本发明属于组织切片技术领域，尤其涉及一种叶片切片包埋的方法和叶片制片方法。
背景技术：
观察叶片中的胼胝质，往往需要对鲜样进行快速切片和制片，防止在切片的过程中对小麦造成的机械伤害，诱导胼胝质含量的增加，增加试验误差。
制作切片所采用的方法可以分为：徒手切片法、石蜡切片法和冷冻切片法。虽然徒手切片不需要前期处理和机械设备，但在切片过程中，切片厚度一般为20-30μm，切片比较厚，而且徒手切片会导致切片厚薄程度不一、材料组织易碎，增加观察切片的难度；石蜡切片前需要进行脱水、透明、透蜡、包埋，切片的周期比较长，程序繁琐，效率低下。因此，现切片一般使用冷冻切片机进行切片。
冷冻切片技术的包埋技术对整个切片的质量至关重要，传统的包埋方法有：一、用厚纸板折成方形，里面铺一层锡箔纸，将样品放入盒子中，加入包埋剂，或者加入包埋剂后添加样品，但锡箔纸很难从从盒内取出；若是不加锡箔纸，等到冷冻后进行剥离纸板，剥离的过程中会因为手指的温度导致oct胶溶解，增加剥离难度。二、采用两层纸板，其中一层是铜纸，折成方形，上下镂空，用胶将一端固定在底座上，再加入样品和包埋剂，但这种方法在减裁掉盒体时比较麻烦，还要在减裁的过程中修剪包埋角块，且底座的胶体与样品柱上下一般整齐，很容易在后期切片时松动，降低试验效率。此外也有一些新型的包埋盒，类似于针管状，但这种包埋盒很难在切片机箱内的冷冻台上进行冷冻，增加了试验前期的步骤。这些包埋技术虽然在一定程度上提高了切片的质量，但在用时和废材上却存在着一定的瑕疵，影响了工作效率。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种叶片切片包埋的方法和叶片制片方法，采用本发明提供的叶片包埋的方法无需对小麦叶片进行前期处理，而且包埋需要的材料简单。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种叶片切片包埋的方法，包括：
将固定物卷成桶状，得到桶状物，将所述桶状物竖直放置，将oct胶置于桶状物内，当所述oct胶处于半液体时，将叶片垂直浸没于oct胶中，当所述oct胶完全凝固后，去掉固定物，得到柱形物，实现叶片切片包埋。
优选的，所述固定物包括铝箔纸，所述铝箔纸的长度为4～6cm，所述铝箔纸的宽度为0.8～1.2cm。
优选的，所述桶状物的直径大于叶片的宽度。
优选的，所述叶片的长度在1.2cm以内。
优选的，将所述桶状物竖直放置于载玻片上。
优选的，所述叶片包括小麦的叶片或玉米的叶片。
本发明还提供了一种叶片制片的方法，包括以下步骤：
1)采用上述技术方案所述的方法得到柱形物，将所述柱形物的一端在-15℃～-25℃下冷冻8～12min固定后，得到冷冻物；
2)将所述步骤1)得到的冷冻物在-20℃～-24℃下进行切片，得到叶片制片。
优选的，所述柱形物的一端用oct胶固定在样品钉上。
优选的，所述样品钉上滴入的oct胶的半径为柱形物半径的2～3倍。
优选的，所述叶片制片的厚度为10～15μm。
本发明提供了一种叶片切片包埋的方法，包括：将固定物卷成桶状，得到桶状物，将所述桶状物竖直放置，将oct胶置于桶状物内，当所述oct胶处于半液体时，将叶片垂直浸没于oct胶中，当所述oct胶完全凝固后，去掉固定物，得到柱形物，实现叶片切片包埋。采用本发明提供的叶片包埋的方法无需对小麦叶片进行前期处理，而且包埋需要的材料简单。
本发明还有一种叶片制片的方法，包括以下步骤：1)采用上述技术方案所述的方法得到柱形物，将所述柱形物的一端用oct胶与样品钉在-15℃～-25℃下冷冻8～12min固定后，得到冷冻物；2)将所述步骤1)得到的冷冻物在-20℃～-24℃下进行切片，得到叶片制片。本发明将柱形物的一端进行固定并进行冷冻，保证切片的厚度均一。
附图说明
图1-图17均为1000倍荧光显微镜下小麦叶片胼胝质；
图18-图24均为1000倍荧光显微镜下玉米叶片胼胝质。
具体实施方式
本发明提供了一种叶片切片包埋的方法，包括：将固定物卷成桶状，得到桶状物，将所述桶状物竖直放置，将oct胶置于桶状物内，当所述oct胶处于半液体时，将叶片垂直浸没于oct胶中，当所述oct胶完全凝固后，去掉固定物，得到柱形物，实现叶片切片包埋。
在本发明中，将oct胶置于桶状物内，1min后，oct胶处于半液体状态。
在本发明中，所述叶片优选包括小麦的叶片或玉米的叶片，所述叶片优选为处于生长状态的叶片。
在本发明中，所述固定物优选包括铝箔纸，所述铝箔纸的长度优选为4～6cm；所述铝箔纸的宽度优选为0.8～1.2cm。在本发明中，当所述叶片优选为玉米的叶片时，所述铝箔纸的长度优选为5～6cm。本发明优选使用圆柱体将固定物卷成桶状，本发明对圆柱体没有特殊限定，能够将固定物卷成桶状即可。在本发明中，所述桶状物的直径优选大于叶片的宽度。在本发明中，所述叶片的长度优选在1.2cm以内。
本发明优选将所述桶状物竖直放置于载玻片上，载玻片能够将所述桶状物的底端进行封闭，以防止漏胶。本发明优选使用塑料滴管吸取oct胶缓慢的填充桶状物的底部，且保持胶体不间断流下，待到底部发白时将胶体均匀的填充到桶状物中至胶体与筒状物的上沿齐平。本发明对所述oct胶的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明优选将所述叶片垂直浸没于oct胶的中心位置，将样品放于中心位置，是为了防止在切片的过程中，样品偏离中心点，导致样品边缘的切片成型度降低，降低试验效率。一般同时可根据叶片的大小调整圆柱锡纸的直径，且整个样品柱均可进行切片，在完整包裹叶片以及降低切片松动、减少剪切胶体，提高成型度的基础上，总体上减少了胶的使用量。当所述oct胶完全凝固后，本发明优选采用轻轻剥下的方式去掉固定物。
本发明还提供了一种叶片制片的方法，包括以下步骤：
1)采用上述技术方案所述的方法得到柱形物，将所述柱形物的一端固定后在-15℃～-25℃下冷冻8～12min，得到冷冻物；
2)将所述步骤1)得到的冷冻物在-20℃～-24℃下进行切片，得到叶片制片。
本发明优选将所述柱形物的一端用oct胶固定在样品钉上，所述样品钉上滴入的oct胶的半径为柱形物半径的2～3倍，本发明对所述样品钉没有特殊限定，采用常规即可。将所述柱形物固定在样品钉上不会导致柱形物在切片时松动，保证切片厚度的均一。
在本发明中，所述冷冻的时间为8～12min，优选为10min，冷冻时间过短，会导致oct胶与底座胶粘合间出现松动，导致柱形物样品松动；所述冷冻的温度为-15℃～-25℃，优选为-20℃。本发明优选将柱形物置于冷冻槽中进行冷冻。
为了防止切片过程中温度上升，oct可能会出现融解，导致胶底座胶体与圆柱胶体脱离，所以本发明将得到的冷冻物在-20℃～-24℃下进行切片，优选在-22℃下进行切片。在本发明中，所述叶片制片的厚度为10～15μm。
采用本发明提供的叶片切片包埋的方法和叶片制片的方法用来观察叶片组织中的胼胝质。本发明对观察所述叶片制片中的胼胝质采用常规的染色方法，观察方法采用荧光显微镜下，用紫外光作为激发光，在1000倍视野下观察切片。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取一块长为5cm，宽为1cm的铝箔纸，用一根直径为1cm的圆柱体将铝箔纸卷成桶状铝箔纸圈。
用镊子将桶状铝箔纸圈放置在载玻片上，将载破片放置在莱卡切片机左侧的冷冻区，用塑料滴管吸取oct植物组织胶均匀的填充到铝箔纸圈中至胶与纸圈上沿齐平。一分钟后胶液处于半液相时，取一段长为1cm以内的小麦叶片，轻轻的把叶片垂直插入胶液中心位置，使叶片完全浸没在胶液中。
待包裹叶片的胶液样品完全冷冻成固体后，轻轻的剥下外层的铝箔纸，沿着样品钉表面的螺旋状凹槽滴一层宽度为5cm的胶液，将样品用胶液垂直的粘着在样品钉上，将样品钉迅速放置在速冻槽，在-20℃下速冻10min，然后将样品台温度调至-22℃，把冷冻钉放置在样品台上，调节样品台与刀口的距离，至道口刚与样品接触为止。
将切片厚度调至30μm进行修片，根据切面倾角调节冷冻头与刀口的位置直至刀口与样品垂直。等到刀口切到小麦叶片时调整切片厚度到15μm，缓缓摇动手臂进行切片。前100个切片丢弃不取，之后每隔100个切片取一个样。取样时用左手拿干净的载玻片于切片机外，右手戴线手套拿放置在冷冻区的尖头镊子，用镊子尖轻轻的粘起切片边缘将其放置在载玻片上，然后将载玻片拿出切片机内室，镊子仍放回冷冻区。如此依次进行切片，每张载玻片放置6-9个切片为宜。之后将载玻片写上编号放置在直径为15cm的干净的玻璃培养皿中。
然后将切片采用常规进行溶胶、脱色、染色、观察，具体如下：
将装有载破片的培养皿放置在室内干燥，至少1h，使切片能与载玻片完全粘合在一起，防止水洗时切片脱落。之后用超纯水从侧壁缓缓注入培养皿中浸没所有的载玻片，使水溶性的oct胶液溶解，半小时换一次水，至载玻片上看不到残留的胶液为止。将水倒掉，用95％的酒精溶液从侧壁注入培养皿中浸没所有的载玻片，对叶片进行脱色，脱色时间可以适当延长，致使所有的叶片切片脱完绿色为止。再用超纯水洗两遍，洗去残留的酒精溶液。之后将配置好的0.1％的苯胺蓝溶液沿侧壁注入培养皿中浸没所有的载玻片，避光保存，染色过夜。待充分染色后将染色液倒掉，同样用超纯水洗去残留染色液，至载玻片上没有残留染色液为止。将载玻片放置在无尘区干燥。然后将载玻片放置在荧光显微镜下，用紫外光作为激发光观察切片。根据叶片组织大小合理设置标尺并拍照保存，结果见图1-17。
实施例2
取一块长为5-6cm，宽为1cm的铝箔纸，用一根直径为2cm的圆柱体将铝箔纸卷成桶状铝箔纸圈。
用镊子将其放置在载玻片上，将载破片放置在莱卡切片机左侧的冷冻区，用塑料滴管吸取oct植物组织胶均匀的填充到铝箔纸圈中至胶与纸圈上沿齐平。约一分钟后胶液处于半液相时，取一段长为1cm以内的玉米叶片，轻轻的把叶片垂直插入胶液中心位置，使叶片完全浸没在胶液中。
待包裹叶片的胶液样品完全冷冻成固体后，轻轻的剥下外层的铝箔纸，沿着样品钉表面的螺旋状凹槽滴一层宽度为6cm的胶液，将样品用胶液垂直的粘着在样品钉上，将样品钉迅速放置在速冻槽，在-20℃下速冻10min，然后将样品台温度调至-22℃，把冷冻钉放置在样品台上，调节样品台与刀口的距离，至道口刚与样品接触为止。
将切片厚度调至30μm进行修片，根据切面倾角调节冷冻头与刀口的位置直至刀口与样品垂直。等到刀口切到玉米叶片时调整切片厚度到15μm，缓缓摇动手臂进行切片。前100个切片丢弃不取，之后每隔100个切片取一个样。取样时用左手拿干净的载玻片于切片机外，右手戴线手套拿放置在冷冻区的尖头镊子，用镊子尖轻轻的粘起切片边缘将其放置在载玻片上，然后将载玻片拿出切片机内室，镊子仍放回冷冻区。如此依次进行切片，每张载玻片放置6-9个切片为宜。之后将载玻片写上编号放置在直径为15cm的干净的玻璃培养皿中。
然后将切片进行溶胶、脱色、染色、观察，具体如下：
将装有载破片的培养皿放置在室内干燥，至少1h，使切片能与载玻片完全粘合在一起，防止水洗时切片脱落。之后用超纯水从侧壁缓缓注入培养皿中浸没所有的载玻片，使水溶性的oct胶液溶解，半小时换一次水，至载玻片上看不到残留的胶液为止。将水倒掉，用95％的酒精溶液从侧壁注入培养皿中浸没所有的载玻片，对叶片进行脱色，脱色时间可以适当延长，致使所有的叶片切片脱完绿色为止。再用超纯水洗两遍，洗去残留的酒精溶液。之后将配置好的0.1％的苯胺蓝溶液沿侧壁注入培养皿中浸没所有的载玻片，避光保存，染色过夜。待充分染色后将染色液倒掉，同样用超纯水洗去残留染色液，至载玻片上没有残留染色液为止。将载玻片放置在无尘区干燥。然后将载玻片放置在olympus-ix71倒置式荧光显微镜下，用紫外光作为激发光观察切片。根据叶片组织大小合理设置标尺并拍照保存，结果见图18-24。
由以上实施例可以得出，采用本发明提供的方法不需要对叶片进行前期处理，所需要的材料简单，在固定叶片过程中所需要的oct胶比较少，圆柱体根据样品的大小进行调整圆柱形锡薄纸的直径，能够完全包埋样品，减少切片过程中因未完全包埋而产生的撕裂叶片的可能性，同时整个滴胶的过程中是连续的过程，降低了胶体中气泡的产生，使之能与样品完全贴合，切出来的切片成型度高，且操作简单，能够直接在切片机的冷冻台上进行，同时加固了底座与样品之间的牢固度，还可以根据样品的不同，适当的调节大小，降低了试验繁琐的步骤和缩短了切片的前期处理时间，提高了效率。
而且本发明提供的方法所需要的材料比较普遍，有锡箔纸、载玻片、塑料胶头滴管、尖头镊子、圆柱体。可根据叶片的宽度选择合适圆柱体，调节圆柱形锡箔纸的的直径，直接在冷冻切片机内进行，由于圆柱形锡箔纸放于载玻片上，加oct胶的时候不易倾斜，易剥离；叶片直接从植株上现剪现用，保持了叶片的新鲜度，减少了前期处理过程；且切片薄度均匀，叶片的破碎程度低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种叶片切片包埋的方法，其特征在于，包括：
将固定物卷成桶状，得到桶状物，将所述桶状物竖直放置，将oct胶置于桶状物内，当所述oct胶处于半液体时，将叶片垂直浸没于oct胶中，当所述oct胶完全凝固后，去掉固定物，得到柱形物，实现叶片切片包埋。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定物包括铝箔纸，所述铝箔纸的长度为4～6cm，所述铝箔纸的宽度为0.8～1.2cm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述桶状物的直径大于叶片的宽度。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述叶片的长度在1.2cm以内。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述桶状物竖直放置于载玻片上。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述叶片包括小麦的叶片或玉米的叶片。
7.一种叶片制片的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用权利要求1～6任一项所述的方法得到柱形物，将所述柱形物的一端在-15℃～-25℃下冷冻8～12min固定后，得到冷冻物；
2)将所述步骤1)得到的冷冻物在-20℃～-24℃下进行切片，得到叶片制片。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述柱形物的一端用oct胶固定在样品钉上。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述样品钉上滴的oct胶的半径为柱形物半径的2～3倍。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述叶片制片的厚度为10～15μm。
技术总结