本发明属于生物显微组织切片技术领域，具体涉及一种改进小鼠眼球冰冻切片的制作方法。
背景技术：
视网膜的疾病研究一般利用小鼠模型用于模拟人的疾病，通过对小鼠模型的研究来揭示视网膜的致病机制。在研究的过程中，需要用免疫组化或者是免疫荧光染色的方法探究小鼠眼球或者视网膜的病理情况。免疫组化和免疫荧光染色一般是用抗体检测眼球组织切片中蛋白或其他抗原分子的分布和表达情况。在各种眼球的组织切片中，冰冻切片是最适合用于免疫组化和免疫荧光染色的，因为冰冻切片能够更好地保留组织中抗原的免疫反应性。
目前通用的小鼠眼球冰冻切片的基本自备流程是先把小鼠眼球摘出来，用多聚甲醛固定一定时间后，用蔗糖溶液脱水，剪去角膜组织，取出晶体，把剩下的眼杯组织用包埋液(一般是用oct)包埋，冷冻固化后，用冰冻切片机切成薄片。
由于小鼠的眼球比较脆弱，尤其是年轻小鼠的眼球，加上视网膜的特殊构造，在制作小鼠眼球冰冻切片的组织处理过程中，需要把小鼠的角膜在显微镜下剪掉角膜，然后取出晶体，在此过程中必然会牵扯眼球内的视网膜组织。在眼球内，视网膜组织与与单层的视网膜色素上皮层(rpe比较松散的接触。因而，在组织处理中视网膜很容易从rpe上脱离下来，导致视网膜形态扭曲变性。另一方面，视网膜中感光细胞的外节(outersegment)和内节(innersegment)是由非常细小的连接纤毛相连接。连接纤毛很脆弱，也容易在组织处理中断开，导致外节与内节分离。由于这些因素的存在，眼球组织的冰冻切片上往往会出现网脱或者空洞，严重影响免疫组化的结果。即使是非常有经验的研究人员，也不能稳定地得到理想的结果。最终导致很多经过长周期努力培育出来的小鼠，因为不能得到好的免疫组化结果，浪费了宝贵的实验材料和时间。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种改进小鼠眼球冰冻切片的制作方法，该方法可以提高改善冰冻切片中组织形态，防止眼球组织变形引起的网脱和感光细胞的断裂。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种改进小鼠眼球冰冻切片的制作方法，包括以下步骤：
1)将小鼠眼球置于固定液中在冰温条件下固定10min；
2)在小鼠眼球的角膜剪小口，置于固定液中在冰温条件下固定2h；
3)洗去小鼠眼球上的固定液，在4℃条件下脱水过夜；
4)取出小鼠眼球，在巩膜上涂抹一层胶水；
5)待巩膜表面的胶水凝固后，剪去角膜，取出晶体；
6)将去除的角膜和晶体的眼杯放入装有包埋液的包埋盒中，在－80℃条件下速冻；
7)用冰冻切片机把组织切成适当厚度的切片。
进一步的，步骤(1)所述的固定液为pbs缓冲液或多聚甲醛的磷酸盐缓冲液。优选的，磷酸盐缓冲液的浓度为0.1m，多聚甲醛的质量浓度为4％。
进一步的，步骤(3)中脱水采用pbs配备的蔗糖溶液，蔗糖溶液的质量浓度为30％。
进一步的，步骤(4)所述的胶水为以α-氰基丙烯酸乙酯为主的胶水。
进一步的，步骤(6)中的包埋液为oct。
本发明的有益效果为：
本发明在剪去角膜和取出晶体之前在巩膜上涂上一层能够快速固化的胶水。这层胶水在凝固后可以对巩膜起加固作用，在后续的处理过程中维持眼球的形态，防止眼球组织变形引起的网脱和感光细胞的断裂。通过这个方法的处理，可以大大提高改善冰冻切片中组织形态。
本发明方法得到的冰冻切片，可用于免疫组织和免疫荧光染色，稳定地得到形态优美的免疫组化和免疫荧光染色的图片。商业公司和研究机构的科研人员通过该技术获得好的小鼠视网膜免疫染色的结果，可以用于发表科技论文，申请研究课题，展示汇报研究成果，推广商业产品。
附图说明
图1是本发明视网膜冰冻切片的染色效果；其中a为常规技术冰冻切片，b为本发明冰冻切片。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种改进的小鼠眼球冰冻切片的制作方法，能够在最大程度地避免上述的组织处理过程眼球的变形导致视网膜冰冻切片中出现网脱和视网膜空洞。该方法的详细过程如下：
1)将处死的小鼠眼球放入用pbs缓冲液或者0.1m的磷酸盐缓冲液中配制的质量浓度4％的多聚甲醛溶液中，在冰上固定10分钟左右，在小鼠眼球的角膜剪一个小口，接着再放入固定液中再固定2两小时。
2)去掉固定液，用pbs洗掉多余固定液，把眼球放入用pbs配备的质量浓度30％蔗糖溶液，在4℃脱水至少过夜。
3)把眼球取出，用吸水纸把眼球上附着的溶液吸掉。
4)在解剖镜下，让眼球的眼杯口朝下，巩膜朝上，在巩膜上涂上一层以α-氰基丙烯酸乙酯为主的胶水或者其他速凝的胶水。等胶水凝固后会形成一层质地比较硬的保护壳，可以防止在后续的操作过程中很好地避免眼球形变引起的视网膜与rpe层的脱离以及感光细胞外节与内节连接处的断裂。
5)待巩膜表面的胶水凝固后，把眼球翻转过来，让角膜朝上。用解剖剪剪去角膜，取出晶体。
6)把去除角膜和和晶体的眼杯放入装有包埋液(oct)的包埋盒中，然后放入-80度冰箱中进行深度速冻。
7)用冰冻切片机把组织切成适当厚度的切片。
本发明技术采用在巩膜涂抹胶水的技术，主要目的是在剪去角膜和取晶体其他后续的处理过程中防止眼球变形。没有采用将眼球整体浸入，是因为整理浸入必须在去除角膜和去除晶体之后，否则整体浸入无法实现。如果不采用本发明技术，实施整体浸入之前的去角膜和晶体已经对眼球的整体形态会造成破坏。另外，如果不采用本发明技术，由于胶水的具有粘连特性，胶水整体浸入后对视网膜会造成牵拉作用，导致视网膜形态损伤，与本技术的目的相悖。本发明技术的是在去除角膜和晶体等其他操作之前在巩膜上涂抹胶水实现巩膜加固，实现在眼球处理过程中保持视网膜形态的目的。此外，胶水整体浸入，填充了整个眼球，待胶水凝固后，硬度高，不能进行组织冰冻切片。而本发明技术只是在巩膜上涂一层比较薄的胶水，凝固的胶水不影响后续的冰冻切片。
实施例2
目前通用的常规切片制备过程如下：
1)将小鼠眼球放入用pbs缓冲液或者0.1m的磷酸盐缓冲液中配制的质量浓度4％的多聚甲醛溶液中，在冰上固定10分钟左右，在小鼠眼球的角膜剪一个小口，接着再放入固定液中再固定2两小时。
2)去掉固定液，用pbs洗掉多余固定液，把眼球放入用pbs配备的质量浓度30％蔗糖溶液，在4℃脱水至少过夜。
3)用解剖剪剪去角膜，取出晶体。
4)把去除角膜和和晶体的眼杯放入装有包埋液(oct)的包埋盒中，然后放入-80度冰箱中进行深度速冻。
5)用冰冻切片机把组织切成适当厚度的切片。
本发明技术方案在常规技术步骤2)和3)步骤增加了在巩膜上涂上胶水用于固定巩膜的步骤，从而实现了良好的技术效果，如图1所示，没有用本申请专利之前切出来的冰冻切片，视网膜感光细胞的外节不规整，常带有网脱和比较大的空洞。采用本申请的方法之后，视网膜感光细胞的形态有很大的改善。
实施例3
现有技术《用冰冻切片法制作家兔眼球切片》中记载了一种眼球切片的制作方法，其采用明胶浸入，并使用不同浓度的明胶溶液进行包埋。其中，明胶作为一种填充剂和包埋介质，所起的作用是主要是使眼球在切片过程中维持一定的形态，而本发明技术是在剪去小鼠眼球角膜和和取出晶体之前进行巩膜加固，使眼球在后续的处理过程中维持形态(本发明技术也适用于其他动物的眼球，包括兔子的眼球)，其明胶的主要目的不是在切片过程维持形态。切片过程中形态的维持主要靠包埋介质。现有技术中所用的明胶也不适用于组织的冰冻切片。冰冻切片的眼球的填充剂和包埋介质一般熔点比较低，低于0摄氏度。目前比较常用的是oct。而且对于非冰冻切片来说，明胶也不是常用的填充剂和包埋介质。比较常用的是石蜡和塑胶，效果比明胶好。
实施例4
本发明技术方案也可用于没有固定眼球的冰冻切片的制备。基本步骤如下：
1)将处死小鼠眼球放入用pbs缓冲液稍微润洗一下，用吸水纸吸取眼球表面多余的pbs缓冲液。
2)在解剖镜下，让眼球的眼杯口朝下，巩膜朝上，在巩膜上涂上一层以α-氰基丙烯酸乙酯为主的胶水或者其他速凝的胶水。等胶水凝固后会形成一层质地比较硬的保护壳，可以防止在后续的操作过程中很好地避免眼球形变引起的视网膜与rpe层的脱离以及感光细胞外节与内节连接处的断裂。
3)待巩膜表面的胶水凝固后，把眼球翻转过来，让角膜朝上。用解剖剪剪去角膜，取出晶体。
4)把去除角膜和和晶体的眼杯放入装有包埋液(oct)的包埋盒中，然后放入-80度冰箱中进行深度速冻。
5)用冰冻切片机把组织切成适当厚度的切片。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
1.一种改进小鼠眼球冰冻切片的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将小鼠眼球置于固定液中在冰温条件下固定10min；
2)在小鼠眼球的角膜剪小口，置于固定液中在冰温条件下固定2h；
3)洗去小鼠眼球上的固定液，在4℃条件下脱水过夜；
4)取出小鼠眼球，在巩膜上涂抹一层胶水；
5)待巩膜表面的胶水凝固后，剪去角膜，取出晶体；
6)将去除的角膜和晶体的眼杯放入装有包埋液的包埋盒中，在－80℃条件下速冻；
7)用冰冻切片机把组织切成适当厚度的切片。
2.根据权利要求1所述的一种改进小鼠眼球冰冻切片的制作方法，其特征在于，步骤(1)所述的固定液为pbs缓冲液或多聚甲醛的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求2所述的一种改进小鼠眼球冰冻切片的制作方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液的浓度为0.1m，多聚甲醛的质量浓度为4％。
4.根据权利要求1所述的一种改进小鼠眼球冰冻切片的制作方法，其特征在于，步骤(3)中脱水采用pbs配备的蔗糖溶液，蔗糖溶液的质量浓度为30％。
5.根据权利要求1所述的一种改进小鼠眼球冰冻切片的制作方法，其特征在于，步骤(4)所述的胶水为以α-氰基丙烯酸乙酯为主的胶水。
6.根据权利要求1所述的一种改进小鼠眼球冰冻切片的制作方法，其特征在于，步骤(6)中的包埋液为oct。
技术总结