本发明涉及医疗检测
技术领域：
，具体涉及一种基于制片法的液基真菌检测方法。
背景技术：
：真菌属于真核生物，没有质体，营养方式为吸收，无吞噬作用。细胞壁含有甲壳质和β-葡聚糖。可引起人类，动物的疾病，称为真菌病，还可引起植物的疾病、人类过敏性疾病和真菌毒素中毒症。真菌侵犯人体常继发于其他疾患，如恶性肿瘤、糖尿病等慢性消耗性疾病；大剤量x线照射；免疫抑制剂等导致免疫功能和抵抗力低下；大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染真菌；另外器官移植、导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为真菌的入侵提供了条件。近年来由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现，使原来不致病的真菌转为致病真菌。因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。真菌分为浅部真菌和深部真菌。浅部真菌：主要侵犯机体皮肤，寄生和腐生于表皮，毛发和甲板的角质组织中，引起浅部真菌病，简称癣病。临床最多见的浅部真菌病有：体癣、股癣、手癣和足癣。液基细胞学技术，对脱落细胞学制片最有效，在宫颈癌早期筛查中应用较广，而在基层医院用于非妇科标本的制备，尚在摸索起步阶段，在非妇科的应用其效果褒贬不一。与传统涂片相比，其优点为：(1)大大减少了传统涂片中的黏液、血液，背景较干净，涂片厚薄均匀，细胞平铺，易于观察；(2)液基为湿固定因而细胞保存完好，结构清晰，细胞退变较少；(3)易于重复制片，同时保存了细胞的抗原性，易于进行免疫组化的检测。技术实现要素：本发明提供一种基于制片法的液基真菌检测方法，其目的在于，提高真菌细胞的显现度，提高对真菌细胞的观察效率，可以简便快捷的实现在待检测样品中过滤杂质，富集需检测的真菌进行制片，以便于观察和检测，有效的解决了现有技术中所存在的操作繁琐、过程耗时长，所需试剂多等问题。本发明提供一种基于制片法的液基真菌检测方法，包括以下步骤：s1.取样：由妇科医生用一次性采样拭子采集标本，立即放入装有保存液的标本瓶,折断模塑点并丢弃手柄拧紧瓶盖，适当振荡瓶子，以进一步充分释放样品中细胞及微生物，使样品充分接触保存液；s2.样品处理：往样品液瓶里添加等体积前处理液，拧紧瓶盖，适当振荡瓶子，使样品充分接触前处理液；s3.样品制片：样品混合均匀后，用制片设备进行制片；制片结束后，取出载玻片，制片完成后观察，若制片中央无空心，置于空气中晾至湿干，在95％乙醇中固定5min；s4.样品检测：在载玻片上滴加50ul荧光染色液，盖上盖玻片后静置数十秒后置于荧光显微镜下镜检；其中，所述荧光染色液由以下原料按重量份制备而成：苯酚5份、乙二醇20份、pbs缓冲液100份、藻红蛋白30份和去离子水100份。作为本发明进一步的改进，步骤s3中所述样品制片方法包括离心法、膜式法和沉降法。作为本发明进一步的改进，所述离心法包括以下步骤：利用离心将黏液与真菌细胞相分离，形成均匀的悬浮液，涂片制成单层薄片，整个过程在制片机自动完成。作为本发明进一步的改进，所述膜式法包括以下步骤：将样品通过过滤膜过滤，使真菌细胞贴附在滤膜上，再通过负压力将滤膜上的真菌细胞转移到载玻片上，放入固定液中固定，整个过程在制片机自动完成。作为本发明进一步的改进，所述沉降法包括以下步骤：将标本离心去上清液，转移至沉降式制片染色机待检位上，将载玻片置于染色板上，并扣上制片染色舱。作为本发明进一步的改进，步骤s1中所述保存液由以下原料制备而成：中药抗菌水提物2-5份、维生素c2-7份、稳定剂1-3份、固定剂1-2份、丙三醇10-20份、乙酸适量和去离子水100-150份，所述乙酸用于调节保存液的ph值。作为本发明进一步的改进，所述中药抗菌水提物由以下原料制备而成：五倍子、板蓝根、蒲公英、柴胡、五指毛桃、连翘、贝母、苍术、兔耳草和甘青乌头；所述中药抗菌水提物由以下方法制备：按比例称取各原料中药材，洗净，干燥，粉碎，混合均匀后，按固液比1:10浸泡到去离子水中，500-700w微波加热提取1-2h，过滤，液体减压蒸馏浓缩至密度为1.2-1.5g/cm3，得到中药抗菌水提物。作为本发明进一步的改进，所述稳定剂选自mgso4、nacl、mgcl2、甘露醇、山梨醇或蔗糖中的一种或几种；所述固定剂选自戊二醛、丙烯醛、丹宁酸或高锰酸钾中的一种或几种。作为本发明进一步的改进，步骤s3中所述前处理液由以下原料按重量份制备而成：冰醋酸2-5份、十二烷基磺酸钠10-15份、柠檬酸钠2-7份、三羟甲基氨基甲烷1-5份、去离子水100-150份。作为本发明进一步的改进，步骤s5中所述荧光染色液由以下原料按重量份制备而成：苯酚5-12份、乙二醇20-40份、pbs缓冲液100-200份、藻蓝蛋白或藻红蛋白30-50份和去离子水100-200份。本发明具有如下有益效果：本发明通过添加中药抗菌水提物，该组合抗菌中药材得到的水提物具有较好的杀死细菌的效果，具有广谱高效的效果，但对真菌的威力不大，适宜作为真菌的保存液添加物；本发明通过添加稳定剂和固定剂，有效保持真菌的形态不被改变，有助于后期研究工作，同时保存液不添加任何有毒的挥发性物质，以环保的水为溶剂，使用安全无毒副作用，且便于保存和贮藏，具有广阔的应用前景；本发明荧光染色液通过添加荧光性极好的藻胆蛋白(藻蓝蛋白或者藻红蛋白)，是一种具有强烈荧光性的红色、紫罗蓝色和蓝色蛋白质，来自于蓝藻或红藻等藻类物质，天然无毒害，比普通染色剂的荧光效果更好，且更安全，不会致癌，适合真菌检测的染色；本发明采用的前处理液添加三羟甲基氨基甲烷和十二烷基磺酸钠有助于提高真菌的活力以及稳定性，通过冰醋酸调节ph值，防止真菌细胞内成分流失，为真菌细胞提供能量，降低高度稀释对真菌细胞产生的损伤并起到冷冻保护作用，给真菌细胞创造一个有利的外界环境；本发明采用一种基于制片法的液基真菌检测方法，提高真菌细胞的显现度，提高对真菌细胞的观察效率，可以简便快捷的实现在待检测样品中过滤杂质，富集需检测的真菌进行制片，以便于观察和检测，有效的解决了现有技术中所存在的操作繁琐、过程耗时长，所需试剂多等问题。附图说明图1为本发明实施例一种基于制片法的液基真菌检测方法的工艺流程图。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。实施例1一种基于制片法的液基真菌检测方法，包括以下步骤：s1.取样：由妇科医生用一次性标本采集刷采集标本，用大拇指与食指捏住刷柄，将采集刷尖伸入宫颈口内朝顺时针方向旋转3-5周，抽出采集刷，卸下刷头立即放入装有保存液的标本瓶，轻轻摇晃、漂洗，以使刷头上的细胞全部混入保存液中；所述保存液由以下原料制备而成：中药抗菌水提物2份、维生素c2份、稳定剂1份、固定剂1份、丙三醇10份、乙酸适量和去离子水100份，所述乙酸用于调节保存液的ph值；所述中药抗菌水提物由以下原料制备而成：五倍子5份、板蓝根5份、蒲公英2份、柴胡5份、五指毛桃10份、连翘5份、贝母2份、苍术1份、兔耳草5份和甘青乌头5份；所述中药抗菌水提物由以下方法制备：按比例称取各原料中药材，洗净，干燥，粉碎，混合均匀后，按固液比1:10浸泡到去离子水中，500w微波加热提取1h，过滤，液体减压蒸馏浓缩至密度为1.2-1.5g/cm3，得到中药抗菌水提物；所述稳定剂选自mgso4、nacl、mgcl2、甘露醇、山梨醇或蔗糖中的一种或几种；所述固定剂选自戊二醛、丙烯醛、丹宁酸或高锰酸钾中的一种或几。保存液的制备方法：将中药抗菌水提物、维生素c、稳定剂、固定剂和丙三醇按比例混合，溶于去离子水中，用乙酸调节ph为3-4，混合均匀后制得。s2.样品处理：往样品液瓶里添加等体积前处理液，拧紧瓶盖，适当振荡瓶子，使样品充分接触前处理液；所述前处理液由以下原料按重量份制备而成：冰醋酸2份、十二烷基磺酸钠10份、柠檬酸钠2份、三羟甲基氨基甲烷1份、去离子水100份；前处理液的制备方法：将冰醋酸、十二烷基磺酸钠、柠檬酸钠和三羟甲基氨基甲烷按比例混合，溶于去离子水中，混合均匀后制得。s3.样品制片：样品混合均匀后，用制片设备进行制片；制片结束后，取出载玻片，在载玻片上滴加50ul荧光染色液，盖上盖玻片后静置数十秒；离心法制片：利用离心将黏液与真菌细胞相分离，形成均匀的悬浮液，涂片制成单层薄片，整个过程在制片机自动完成；s4.样品检测：制片完成后观察，若制片中央无空心，置于空气中晾至湿干，在95％乙醇中固定至少5min后置于荧光显微镜下进行镜检；所述荧光染色液由以下原料按重量份制备而成：苯酚5份、乙二醇20份、pbs缓冲液100份、藻红蛋白30份和去离子水100份。荧光染色液的制备方法：将苯酚、乙二醇、pbs缓冲液、藻红蛋白和去离子水混合，搅拌均匀，制得荧光染色液。实施例2一种基于制片法的液基真菌检测方法，包括以下步骤：s1.取样：由妇科医生用一次性标本采集刷采集标本：用大拇指与食指捏住刷柄，将采集刷尖伸入宫颈口内朝顺时针方向旋转3-5周，抽出采集刷，卸下刷头立即放入装有保存液的标本瓶，轻轻摇晃、漂洗，以使刷头上的细胞全部混入保存液中；所述保存液由以下原料制备而成：中药抗菌水提物5份、维生素c7份、稳定剂3份、固定剂2份、丙三醇20份、乙酸适量和去离子水150份，所述乙酸用于调节保存液的ph值；所述中药抗菌水提物由以下原料制备而成：五倍子10份、板蓝根10份、蒲公英7份、柴胡15份、五指毛桃15份、连翘10份、贝母7份、苍术5份、兔耳草10份和甘青乌头15份；所述中药抗菌水提物由以下方法制备：按比例称取各原料中药材，洗净，干燥，粉碎，混合均匀后，按固液比1:10浸泡到去离子水中，700w微波加热提取2h，过滤，液体减压蒸馏浓缩至密度为1.2-1.5g/cm3，得到中药抗菌水提物；所述稳定剂选自mgso4、nacl、mgcl2、甘露醇、山梨醇或蔗糖中的一种或几种；所述固定剂选自戊二醛、丙烯醛、丹宁酸或高锰酸钾中的一种或几。保存液的制备方法：将中药抗菌水提物、维生素c、稳定剂、固定剂和丙三醇按比例混合，溶于去离子水中，用乙酸调节ph为3-4，混合均匀后制得。s2.样品处理：往样品液瓶里添加等体积前处理液，拧紧瓶盖，适当振荡瓶子，使样品充分接触前处理液；所述前处理液由以下原料按重量份制备而成：冰醋酸5份、十二烷基磺酸钠15份、柠檬酸钠7份、三羟甲基氨基甲烷5份、去离子水150份；前处理液的制备方法：将冰醋酸、十二烷基磺酸钠、柠檬酸钠和三羟甲基氨基甲烷按比例混合，溶于去离子水中，混合均匀后制得。s3.样品制片：样品混合均匀后，用制片设备进行制片；制片结束后，取出载玻片，制片完成后观察，若制片中央无空心，置于空气中晾至湿干，在95％乙醇中固定5min；膜式法制片：将样品通过过滤膜过滤，使真菌细胞贴附在滤膜上，再通过负压力将滤膜上的真菌细胞转移到载玻片上，放入固定液中固定，整个过程在制片机自动完成；s4.样品检测：在载玻片上滴加50ul荧光染色液，盖上盖玻片后静置数十秒后置于荧光显微镜下镜检；其中，所述荧光染色液由以下原料按重量份制备而成：苯酚5份、乙二醇20份、pbs缓冲液100份、藻红蛋白30份和去离子水100份。荧光染色液的制备方法：将苯酚、乙二醇、pbs缓冲液、藻蓝蛋白和去离子水混合，搅拌均匀，制得荧光染色液。实施例3一种基于制片法的液基真菌检测方法，包括以下步骤：s1.取样：由妇科医生用一次性标本采集刷采集标本：用大拇指与食指捏住刷柄，将采集刷尖伸入宫颈口内朝顺时针方向旋转3-5周，抽出采集刷，卸下刷头立即放入装有保存液的标本瓶，轻轻摇晃、漂洗，以使刷头上的细胞全部混入保存液中；所述保存液由以下原料制备而成：中药抗菌水提物3份、维生素c5份、稳定剂2份、固定剂1.5份、丙三醇15份、乙酸适量和去离子水125份，所述乙酸用于调节保存液的ph值；所述中药抗菌水提物由以下原料制备而成：五倍子7份、板蓝根7份、蒲公英5份、柴胡10份、五指毛桃12份、连翘7份、贝母5份、苍术3份、兔耳草7份和甘青乌头10份；所述中药抗菌水提物由以下方法制备：按比例称取各原料中药材，洗净，干燥，粉碎，混合均匀后，按固液比1:10浸泡到去离子水中，600w微波加热提取1.5h，过滤，液体减压蒸馏浓缩至密度为1.2-1.5g/cm3，得到中药抗菌水提物；所述稳定剂选自mgso4、nacl、mgcl2、甘露醇、山梨醇或蔗糖中的一种或几种；所述固定剂选自戊二醛、丙烯醛、丹宁酸或高锰酸钾中的一种或几。保存液的制备方法：将中药抗菌水提物、维生素c、稳定剂、固定剂和丙三醇按比例混合，溶于去离子水中，用乙酸调节ph为3-4，混合均匀后制得。s2.样品处理：往样品液瓶里添加等体积前处理液，拧紧瓶盖，适当振荡瓶子，使样品充分接触前处理液；所述前处理液由以下原料按重量份制备而成：冰醋酸4份、十二烷基磺酸钠13份、柠檬酸钠5份、三羟甲基氨基甲烷3份、去离子水125份；前处理液的制备方法：将冰醋酸、十二烷基磺酸钠、柠檬酸钠和三羟甲基氨基甲烷按比例混合，溶于去离子水中，混合均匀后制得。s3.样品制片：样品混合均匀后，用制片设备进行制片；制片结束后，取出载玻片，制片完成后观察，若制片中央无空心，置于空气中晾至湿干，在95％乙醇中固定5min；沉降法制片：将标本离心去上清液，转移至沉降式制片染色机待检位上，将载玻片置于染色板上，并扣上制片染色舱；s4.样品检测：在载玻片上滴加50ul荧光染色液，盖上盖玻片后静置数十秒后置于荧光显微镜下镜检；其中，所述荧光染色液由以下原料按重量份制备而成：苯酚5份、乙二醇20份、pbs缓冲液100份、藻红蛋白30份和去离子水100份。荧光染色液的制备方法：将苯酚、乙二醇、pbs缓冲液、藻蓝蛋白和去离子水混合，搅拌均匀，制得荧光染色液。对比例1与实施例5相比，荧光染色液中藻蓝蛋白替换为台酚蓝。对比例2与实施例5相比，前处理液中未添加三羟甲基氨基甲烷和十二烷基磺酸钠。对比例3与实施例5相比，保存液中未添加中药抗菌水提物和维生素c。对比例4与实施例5相比，保存液中未添加稳定剂和固定剂。测试例1将本发明实施例1-5和对比例1-3进行性能测试，结果见表1。表1染色效果比较组别染色效果荧光时长(min)反差效果保存时间毒性实施例1好100明显>7d安全无毒实施例2好100明显>7d安全无毒实施例3好100明显>7d安全无毒对比例1好20不明显>7d致癌疑似物对比例2好100明显>7d安全无毒对比例3好100明显>7d安全无毒对比例4好100明显>7d安全无毒由上表可知，本发明采用藻胆蛋白(藻蓝蛋白和藻红蛋白)作为荧光显色剂，具有安全无毒，荧光时间长，保持时间长，反差明显等优点。表2由上表可知，采用本发明方法进行制片，质量评估结果明显优于对比例1-3制片的质量。对比例2中未添加三羟甲基氨基甲烷和十二烷基磺酸钠，使得细胞内成分流失，导致背景较乱，细胞保留不完整，种类少。对比例3中未添加中药抗菌水提物和维生素c，滋生大量微生物，导致保留细胞不多，种类部分少，细胞部分完整。对比例4中未添加稳定剂和固定剂，有少量微生物，但由于未添加稳定剂和固定剂的，导致细胞形态不完整。与现有技术相比，本发明通过添加中药抗菌水提物，该组合抗菌中药材得到的水提物具有较好的杀死细菌的效果，具有广谱高效的效果，但对真菌的威力不大，适宜作为真菌的保存液添加物；本发明通过添加稳定剂和固定剂，有效保持真菌的形态不被改变，有助于后期研究工作，同时保存液不添加任何有毒的挥发性物质，以环保的水为溶剂，使用安全无毒副作用，且便于保存和贮藏，具有广阔的应用前景；本发明荧光染色液通过添加荧光性极好的藻胆蛋白(藻蓝蛋白或者藻红蛋白)，是一种具有强烈荧光性的红色、紫罗蓝色和蓝色蛋白质，来自于蓝藻或红藻等藻类物质，天然无毒害，比普通染色剂的荧光效果更好，且更安全，不会致癌，适合真菌检测的染色；本发明采用的前处理液添加三羟甲基氨基甲烷和十二烷基磺酸钠有助于提高真菌的活力以及稳定性，通过冰醋酸调节ph值，防止真菌细胞内成分流失，为真菌细胞提供能量，降低高度稀释对真菌细胞产生的损伤并起到冷冻保护作用，给真菌细胞创造一个有利的外界环境；本发明采用制片法液基薄层细胞制片技术，提高真菌细胞的显现度，提高对真菌细胞的观察效率，可以简便快捷的实现在待检测样品中过滤杂质，富集需检测的真菌进行制片，以便于观察和检测，有效的解决了现有技术中所存在的操作繁琐、过程耗时长，所需试剂多等问题。本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。当前第1页1 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技术特征：1.一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1.取样：由妇科医生用一次性采样拭子采集标本，立即放入装有保存液的标本瓶,折断模塑点并丢弃手柄拧紧瓶盖，适当振荡瓶子，以进一步充分释放样品中细胞及微生物，使样品充分接触保存液；
s2.样品处理：往样品液瓶里添加等体积前处理液，拧紧瓶盖，适当振荡瓶子，使样品充分接触前处理液；
s3.样品制片：样品混合均匀后，用制片设备进行制片；制片结束后，取出载玻片，制片完成后观察，若制片中央无空心，置于空气中晾至湿干，在95％乙醇中固定5min；
s4.样品检测：在载玻片上滴加50ul荧光染色液，盖上盖玻片后静置数十秒后置于荧光显微镜下镜检；
其中，所述荧光染色液由以下原料按重量份制备而成：苯酚5份、乙二醇20份、pbs缓冲液100份、藻红蛋白30份和去离子水100份。
2.根据权利要求1所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，步骤s3中所述样品制片方法包括离心法、膜式法和沉降法。
3.根据权利要求2所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，所述离心法包括以下步骤：利用离心将黏液与真菌细胞相分离，形成均匀的悬浮液，涂片制成单层薄片，整个过程在制片机自动完成。
4.根据权利要求2所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，所述膜式法包括以下步骤：将样品通过过滤膜过滤，使真菌细胞贴附在滤膜上，再通过负压力将滤膜上的真菌细胞转移到载玻片上，放入固定液中固定，整个过程在制片机自动完成。
5.根据权利要求2所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，所述沉降法包括以下步骤：将标本离心去上清液，转移至沉降式制片染色机待检位上，将载玻片置于染色板上，并扣上制片染色舱。
6.根据权利要求1所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，步骤s1中所述保存液由以下原料制备而成：中药抗菌水提物2-5份、维生素c2-7份、稳定剂1-3份、固定剂1-2份、丙三醇10-20份、乙酸适量和去离子水100-150份，所述乙酸用于调节保存液的ph值。
7.根据权利要求6所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，所述中药抗菌水提物由以下原料制备而成：五倍子、板蓝根、蒲公英、柴胡、五指毛桃、连翘、贝母、苍术、兔耳草和甘青乌头；
所述中药抗菌水提物由以下方法制备：按比例称取各原料中药材，洗净，干燥，粉碎，混合均匀后，按固液比1:10浸泡到去离子水中，500-700w微波加热提取1-2h，过滤，液体减压蒸馏浓缩至密度为1.2-1.5g/cm3，得到中药抗菌水提物。
8.根据权利要求6所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，所述稳定剂选自mgso4、nacl、mgcl2、甘露醇、山梨醇或蔗糖中的一种或几种；所述固定剂选自戊二醛、丙烯醛、丹宁酸或高锰酸钾中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，步骤s3中所述前处理液由以下原料按重量份制备而成：冰醋酸2-5份、十二烷基磺酸钠10-15份、柠檬酸钠2-7份、三羟甲基氨基甲烷1-5份、去离子水100-150份。
10.根据权利要求1所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，步骤s3中所述荧光染色液由以下原料按重量份制备而成：苯酚5-12份、乙二醇20-40份、pbs缓冲液100-200份、藻蓝蛋白或藻红蛋白30-50份和去离子水100-200份。
技术总结本发明提出了一种基于制片法的液基真菌检测方法，属于医疗检测技术领域，具体包括以下步骤：S1.取样；S2.样品处理；S3.样品制片；S4.样品检测。本发明采用液基真菌富集制片法，提高真菌细胞的显现度，提高对真菌细胞的观察效率，可以简便快捷的实现在待检测样品中过滤杂质，富集需检测的真菌进行制片，以便于观察和检测，有效的解决了现有技术中所存在的操作繁琐、过程耗时长，所需试剂多等问题。
技术研发人员：熊文芳;吕正和;陈永洪;杜厚明;杨平平;侯莉;赖文成
受保护的技术使用者：江西业力医疗器械有限公司
技术研发日：2020.01.16
技术公布日：2020.06.05
