本发明具体涉及一种高得率高活性的单细胞分选方法。
背景技术：
利用流式细胞分选仪进行目标细胞群的纯化是目前较为常用的实验方法，尤其是多参数确定的细胞群，分选是最好的纯化方法。纯度、得率和活性是评估分选后细胞的主要指标，尤其随着单细胞研究的进一步发展，对分选的得率(孔板分选，尤其是稀有细胞)和活性提出了更高的要求。
通过查阅文献和实验验证，影响分选纯度的因素可以有效的控制，所以提高分选得率和活性尤为关键。andrewriddell等发明了一种通过检测中心液流中目标颗粒数来计算目标颗粒的得率方法，计算出的最大得率为76.41％和82.68％，尚有提升空间。确保最高得率的条件下，分选后细胞的活性直接决定细胞的增殖情况和单克隆的形成率，最关键的是分选后的细胞活性达不到单细胞测序仪的要求(85％)，已成为单细胞测序实验中的一大障碍。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种高得率高活性的单细胞分选方法。该方法采用流式细胞分选仪获取单细胞或细胞群体，(1)分选后的稀有细胞的单细胞能够高效率地形成单克隆，或者通过分选直接获得更多有效的单细胞基因数据；(2)分选后的细胞群体活性完全符合单细胞测序要求，解决了多参数筛选细胞群体的瓶颈问题。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种高得率高活性的单细胞分选方法，包括以下步骤：
(1)jurkat细胞培养：jurkat细胞培养于含体积分数为10％fbs和体积分数为1％p/s双抗的rpmi-1640培养基中，37℃，体积分数为5％co2孵箱培养，隔天换液，待细胞长至80％时，弃掉4/5体积的细胞悬液，并加入等体积新鲜培养基，依此方法进行细胞传代；
(2)jurkat细胞染色：取步骤(1)得到的jurkat细胞悬液，300g离心去上清，加0.5ml新鲜培养基重悬后，荧光染料cfse染色，室温下避光染色20分钟，然后37℃下horchest33342避光染色5分钟；离心去上清，pbs缓冲液重悬并用40μm细胞筛过滤，后获得双重染色的jurkat细胞，用于分选；
(3)单细胞分选条件的设定：液滴延迟的校准：先利用仪器自动计算液滴延迟的方法找到液滴延迟值，再进一步利用手动调节液滴延迟的方法校正液滴延迟值，直至完全符合最佳液滴延迟的条件，即在不同的液滴延迟值下连续取10滴液滴，第五滴液滴中目标颗粒最多，且仅有第五滴液滴中有目标颗粒，我们将这时的液滴延迟值确定为最佳液滴延迟，在这个条件下进行单细胞分选；并且设定分选条件：100μm喷嘴，鞘液压力30psi，样品压力和鞘液压力差0.3psi，纯度模式选择single，dropenvelope选择0.5；调节仪器光路，qc检测通过，按照上述方法计算出液滴延迟，将分选仪调节至96孔板和1536孔板单细胞分选的sd无电分选模式，并利用分选仪预先将鞘液铺满孔板，校正分选位置后，取步骤(2)双重染色的jurkat细胞的细胞悬液进行分选，1536孔板中每孔分选1个细胞。
进一步地，还包括单细胞得率鉴定：单细胞分选至1536孔板后分别用多孔板细胞成像仪的蓝光和绿光扫描1536孔板的每一个孔，并成像记录，用双重荧光确认每一孔里的细胞情况，有仅有一个双重染色的细胞时认为是成功分选出一个单细胞，记为1，其他孔记为0，统计单细胞得率。
进一步地，还包括单细胞活力鉴定：单细胞分选至96孔板，置于二氧化碳培养箱中继续培养，观察单克隆形成情况；根据单细胞的单克隆形成情况分析单细胞活力。
进一步地，单细胞得率鉴定中，采用biotekcytation1多孔板细胞成像仪。
进一步地，单细胞活力鉴定中，用接收液接收分选后的细胞，接收液为rpmi-1640培养基加体积分数为10％fbs。
高得率高活性单细胞在单细胞测序中的应用，所述高得率高活性单细胞为采用以上所述的分选方法得到。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的单细胞分选方法采用流式细胞分选仪获取单细胞或细胞群体，能够得到高得率高活性的单细胞，1536孔板的得率为53％，96孔板得率(以单克隆形成数计算)为91.6％；分选得到的单细胞活力高，96孔板单克隆形成率高达91.6％；分选后的单细胞能够高效率地形成单克隆，而且通过分选能够直接获得更多有效的单细胞基因数据；分选后的细胞群体活性完全符合单细胞测序要求，解决了多参数筛选细胞群体的瓶颈问题。
(2)本发明的单细胞分选方法，具有较高的单细胞得率和较高的细胞活性，高得率有利于稀有细胞和珍贵细胞的分选，高活性能够保证以上所述细胞的存活率，解决了多参数特定目标细胞群体的纯化问题。
附图说明
图1为荧光微球在自动液滴延迟下和手动校正液滴延迟下的得率。
图2为r-max方法分选cst荧光微球中中等荧光强度和高等荧光强度的两群微球的r-max值和纯度。
图3为四种实验条件下液滴延迟偏离0.3的情况下得率下降率统计图。
图4为不同接收液接收的细胞凋亡实验结果图。
图5为四种不同接收液接收分选后细胞的增殖实验结果图。
图6为优化条件下，1536孔板高通量分选单细胞的得率统计结果图。
图7为优化条件下，96孔板单细胞分选后形成单克隆图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。
以下实施例中所用到的细胞、化学物质、试剂、仪器等均能够通过商业途径购得。
本发明利用流式细胞分选仪获取高得率高活性单细胞的分选方法，包括如下步骤：
具体实施例中，采用的流式细胞分选仪型号为astriosmofloeq(beckmancoulter)；
(1)jurkat细胞培养：jurkat细胞(jurkat细胞通过商业途径购买得到，美国供应商atccmanassasva，本发明的单细胞分选方法不限于jurkat细胞，本发明的分选方法还可以用于其他单细胞的分选)培养于含体积分数为10％fbs和体积分数为1％p/s双抗(即penicillin-streptomycin双抗)的rpmi-1640培养基中，37℃，体积分数为5％co2孵箱培养，隔天换液，3天传代，弃掉4/5体积的细胞悬液，并加入相同体积的新鲜培养基，依此方法进行细胞传代；新鲜培养基为：含体积分数为10％fbs和体积分数为1％p/s双抗的rpmi-1640培养基，此方法指的是：弃掉4/5体积的细胞悬液，并加入相同体积的新鲜培养基；
(2)jurkat细胞染色：取5ml步骤(1)得到的jurkat细胞悬液，离心速度为300g，离心去上清，加0.5ml新鲜培养基(即含体积分数为10％fbs和体积分数为1％p/s双抗的rpmi-1640培养基)重悬后，1μl稀释后的荧光染料cfse染色(具体地，先用ph为7.2-7.4的pbs缓冲液稀释荧光染料cfse，cfse和pbs缓冲液的体积比为1：1000，稀释之后再进行染色，稀释之后荧光染料cfse的浓度为5μmol/l)，室温下避光染色20分钟，然后37℃下horchest33342避光染色5分钟(采用的是碧云天生物技术有限公司的hoechst33342活细胞染色液(100x)试剂盒，直接稀释100倍后使用)；离心去上清，pbs缓冲液(其ph为7.2-7.4)重悬并用40μm细胞筛过滤后获得双重染色的jurkat细胞，用于分选；
(3)单细胞分选条件的设定：液滴延迟(dropdelay)的校准：为确保单细胞得率，本发明在仪器自动计算液滴延迟的基础上利用手动调节功能进行进一步调节，直至完全符合最佳液滴延迟的条件，仪器默认不同液滴延迟值之间的间隔是1，得到不同的液滴延迟值，在每个液滴延迟值下取1滴，连续取10滴液滴；分选的10滴液滴中，第五滴液滴中的荧光微球为50个，且第四滴和第六滴中荧光微球数为0，认为此时的液滴延迟为最佳值，即第五滴液滴对应的液滴延迟值为最佳液滴延迟值，以下实验均在最佳液滴延迟的条件下进行。
仪器具有自动计算液滴延迟值的功能，仪器默认不同液滴延迟值的间隔是1，在每个液滴延迟值下取1滴，连续取10滴液滴，一般情况下，第五滴液滴中荧光微球最多，第四滴液滴、第六滴液滴中会有两个或几个荧光微球，此时需要将第四滴、第六滴里的荧光微球数输入至仪器软件中，仪器会根据这个数值继续计算液滴延迟，直到第五滴液滴中有50个荧光微球，第四滴液滴、第六滴液滴里没有荧光微球，第五滴液滴对应的液滴延迟值为最佳液滴延迟值。
比如，10个不同的液滴延迟值分别为27.6，28.6，29.6，30.6，31.6，32.6，33.6，34.6，35.6，36.6，其中第五滴液滴中的荧光微球为50个，且第四滴和第六滴中荧光微球数为0，则第五滴液滴对应的液滴延迟值为最佳液滴延迟值，为31.6。图1为荧光微球在自动计算液滴延迟下和手动校正液滴延迟下的得率，其中，横坐标为液滴延迟值，纵坐标为分选得率，auto曲线表示自动计算液滴延迟下的得率，manual曲线表示手动校正液滴延迟下的得率，如图1所示，在手动校正液滴延迟条件下的得率高于自动计算液滴延迟条件下的得率。
先利用仪器自动计算液滴延迟的方法计算出液滴延迟值，并分别人为设置间隔0.1、0.2和0.3，手动调节液滴延迟值，每个液滴延迟值下收集约50个荧光微球(由于液滴延迟值的偏离，实际收集到的荧光微球数会少于50个荧光微球)，显微镜下观察拍照计数，计算得率。结果显示，液滴延迟对得率影响非常大，液滴延迟值相差0.3，得率差异超过20％，如图3所示；图3是四种实验条件中，与仪器自动计算的液滴延迟值相比偏离0.3的情况下得率下降率统计图；通过这幅图可以看到在四种实验条件下，当液滴延迟偏离0.3时，分选得率会下降15％-30％，液滴延迟会影响分选得率。
荧光微球分选：100μm喷嘴，鞘液压力30psi，样品压力和鞘液压力差0.3psi，纯度模式选择purity，dropenvelope选择1。调节仪器光路，qc检测通过，按照上述方法计算出液滴延迟，按照文献报道的方法(riddell,gardneretal.2015，asystematicapproachtoevaluateinstrumentsortperformanceusingcenterstreamcatch)分别接收目标微球和中心液流后，利用流式细胞分析仪检测收集液中微球的比例，计算r-max值。目标微球是指粒径为3μm中等荧光强度和高等荧光强度的微球；中心液流是指分选过程中的废液。
图2是r-max方法分选cst荧光微球中中等荧光强度和高等荧光强度的两群微球的r-max值和纯度。cst荧光微球是bd流式细胞分选仪的校正微球，共有3群不同大小和荧光强度的荧光微球组成。图2(a)为分选收集的两群微球和中心液流的流式分析图，其中sample表示cst微球；csc表示中心液流；mid为中等荧光强度微球；bright表示高等荧光强度微球；delay为液滴延迟，其中液滴延迟值分别为30.96，31.26；pe和fitc指的是用于流式细胞分选仪分析的荧光素名称，pe是红色，488nm或561nm激光器激发，吸收波长为575nm，fitc是绿色，488nm激光器激发，吸收波长为513nm；dim指的阴性细胞群；rmax指的是得率，图2(b)为根据流式细胞分选仪分析的数据统计分选的纯度和得率图，其中，横坐标为液滴延迟值，纵坐标为得率的百分比，纯度的百分比，brightpurity表示高等荧光强度微球的纯度，midpurity中等荧光强度微球的纯度，两曲线几乎重合，由图2可以看出，液滴延迟的偏移对分选得率的影响很大，但对纯度几乎没有影响；r-max方法分选cst荧光微球中中等荧光强度和最高荧光强度的两群微球；得率分别为97％和95.7％，r-max值为92.5％，本发明得到的r-max值优于文献报道的值，说明采用本发明的分选方法得到了更高的分选得率。
单细胞分选：在以上所述的最佳液滴延迟的条件下进行单细胞分选。并且设定分选条件：100μm喷嘴，鞘液压力30psi，样品压力和鞘液压力差0.3psi，纯度模式选择single，dropenvelope选择0.5。调节仪器光路，质控检测(qc检测)通过，按照上述方法计算出液滴延迟，将分选仪调节至96孔板和1536孔板单细胞分选的sd无电分选模式，并利用分选仪预先将鞘液铺满孔板，校正分选位置后，取步骤(2)双重染色的jurkat细胞的单细胞悬液进行分选，1536孔板中每孔分选1个细胞。
(4)单细胞得率鉴定：单细胞分选至1536孔板后分别用biotekcytation1多孔板细胞成像仪的蓝光和绿光扫描1536孔板的每一个孔，并成像记录。用双重荧光确认每一孔里的细胞情况，有仅有一个双重染色的细胞时认为是成功分选出一个单细胞，软件记为1，其他孔记为0，数据统计分析单细胞得率。1536孔板的得率为53％。96孔板分选单细胞后继续培养，一周后通过计数形成单克隆数目计算分选得率。96孔板得率(以单克隆形成数计算)为91.6％。
(5)单细胞活力鉴定：单细胞分选至96孔板后，置于二氧化碳培养箱中继续培养，一周左右显微镜下观察单克隆形成情况。根据单细胞的单克隆形成情况分析单细胞活力。检测细胞活性实验的分选接收液为rpmi-1640培养基加体积分数为10％fbs。分选得到的单细胞活力高，96孔板单克隆形成率高达91.6％。
分选后细胞的检测
(1)分选后细胞的凋亡率检测：取分选后不同接收液接收的细胞，离心速度300g离心3分钟，弃上清，500μl染色缓冲液(bindingbuffer，现有的细胞凋亡检测试剂盒中自带的染色缓冲液，采用的试剂盒为：annexinv-fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒，产品编号c1062m，试剂盒自带annexinv染料，bindingbuffer，pi染料)重悬，离心速度300g离心3分钟，100μl染色缓冲液重悬，加5μlannexinv染料避光染色15分钟后，加400μl染色缓冲液，上机检测前加1μl稀释后的pi染料(其中，pi染料用pbs缓冲液稀释，pi染料与pbs缓冲液的体积比为1：100，pbs缓冲液的ph为7.2-7.4)，用双荧光通道检测细胞凋亡情况。
图4为不同接收液接收的细胞凋亡实验结果。具体地，分别用rpmi-1640培养基、rpmi-1640培养基加体积分数为10％胎牛血清(fbs)、rpmi-1640培养基加体积分数为50％fbs和体积分数为100％fbs接收10万分选后的细胞，凋亡试剂染色的结果图及凋亡率统计结果如图4所示，图4(a)-图4(d)分别是四种不同接收液收集分选后细胞经细胞凋亡检测试剂盒染色后的流式分析检测图；图4(e)为四种不同接收液收集分选后细胞的细胞凋亡率的统计图。由图4可以看出添加fbs后，可以明显降低分选后细胞的凋亡率，但体积分数为10％fbs、50％fbs和100％fbs之间差异不显著。
(2)分选后细胞的增殖检测：
分别取分选后不同接收液接收的细胞，计数后，按每孔2000个细胞接种于96孔板中，并加入10μlcck8试剂，分别在铺板时即0小时、24小时和48小时读取450nm的od值，画增殖曲线，统计细胞增殖情况。
图5为四种不同接收液接收分选后细胞的增殖实验结果图；具体地，分别用rpmi-1640培养基(用a表示)、rpmi-1640培养基加体积分数为10％fbs(胎牛血清)(用b表示)、rpmi-1640培养基加体积分数为50％fbs(用c表示)和100％fbs(用d表示)接收分选后的细胞；计数，接种后加cck8试剂，分别在24小时和48小时读取450nm的od值，统计细胞增殖情况，由图5可以看出，接收液中添加fbs后可以提高分选后细胞的增殖能力。
图6为优化条件下，1536孔板高通量分选单细胞得率和纯度的统计结果。图6中，纵坐标是得率百分比和纯度的百分比，purity1，purity2，purity3分别是三次实验的纯度，三条曲线重合在一起了；横坐标表示：与最佳液滴延迟值相比，偏离多少，比如0.0表示与最佳液滴延迟值相比，偏离0，0.2指的是与最佳液滴延迟值相比，偏离0.2，yield1，yield2，yield3分别表示三次实验的得率。由图6可以看出，在进行高通量分选时，也表现出了液滴延迟影响孔板分选得率的现象，1536孔板的得率为53％。图7为优化条件下，96孔板单细胞分选后形成的单克隆图；优化条件后，每96孔板可得88孔单细胞，且在7天内形成单克隆，如图7所示；优化条件具体指的是，采用以上所述方法找到最佳液滴延迟值，在最佳液滴延迟值下进行实验，选用的接收液为rpmi-1640培养基加体积分数为10％fbs，并且调整液滴落下的位置，使其落在孔板每个孔的中央。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
1.一种高得率高活性的单细胞分选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)jurkat细胞培养：jurkat细胞培养于含体积分数为10％fbs和体积分数为1％p/s双抗的rpmi-1640培养基中，37℃，体积分数为5％co2孵箱培养，隔天换液，3天传代，弃掉4/5体积的细胞悬液，并加入等体积新鲜培养基，依此方法进行细胞传代；
(2)jurkat细胞染色：取步骤(1)得到的jurkat细胞悬液，300g离心去上清，加0.5ml新鲜培养基重悬后，荧光染料cfse染色，室温下避光染色20分钟，然后37℃下horchest33342避光染色5分钟；离心去上清，pbs缓冲液重悬并用40μm细胞筛过滤，后获得双重染色的jurkat细胞，用于分选；
(3)单细胞分选条件的设定：液滴延迟的校准：先利用仪器自动计算液滴延迟的方法找到液滴延迟值，再进一步利用手动调节液滴延迟的方法校正液滴延迟值，直至完全符合最佳液滴延迟的条件，即在不同的液滴延迟值下连续取10滴液滴，第五滴液滴中目标颗粒最多，且仅有第五滴液滴中有目标颗粒，我们将这时的液滴延迟值确定为最佳液滴延迟值，在这个条件下进行单细胞分选；并且设定分选条件：100μm喷嘴，鞘液压力30psi，样品压力和鞘液压力差0.3psi，纯度模式选择single，dropenvelope选择0.5；调节仪器光路，qc检测通过，按照上述方法计算出液滴延迟，将分选仪调节至96孔板和1536孔板单细胞分选的sd无电分选模式，并利用分选仪预先将鞘液铺满孔板，校正分选位置后，取步骤(2)双重染色的jurkat细胞的细胞悬液进行分选，1536孔板中每孔分选1个细胞。
2.如权利要求1所述的一种高得率高活性的单细胞分选方法，其特征在于，还包括单细胞得率鉴定：单细胞分选至1536孔板后分别用多孔板细胞成像仪的蓝光和绿光扫描1536孔板的每一个孔，并成像记录，用双重荧光确认每一孔里的细胞情况，有仅有一个双重染色的细胞时认为是成功分选出一个单细胞，记为1，其他孔记为0，统计单细胞得率。
3.如权利要求1所述的一种高得率高活性的单细胞分选方法，其特征在于，还包括单细胞活力鉴定：单细胞分选至96孔板，置于二氧化碳培养箱中继续培养，观察单克隆形成情况；根据单细胞的单克隆形成情况分析单细胞活力。
4.如权利要求2所述的一种高得率高活性的单细胞分选方法，其特征在于，单细胞得率鉴定中，采用biotekcytation1多孔板细胞成像仪。
5.如权利要求3所述的一种高得率高活性的单细胞分选方法，其特征在于，单细胞活力鉴定中，用接收液接收分选后的细胞，接收液为rpmi-1640培养基加体积分数为10％fbs。
6.高得率高活性单细胞在单细胞测序中的应用，其特征在于，所述高得率高活性单细胞为采用权利要求1-5任一项所述的分选方法得到。
技术总结