本发明涉及一种生物标本的处理方法与处理剂，尤其是利用明胶包被微小或者极薄生物标本以保持标本的组织结构或内部成分、微生物的完整性，属于生物技术领域。
背景技术：
使用显微镜观察时需要标本切片，在制作标本切片或超薄切片时，由于组织是柔软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片是困难的。所以，有必要用一定物质浸透组织内部，使整个组织均匀硬化，以利于用锋利的刀切成薄片，这种浸透物质叫做包埋剂。
石蜡制片法是将材料经固定、脱水、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法，石蜡即是一种软硬适中的包埋剂。此法适用范围广，制片手段完备，能将材料切成极薄的片，并能制成连续的片，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。
自1948年起，对微小的，或者极薄的组织标本，研究者陆续报道了火棉胶(硝化纤维)、琼脂、琼脂和明胶、琼脂糖等材料进行预先包埋，然后再进行石蜡包埋、切片的双重包被法，最小的包被标本是单细胞的滴虫。此前的这些研究，主要目的是为了对标本进行定向和定位，以获得一定方向切面的切片，便于观察。
研究人员在研究痤疮粉刺角栓的结构和微生物的过程中，使用上述传统石蜡包埋、切片法制作标本，遇到了角栓标本结构破坏和微生物丢失的问题，无法保持痤疮粉刺角栓的结构和微生物的完整性，难以进行后续研究。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题：制作微小或者极薄的生物标本时，如何保持其组织结构及其内含微生物的完整性。
为了解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供了一种生物标本的处理方法，在生物标本接触交联剂前，用明胶包裹在生物标本的表面形成明胶包裹层。
在一些实施例中，明胶的浓度范围为15％～40％。优选地，明胶的浓度为25％。
在一些实施例中，明胶包裹层的厚度为0.5～2毫米。
在一些实施例中，生物标本的尺寸小于5毫米。
在一些实施例中，生物标本的处理方法包括如下步骤：
步骤一，以加热的明胶水凝胶包裹生物标本；
步骤二，明胶水凝胶冷却凝固，然后将包裹有明胶的生物标本置于交联剂中进行交联处理，以使明胶包裹层形成固定不溶的交联物。
在一些实施例中，交联剂选用甲醛或者戊二醛。
在一些实施例中，交联剂的浓度范围是3％～15％。
在一些实施例中，交联处理时间为12～24小时。
本发明的第二方面，提供了一种生物标本处理剂，包括明胶，明胶的浓度范围为15％～40％。
本发明的有益效果：
(1)减少患者的痛苦和创伤；
(2)避免伦理学问题；
(3)使大规模研究成为可能。
附图说明
图1是本发明的实施例1中分别采用25％明胶包被痤疮粉刺角栓标本与其他材料包被的显微照片对照图；
图2是本发明的实施例2中采用25％明胶包被毛囊皮脂腺标本的显微照片。
具体实施方式
除非另作定义，本专利的权利要求书和说明书中所使用的技术术语或者科学术语应当为本专利所属技术领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
普通生物标本的制作顺序是：先用甲醛溶液浸泡标本，标本中的蛋白质变性使标本形状固定；再用琼脂、琼脂和明胶、琼脂糖等材料对标本进行预先包埋；接着用不同浓度的酒精置换标本中的水分，以使标本完全脱水；然后将标本浸在熔化的蜡中，标本的内部孔隙被蜡充填，外表被蜡包裹；最后对石蜡包埋的标本进行切片，即得到可供显微观察的标本切片。
对于微小或极薄的生物标本，若直接用甲醛溶液浸泡，标本中的微小组织结构或者其中的微生物将被甲醛溶液破坏，形状难以保持，阻止了后续的观察与研究。如果在生物标本接触甲醛溶液前，用某种物质将标本包裹起来形成包裹层，就有可能保护标本内部的微小组织结构或者其中的微生物形状。以上就是本专利的发明构思。
本发明尝试了多种材料，发现明胶对于微小标本能够起到很好的保护效果。胶原蛋白是生物高分子，是动物结缔组织中的主要成分。明胶是胶原蛋白的一种不可逆的水解形式，是具有一定粘性的胶状物。
在甲醛或戊二醛溶液中，明胶会发生交联反应而变性变硬成为固体。实验发现，明胶的浓度范围为15％～40％，对于微小标本的制备较为合适。如果明胶的浓度过小，在甲醛溶液中形成的交联物太软导致成形不佳。如果明胶的浓度过大，交联物太硬不便于标本的切片，同时包裹浸润效果不佳。优选的明胶的浓度为25％。
若为微小标本，标本的尺寸小于5毫米。若为极薄标本，标本的厚度小于2毫米。明胶包裹在标本表面，形成的包裹层的厚度为0.5～2毫米。
本发明提供的生物标本的处理方法包括如下步骤：
步骤一，以明胶包裹生物标本。明胶浓度范围为15％～40％，优选浓度25％。以上浓度的明胶水凝胶加热至40度以上并保持温度，使其具有流动性。若采用微小标本制作标本切片，可以将标本静置后，使用滴液工具将明胶滴在标本上，由于明胶的流动性与渗透性，自动将微小标本完整包裹。
步骤二，明胶水凝胶冷却凝固后，对包裹有明胶的生物标本进行修剪，去除过多的明胶，再置于交联剂中进行交联处理，以使明胶包裹层形成固定不溶的交联物。交联剂选用甲醛或者戊二醛。交联剂的浓度范围是3％～15％，优选浓度4％。具体的操作为：将包裹有明胶的生物标本浸没在交联剂中并静置12～24小时。
以上步骤一与步骤二是本发明的关键步骤，为了获得标本成品，还应包括后续的常规步骤：
步骤三，完全脱除标本中的游离水分，常用的脱水剂为酒精。脱水过程应缓慢进行，不能过急或时间过长，以免组织变硬变脆或发生收缩现象。脱水采用梯度脱水，即从较低浓度酒精开始，逐渐替换到高浓度酒精。一般为：70％浓度的酒精→80％浓度的酒精→95％浓度的酒精→无水酒精(两次)，每级停留时间2～4小时或更长，最后采用无水酒精处理时间宜短。
步骤四，石蜡包埋和切片。使融化的石蜡充满标本的内部间隙，然后按常规程序切成显微观察所需薄片。
实施例1
痤疮粉刺的角栓是寻常痤疮的特征性结构，其中含有大量的微生物信息，对于探索痤疮发生的病因和机理具有重要的意义。传统的取样方法涉及到组织学，都需要使用环钻在皮肤上打孔，进行环钻活检取样，这在面部非常难以被接受，会有损患者的容貌、造成患者皮肤损伤和疼痛，因而有伦理学问题；即使经患者同意，能够活检取样，也不可能有很大的样本数量，从而妨碍了大样本的研究。
若采用无创的挤压方法分离出粉刺角栓，没有合适的包被方法处理，则切片不能保证其结构和内含微生物的完整性。因为角栓结构疏松，缺乏连接蛋白，在传统包埋方法处理流程中，由于大量的、多步骤的有机溶剂使用，使其松散、破碎，其内的微生物丢失，从而失去研究价值。传统上使用琼脂和琼脂糖等进行预包埋方法主要着眼于标本的定向和定位，而不涉及到标本结构与其中微生物的完整性；其顺序均是先用有机溶剂固定标本，再进行预包被，再脱水、浸蜡和切片。
此前未有人使用双重包被法处理过游离的痤疮粉刺角栓。本发明提供的方法是先预包被，再固定，再脱水、浸蜡和切片。本发明利用明胶作为蛋白质水解产物在甲醛中形成固定不溶的交联物这一特点，让明胶在标本外表形成一层外衣，避免其结构和微生物的破坏丢失。本发明提供的方法可以为痤疮研究带来巨大的便利。
本实施例进行了实验，实验的整体方法如下：寻求4名痤疮患者，采用无创方法从每名取5个角栓，采用不同的材料进行包被，设置不作预包被的阴性对照组，切片后对角栓染色观察，并作扫描电镜观察。
实验的具体步骤如下：
确定研究使用4种不同材料作为预包裹剂，包括琼脂、琼脂糖、明胶、琼脂 低浓度明胶，见表1。其中，用琼脂的实验方案中，琼脂浓度为2％。用琼脂糖的实验方案中，琼脂糖浓度为2％。用明胶的实验方案中，尝试了不同浓度的明胶，当明胶浓度为25％时，效果最佳。用琼脂 低浓度明胶的方案中，琼脂浓度为2％，明胶浓度为2.5％。
取同一患者的粉刺角栓，置于温暖的玻璃板上，滴上预包裹材料，待材料凝胶后，放入4％的甲醛溶液中过夜，再取出置于75％酒精中保存，后续可以对标本进行常规石蜡包埋和切片。
几种预包裹材料的性能对比结果如下表1所列示：
表1
表1中注解：
a固定后热稳定性：材料在4％的甲醛溶液中过夜后加热至70度不熔化的能力。
b熔接性：对于体积略大的标本，若一次滴上的材料不能完整包被标本，需要再滴加更多材料。若熔接性不好，则两次滴加的材料之间不能良好熔接，泡入4％的甲醛溶液中过夜后，两次滴加的材料会从交界处裂开，导致包被失败。
c方便性：是指材料一次用不完可以再次方便、容易地加热、熔化使用的重用性，以及在使用过程中可以调整的方便性。
d着色性：切片后染色，对染料的着色能力。
显微镜观察结果如图1所示。本发明试验了不同的材料及不同的材料浓度，最后发现25％的明胶具有最显著的优势。因此，对于粉刺角栓来说，25％的明胶是最佳的预包裹材料。此法可以保持角栓在处理过程中的结构完整性，并使其内的微生物处于原位，可用于粉刺的组织病理学和微生物空间分布研究。琼脂糖一定程度上可以保持角栓的结构，但角栓结构仍会变得松散。琼脂、琼脂 低浓度明胶不能保护角栓的结构完整性。
使用本发明提供的方法，无须对痤疮患者进行活检取样。按传统方法，可能要取一个直径为0.5厘米的组织；使用本发明的方法，只需要1毫米，这对患者的创伤就减少了24倍，即96％(注：直径5mm和1mm的面积相差25倍)。或者，按传统方法，0.5厘米只能取1个位点；使用本发明的方法，同样0.5厘米可以取25个位点，这样可以对病情、组织、病理作更加全面的检测、诊断、研究。本方法可解决痤疮研究取样的伦理学难题，同时保证标本中结构与微生物的完整性，使痤疮粉刺的大样本研究成为可能，有望成为痤疮病因学研究的重要工具。
综上可知，本实施例用明胶对痤疮粉刺角栓标本进行包被，有效保持痤疮粉刺角栓的结构和微生物的完整性。减少对患者的创伤、减少伦理学问题、珍贵的小标本可以得到良好保护和研究。
实施例2
本发明提供的包埋技术，不仅可以用于痤疮粉刺角栓的标本制作，还可以广泛用于其它微小的生物组织标本制作。用更小的标本，获取更多的信息，为临床研究和诊断工作带来便利。
在本实施例中，采用与实施例1中类似的双重包被方法，成功地对直径仅几百微米左右的、单个的毛囊皮脂腺进行了包被和切片，得到的结果如图2所示。图2中的毛囊皮脂腺结构、形态非常完整，可达到传统切片技术得到的影像质量。这种工作在没有使用本方法的情况下，是不可能完成的。
本发明用于极微小的、珍贵皮肤和全身组织样本的包被和处理，包括毛囊这样几百微米尺度的标本，这对于有效利用标本、减少病人痛苦和创伤具有很大意义。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
1.一种生物标本的处理方法，其特征在于，在所述生物标本接触交联剂前，用明胶包裹在所述生物标本的表面形成明胶包裹层。
2.根据权利要求1所述的一种生物标本的处理方法，其特征在于，所述明胶的浓度范围为15％～40％。
3.根据权利要求2所述的一种生物标本的处理方法，其特征在于，所述明胶的浓度为25％。
4.根据权利要求1所述的一种生物标本的处理方法，其特征在于，所述明胶包裹层的厚度为0.5～2毫米。
5.根据权利要求1所述的一种生物标本的处理方法，其特征在于，所述生物标本的尺寸小于5毫米。
6.根据权利要求1所述的一种生物标本的处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，以加热的明胶水凝胶包裹生物标本；
步骤二，所述明胶水凝胶冷却凝固，然后将包裹有明胶的生物标本置于交联剂中进行交联处理，以使明胶包裹层形成固定不溶的交联物。
7.根据权利要求6所述的一种生物标本的处理方法，其特征在于，所述交联剂选用甲醛或者戊二醛。
8.根据权利要求7所述的一种生物标本的处理方法，其特征在于，所述交联剂的浓度范围是3％～15％。
9.根据权利要求6所述的一种生物标本的处理方法，其特征在于，所述交联处理时间为12～24小时。
10.一种生物标本处理剂，其特征在于，包括明胶，所述明胶的浓度范围为15％～40％。
技术总结