭菌水清洗后，用解离液在50～65℃水浴条件下解离20～25min，得到解离材料；所述解离液为1mol/lhcl溶液和体积百分浓度45％乙酸水溶液等体积混合形成的混合液。在本发明中，所述固定条件优选由冰箱提供。
在本发明中，所述固定用固定液优选为卡诺固定液；所述卡诺固定液优选为无水乙醇和冰醋酸按照体积比为3：1的比例混合而成。固定结束后即可进行制片观察，或将样品用ddh2o灭菌水漂洗两次后，每次10min，保存在70％的酒精中，4℃长期保存备用。
在本发明中，所述清洗优选进行两次，以便彻底去除固定液。所述解离优选在60℃的水浴条件下进行；所述解离的时间优选为20min。所述解离有利于使固定的材料变的松软，以便后续压片处理时细胞均匀平铺于载玻片上。
得到解离材料后，本发明将所述解离材料转移至载玻片上，去除表面水分后，用改良苯酚卡宝品红染色液染色，夹碎所述解离材料，去除组织残渣，盖上盖玻片，染色4～8min，去除所述盖玻片周围染色液，压片，制得染色体分散的玻片标本。
在本发明中，所述去除表面水分的方法优选采用吸水纸吸取解离材料表面水分，消除水分对染色效果的影响。所述改良苯酚卡宝品红染色液购自昆明云科公司。夹碎所述解离材料时动作轻柔，不要夹出气泡。夹碎解离材料比不夹碎解离材料直接敲片更利于获得染色体形态清晰，背景干净的玻片标本。
在本发明中，所述压片的方法优选为用带有橡皮的铅笔的一端敲击所述盖玻片，使染色体分散，杂质扩散，制片背景干净，然后用大拇指压所述盖玻片，使细胞平整分散，染色体处在同一平面上。
在本发明中，为了验证制得染色体分散的玻片标本的效果，优选进行镜检。所述镜检的方法优选包括先使用显微镜进行观察，先用低倍镜观察(由于甘蔗染色体较小，多用20×或40×物镜观察)，找到合适的视野和中期分裂相细胞后，转到高倍镜(100×物镜)，再用奥林巴斯cellsensstandard软件进行拍照和数目统计。选染色体形态结构清晰，分散良好的中期细胞，用蔡司metasystem自动核型分析系统进行拍照和核型分析。
本发明提供了所述甘蔗或其近缘种茎尖染色体制片方法制备得到的甘蔗染色体分散的玻片标本，染色体形态结构清晰，分散不重叠的分裂相中期细胞，背景干净无杂质。
本发明提供所述甘蔗或其近缘种染色体分散的玻片标本在甘蔗或其近缘种的染色体核型分析或种质资源分类鉴定及保护利用中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种高效的甘蔗或其近缘种茎尖染色体制片方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
甘蔗茎尖染色体制片方法
1.以甘蔗为试验材料，于晴天上午(9：00～11：00)采集田间甘蔗茎尖(形态图见图2)分生区组织切成0.3cm3的小块进行预处理。
2.预处理用预冷的ddh2o灭菌水浸泡，在4℃条件下预处理12h，然后用卡诺固定液(1冰醋酸∶3乙醇，现配)，4℃冰箱固定3天，将分生区组织放置在70％的乙醇中，4℃长期保存备用。
3.制片时，将储存好的分生区组织材料取出，用ddh2o灭菌水漂洗2次，每次10min。然后用等体积的1mol/lhcl溶液和体积浓度45％乙酸水溶液的混合液在60℃条件下水浴解离20min。用ddh2o灭菌水漂洗1次，10min。切下茎尖分生区组织放置在干净的载玻片上，加20μl改良的苯酚卡宝品红染色液，用镊子轻轻地将分生区组织夹碎，去除组织残渣，盖上盖玻片，室温染色5min。
4.染色结束后，用带有橡皮的铅笔轻轻敲片，使甘蔗分生区组织和细胞可以均匀地分散在载玻片上，使染色体分散，杂质扩散，制片背景干净。最后，用大拇指压片，使细胞平整，染色体处在同一平面上。
5.使用光学显微镜进行观察，先用低倍镜观察，找到合适的视野和分裂相中期细胞后，转到高倍镜(100×物镜)进行观察和拍照。
结果
采用甘蔗茎尖分生区组织范围大，细胞分裂周期集中，易于获得理想的分裂相中期染色体玻片标本，结果见图3和图4。由图3和图4的染色体分布可以看出，采用上述方法制备的染色体玻片标本，染色体形态结构清晰，分散不重叠的分裂相中期细胞，背景干净无杂质。并且操作简便，单个茎尖可以批量制备染色体玻片标本30～50张，而且每张制片上都可以观察到较多的分裂中期细胞，一般10张制片之内可以观察到便于染色体数目鉴定和核型分析的细胞20个以上。
对比例1
1.以甘蔗为试验材料，于晴天上午(9：00～11：00)采集桶栽甘蔗根尖(形态图见图5)0.8～1.0cm进行预处理。
2.预处理用预冷的ddh2o灭菌水浸泡，在4℃条件下预处理12h，然后用卡诺固定液(1冰醋酸∶3乙醇，现配)，4℃冰箱固定3天，将根尖放置在70％的乙醇中，4℃长期保存备用。
3.制片时，将储存好的根尖材料取出，用ddh2o灭菌水漂洗2次，每次10min。然后用等体积的1mol/lhcl溶液和体积浓度45％乙酸水溶液的混合液在60℃条件下水浴解离20min。用ddh2o灭菌水漂洗1次，10min。切下根尖分生区组织，加20μl改良的苯酚卡宝品红染色液，用镊子轻轻地将分生区组织夹碎，去除组织残渣，盖上盖玻片，室温染色5min。
4.染色结束后，用带有橡皮的铅笔轻轻敲片，使根尖组织和细胞可以均匀地分散在载玻片上，使染色体分散，杂质扩散，制片背景干净。最后，用大拇指压片，使细胞平整，染色体处在同一平面上。
5.使用光学显微镜进行观察，先用低倍镜观察，找到合适的视野和分裂相中期细胞后，转到高倍镜(100×物镜)进行观察和拍照。
结果
甘蔗从种植到可以稳定收集根尖约需6个月，过早采集导致植株弱小，后期植株很难长起来，根尖组织样品也就更不好了。采集根尖时，需清洗泥沙，操作较繁琐；甘蔗根细小，主根少须根多，分生区组织区域很小，一般要用1～2条根尖才能制备1个玻片标本；桶栽、沙培或水培甘蔗根尖受营养环境因素影响较大，根尖粗细、老嫩程度不一，分裂周期难于把握，1批根尖样品中往往仅有少数几条根尖处在有丝分裂时期；不能保证每张制片都能观察到分裂相中期细胞，需要重复采集根尖和重复制片观察，采集完甘蔗根尖后把甘蔗重新种回桶中，需等3～4个星期才能长出新根进行采集，这导致工作量加大；试验和实验周期均较长，一般1个材料的染色体数目鉴定耗时约需1～2个星期。经实验分析，根尖需制备和观察50～100张制片才能观察到染色体数目鉴定和核型分析的细胞20个以上，需要耗费大量的制片时间和显微观察时间。同时根尖作为材料制片需要重复采样，大大增加了工作量，降低了工作效率。图6是采用根尖制片的观察结果。
结论
与甘蔗根尖制片技术相比，使用甘蔗茎尖染色体制片技术方法，具有取样方便、分裂相集中、易于获得好的中期分裂相的特点。2天内可完成1个材料的染色体数目鉴定，减轻了工作人员的工作量，比根尖制片效率提高了7～8倍以上。
对比例2
以甘蔗为试验材料，于晴天上午(9：00～11：00)采集茎段沙培萌动芽(形态图见图7，其中，a为从茎段上取下来的新鲜萌动芽外观图片，b为解离过的萌动芽分生区组织图片，按照实施例1的方法制片。
结果
结果如图8所示。甘蔗茎段萌动芽分生区组织范围小，分裂相不集中。染色体制片效果不及甘蔗茎尖和根尖的制片效果。
对比例3
采用实施例1的方法进行制片，区别仅在于采用预冷的ddh2o在4℃条件下5～24h处理的步骤，替换0.002mol/l8-羟基喹啉溶液常温处理4h。本发明在4℃条件下处理甘蔗茎尖分生区组织，有利于同步积累分裂相中期细胞，通过压片观察，可以在短时间内获得染色体形态结构清晰，分散良好的分裂相中期细胞，便于观察。结果优于用0.002mol/l8-羟基喹啉溶液常温处理4h。
采用0.002mol/l8-羟基喹啉溶液常温处理4h的染色体效果观察结果见图9。染色体形态不够清晰，易产生黏粘现象，8-羟基喹啉溶液易受环境因素影响，高温对细胞和染色体产生毒害作用。
对比例4
为了检验不同染色时间对染色体制片效果的影响，本发明采用实施例1的方法进行制备，但是采用改良的苯酚卡宝品红染色液进行室温染色时，分别染色2min、5min和10min。
结果见图10。染色2min(图10中的a)时玻片中染色体颜色较浅，不方便镜检观察，染色10min(图10中的c)时，玻片中染色体颜色过深。而染色5min(图10中的b)时，染色体颜色适中。
对比例5
为了检验不同解离时间对染色体制片效果的影响，本发明采用实施例1的方法进行制备，但是采用解离液解离时，解离时间设置为10min、15min、20min、25min和30min。
结果见图11。由图11可知，解离10min和解离15min，细胞较难分散，染色体重叠较多；解离20min和解离25min，细胞易分散，染色体清晰、重叠少；解离30min，细胞易破碎，染色体丢失或重叠较多。由此可见，解离时间控制在20～25min对制备染色体玻片标本最佳。
实施例2
甘蔗亲本种及杂交后代种质染色体数目鉴定
1.以甘蔗原始亲本种拔地拉和57ng208，杂交亲本种闽糖70-611和rb72-454以及杂交后代种质f1崖城96-48和bc2云蔗07-86为试验材料，于晴天上午9：00～11：00采集甘蔗茎尖分生区组织进行预处理。
2.将分生区组织放入青霉素瓶中，预处理用预冷的ddh2o灭菌水浸泡，在4℃条件下预处理20h，用现配卡诺固定液(冰醋酸：乙醇＝1:3)，4℃冰箱固定2～3天，将分生区组织放置在70％的乙醇中，4℃长期保存备用。
3.取出储存好的分生区组织材料，用ddh2o灭菌水漂洗2次，每次10min。然后用等体积的1mol/lhcl溶液和体积百分浓度45％乙酸水溶液混合液，60℃水浴，解离22min。用ddh2o灭菌水漂洗1次，10min。切下甘蔗茎尖分生区组织放置在干净的载玻片上，加20μl改良的苯酚卡宝品红染色液，用镊子轻轻地将分生区组织铗碎，去除组织残渣，盖上盖玻片，室温染色5min。
4.染色结束后，用带有橡皮的铅笔轻轻敲片，使甘蔗分生区组织和细胞均匀地分散在载玻片上，使染色体分散，杂质扩散，制片背景干净。最后，用大拇指压片，使细胞平整，染色体处在同一平面上。
5.使用光学显微镜进行观察，先用低倍镜观察(甘蔗染色体很小，一般用20×或40×物镜)，找到合适的视野和分裂相中期细胞后，转到高倍镜(100×物镜)进行观察和拍照。
6.结果利用本发明可以获得好的的分裂相中期细胞图片，染色体形态结构清晰、分散良好，便于统计数目。
经观察和数目统计，本实施例中6个试验材料的染色体数目鉴定结果为：拔地拉和57ng208体细胞染色体数目均为2n＝80；闽糖70-611和rb72-454分别为2n＝105和2n＝112；杂交后代种质材料f1崖城96-48染色体数目为2n＝80；杂交后代种质材料bc2云蔗07-86染色体数目为2n＝114(见图12，甘蔗茎尖染色体完整、分散不重叠，染色体缢痕清晰，本发明方法可用于甘蔗亲本种及杂交后代种质染色体数目鉴定和核型分析)。
实施例3
甘蔗野生种及近缘属植物染色体数目鉴定
甘蔗野生种割手密和大茎野生种，近缘属植物斑茅、芒、滇蔗茅和河八王，含有许多甘蔗中没有的新的抗性基因，具有强宿根性和丛生性好的特点，在甘蔗杂交利用和遗传改良中具有较大的价值，深入研究这些资源的染色体倍性及细胞学遗传行为，为资源分类鉴定和挖掘利用奠定基础。本发明以甘蔗野生种割手密、大茎野生种和3个甘蔗近缘植物为试验材料，于晴天上午9：00～11：00，到国家甘蔗种质资源圃，采集茎尖分生区组织进行预处理，探讨本发明技术方法是否适宜甘蔗野生种割手密、大茎野生种及近缘属的染色体分析。
经预处理、固定、解离染色、制片和镜检，结果表明本发明同样适用于甘蔗野生种割手密、大茎野生种及其近缘属植物的茎尖染色体制片，获得分裂相中期细胞多，染色体形态结构清晰、分散良好，便于数目统计和核型分析等研究，为甘蔗野生种和近缘植物基因挖掘及染色体遗传研究奠定基础。
甘蔗野生种割手密(越南3号)、大茎野生种(51ng3)，近缘属植物斑茅(崖城1号)、芒(江西2012-117)和滇蔗茅(云南2007-51)体细胞染色体数目鉴定结果依次为2n＝80，125，60，38和30(见图13，甘蔗茎尖染色体制片可用于甘蔗野生种及其近缘属植物资源的分类鉴定)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采集生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织切成0.3～0.5cm3的小块状，用预冷的ddh2o灭菌水浸泡，在4℃条件下预处理5～24h，得到预处理材料；
2)将所述预处理材料进行固定，固定条件为4℃，固定时间为2～3d，用ddh2o灭菌水清洗后，用解离液在50～65℃水浴条件下解离20～25min，得到解离材料；
所述解离液为1mol/lhcl溶液和体积百分浓度45％乙酸水溶液等体积混合形成的混合液；
3)将所述解离材料转移至载玻片上，去除表面水分后，用改良苯酚卡宝品红染色液染色，夹碎所述解离材料，去除组织残渣，盖上盖玻片，染色4～8min，去除所述盖玻片周围染色液，压片，制得染色体分散的玻片标本。
2.根据权利要求1所述甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，其特征在于，步骤1)中所述茎尖分生区组织包括甘蔗茎尖基部分生区组织和/或包裹茎尖的2～3层幼叶分生区组织，所述包裹茎尖的2～3层幼叶分生区组织为距离茎尖往上3cm内的幼叶分生区组织。
3.根据权利要求1所述甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，其特征在于，步骤1)中所述生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织的采集时期包括在甘蔗拔节期、伸长时期或伸长后期。
4.根据权利要求1～3任意一项所述甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，其特征在于，步骤1)中所述生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织的采集时间为晴天的上午9:00～11:00。
5.根据权利要求1所述甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，其特征在于，步骤2)中所述固定用固定液为卡诺固定液；
所述卡诺固定液为无水乙醇和冰醋酸按照体积比为3：1的比例混合而成。
6.根据权利要求1所述甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，其特征在于，步骤3)中所述压片的方法为用带有橡皮的铅笔的一端敲击所述盖玻片，使染色体分散，然后用大拇指压所述盖玻片，使细胞平整分散，染色体处在同一平面上。
7.根据权利要求1、2、3、5和6任意一项所述甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，其特征在于，所述甘蔗的品种包括拔地拉、57ng208、闽糖70-611、rb72-454、f1崖城96-48或bc2云蔗07-86。
8.根据权利要求1、2、3、5和6任意一项所述甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，其特征在于，所述甘蔗近缘种包括甘蔗野生种和甘蔗近缘属植物；
所述甘蔗野生种包括割手密和大茎野生种；所述甘蔗近缘属植物包括斑茅、芒、滇蔗茅和河八王。
9.权利要求1～8任意一项所述甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法制备得到的甘蔗染色体分散的玻片标本，其特征在于，染色体形态结构清晰，分散不重叠的分裂相中期细胞，背景干净无杂质。
10.权利要求9所述甘蔗或甘蔗近缘种染色体分散的玻片标本在甘蔗或甘蔗近缘种的染色体核型分析或种质资源分类鉴定及保护利用中的应用。
技术总结