本发明涉及一种组织学图像的自动化图案识别和评分方法。
背景技术：
非酒精性脂肪性肝炎(nash)的发病率正在快速增长，并且代表了重要的公共卫生问题，因为已知nash会驱动进行性纤维化积累，最终导致肝硬化和肝细胞癌(hcc)。
尽管可以通过使用超声技术检测肝脏中脂肪堆积的存在来诊断非酒精性脂肪性肝病(nafld)，但nash和与nash相关的肝纤维化当前只能通过对肝组织活检的组织学检查来诊断。已经开发了组织学评分/分期系统，用于评估nafld活动水平和纤维化分期并估算演变为临床肝结果的风险。已开发了nalfd活动评分(nas)用于评估所述疾病的活动。
所述nas是活检组织的脂肪变性(0到3)、小叶炎症(0到2)、肝细胞气球样变(0到2)的各个评分的总和，或者是未加权的各个活检组织的各个评分的总和。
根据kleiner等(hepatology,2005；41:1313-21)(kleiner等，2005)，nas是从肝活检组织切片做出的三种组织学评分的总和：
-脂肪变性评分：0：<5％；1：5-33％；2：34-66％和3：>66％
-小叶炎症评分(每个20x视野的病灶数)：0：无；1：<2；2：2-4和3：>4
-气球样变变性评分：0：无；1：少量；2：许多。
使用这种评分系统，nash患者具有nas≥3，并在脂肪变性中具有至少1分，在小叶炎症中具有至少1分，且在肝细胞气球样变中具有至少1分。当nas≥4，并在脂肪变性中具有至少1分，在炎症中具有至少1分且在肝细胞气球样变中具有至少1分时，患者被认为具有活跃的nash。
在组织学检查时纤维化的定位和程度标志着疾病的严重性(进展)，并且nash-crn已开发了一种专用的纤维化分期系统(kleiner等，hepatology,2005；41:1313-21)。
使用这种纤维化分期系统，没有纤维化或具有极少纤维化(f＝0-1)的患者通常不被认为处于肝硬化、hcc或肝死亡的风险下。具有显著纤维化(f＝2)和中度纤维化(f＝3)的患者处于发生肝硬化、肝功能衰竭、hcc和肝死亡的提高的风险下。具有代偿性肝硬化的患者具有重度纤维化(f＝4)，并处于肝功能衰竭(失代偿性肝硬化)、hcc和肝脏死亡的高风险下。
源自于这两种被广泛接受的评分和分期系统，最近对活动性指数(ai)给予了特别关注，其可以被定义为小叶炎症评分和肝细胞气球样变评分的总和。此外，munteanu等，alimentpharmacolther.,2016,44(8):877-89(munteanu等，2016)提出了saf特征，以分开地报告脂肪变性、疾病活动性和纤维化的评分。所述脂肪变性评分(s)评估除了泡沫状微囊泡之外的大尺寸或中尺寸脂类小滴的数量，并分级为从0至3(s0：<5％；s1：5–33％，轻度；s2:34–66％，中度；s3：>66％，显著)。活动性等级(a，从0至4)是肝细胞气球样变(0–2)和小叶炎症(0–2)的未加权的加和。具有a0(a＝0)的情况没有活动性；a1(a＝1)具有轻度活动性；a2(a＝2)具有中度活动性；a3(a＝3)具有重度活动性，并且a4(a＝4)具有极重度活动性。纤维化分期(f)使用由kleiner所描述的评分如下进行评估：0期(f0)＝无；1期f1)＝1a或1b窦周第3区或1c门纤维化；2期(f2)＝窦周和门周纤维化但没有桥接；3期(f3)＝桥接纤维化，4期(f4)＝肝硬化。
brunt系统主要作为对nash的严重性进行评级的方法被提出，并且不打算应用于不满足脂肪性肝炎的最低标准的情况。将脂肪性肝炎评级为轻度、中度和重度是基于对脂肪变性、炎症和气球样变的严重性的总体印象，但大多数权重被提供给气球样变(brunt等，1999)。
这些系统之间各个组织学特点的评级和分期的比较示出在表1中。
表1：nafld/nash分级和分期系统的必需要素的比较(kleiner&makhlouf,2016)。
病理学是一门涉及用于诊断、研究或其他目的的组织样品的实验室检查的科学领域。病理学家以及从事医学或生物学研究的其他人员，将检查人类、动物、植物区系或其他的组织，以评估疾病状态或了解生物学特点。在病理学的一个方面，用于分析的样品从患者活体取样，并固定在载玻片上以在光学显微镜下观察。然而，由于各种原因，这种形式的组织评估是敏感的。例如，一些这样的缺点包括主观性和低通量。另一个问题是高质量的诊断通常需要分析多个样本，这对于单个读取者来说是一个挑战。面对许多类似样品的人工读取者也可能经历疲劳，加剧了读数的不一致性。
尝试量化组织学特点评估中观察者变异性的几项研究，得出纤维化等级具有中等到实质性一致性的结论。此外，肝细胞炎症和气球样变在病理学家之间没有良好的一致性，导致在整体病理诊断上观察者间的一致性为63％(younossi等，1998)。在相当均等的患者组(进行减肥手术的病态肥胖症患者)中nash的患病率的回顾性分析得出的结论是，基于在手术时获得的手术活检组织的组织病理学分析，nash患病率从24％到98％不等(machado等，2006)。
病理学家评分是基于活检组织切片中微观/宏观组织学图案的解释。目前用于为这些临床参数评分的标准仍然是由病理学家或受过训练的组织学家对肝活检组织切片进行的人工解释和评分。除了冗长(例如气球样变)之外，已知人工评分具有中等的观察者间一致性(脂肪变性：κ(一致性系数)＝0.6，炎症：κ＝0.5，气球样变：κ＝0.7，纤维化：κ＝0.5)(bedossa，2014)，这主要是因为组织学图案的解释中的主观性。
当单独考虑每个参数时，这种偏倚会进一步增强：
i)肝细胞气球样变：对于这种不常见的事件，由于非穷举性筛选，某些细胞可能被错过。对通常用于区分气球样变前的肝细胞(小细胞)和完全变形的气球样变的肝细胞(大细胞)的细胞大小也是做出主观性评估。
ii)肝脏或肝细胞小叶炎症：由hpf(高倍视野)的选择造成的主观性使得评分过程难以重现并暴露于潜在的偏倚。
iii)肝纤维化：肝纤维化的评估也具有挑战性，这是由于1)组织病理学因素对胶原比例面积(cpa)定量的影响，和2)纤维化分期的人类主观性解释(中等的观察者间一致性(bedossa，2014)。cpa定量要求对于染色变异性(基本上由组织学和成像造成)以及排除胶原的非病理性染色(血管区域)来说稳健的方法。
iv)脂肪变性：含有细胞内脂肪泡的肝细胞的比例的目测估算和将脂肪变性分级在宽广的严重性范围内是相当主观的，所述严重性范围包括：0级(正常)＝至多5％的细胞受影响，1级(轻度)＝5-33％的细胞受影响，2级(中度)＝34-66％的细胞受影响，3级(重度)＝≥67％的细胞受影响，在组织病理学中脂肪变性分级存在相当大的个体间和个体内变异性。
此外，迫切需要全自动方法来解决当前的准确性、可重复性和通量问题。在全载片成像(wsi)系统普及用于临床和研究应用后，近年来应用于组织病理学数据的机器学习应用程序的开发已成为非常活跃的研究领域(lecun等，2015)。最近已显示深度学习(dl)图案识别算法能够准确捕获微观和宏观组织图案两者，并且模拟病理学家的诊断工作流程。使用这类技术，可以自动预测组织学图案，并且可以提高nash诊断和肝纤维化评分的可重复性。此外，nash特异性纤维化组织学图案的识别可以更准确地定量胶原形态(隔膜)和比例面积(cpa)。
技术实现要素：
为了使nash组织学解释完全自动化，本发明人建立了一种集成的自动化数据管理和分析流程，用于nash疾病活动性、nash纤维化评分和肝纤维化的评估。他们开发了一种稳健的染色归一化方法，以补偿从低到重要的组内和组间染料强度变异性。本发明人还通过三种独特的全自动机器学习应用程序对dl和形态计量学分析的用途进行了调查，以实现nash评分(炎症、气球样变和纤维化)的自动化。在分析中还进一步包括了使用图像分析方法进行的脂肪变性定量，以完成nafld诊断和nash评分的自动化过程。所述脂肪变性定量方法可以是dl方法。
考虑到每个临床参数的不同病理学和组织学本质，本发明人进行了开发过程，并将其导入到单独的分析流程中：
i.预处理(视野(fov)提取、组织分割、归一化)。
ii.预测nash的病理性微管/宏观图案dl(炎症、气球样变的细胞/肝纤维化fov类型)并定量脂肪变性面积。
iii.数据汇总到活检组织水平。
将独立的群组用于开发、测试和校验，评估了每个nash临床组分的定量流程的泛化性能。最终目标是将微观/宏观预测和定量(cpa/隔膜形态学)转换为临床相关信息，并针对参考病理学家注释进行校验。
因此，本发明提供了来自于肝活检组织的免疫化学图像的一种稳健的自动化图案识别方法和评分方法。
这些方法是基于通过三个独特的全自动机器学习应用程序进行的深度学习和形态计量学分析，以使关键的nash单个参数评分(炎症、气球样变和纤维化)自动化。所述方法还可以使用第四个全自动应用程序来完成，以实现脂肪变性定量的自动化。
在本发明的方法中，肝细胞气球样变(hb)通过使用dl以预测病理学相关的细胞图案(即气球样变的肝细胞、细胞大小)来评估。在第二步中，可以将这些预测在肝活检组织样品水平上汇集。
在本发明的方法中，小叶炎症(li)通过使用dl以预测病理学相关的细胞图案(即炎性细胞)来评估。在第二步中，可以将这些预测在肝活检组织样品水平上汇集。
在本发明的方法中，纤维化通过使用dl以预测病理学相关的肝纤维化区域来评估，所述纤维化区域可以被进一步确认，特别是通过随后的cpa和纤维化隔膜形态学定量。纤维化评分可以允许进行纤维化的临床预后，这是在通过本发明的自动化读取和评分方法获得的肝纤维化的稳健评分的基础上对nafld或nash患者的肝纤维化演变成肝硬化和肝脏结果的风险的预后。
在本发明的方法中，脂肪变性(s)评估可以是自动化过程，特别是通过使用dl模型来预测病理学相关的细胞结构。这种模式可以是含有脂质泡的脂肪性肝细胞或脂肪变性区域(aos)的百分率。所述脂肪变性区域是泡状结构。在特定实施方式中，所述泡的大小至少为细胞核的大小。在特定实施方式中，脂肪变性通过脂肪变性区域的自动测量来评估。在第二步中，可以将这些预测在肝活检组织样品水平上汇集。
对于所有机器学习应用程序来说，每个dl模型的特性都经过精密设计，以产生客观、准确和可重复的结果。
因此，在特定实施方式中，对象中肝细胞气球样变的检测和定量是基于图案识别和评分：hb＝0，无肝细胞气球样变，hb＝1，中度肝细胞气球样变，hb＝2，重度肝细胞气球样变(kleiner&makhlouf，2016)。
在特定实施方式中，对象中小叶炎症的检测和定量是基于图案识别和评分：li＝0，无小叶炎症，li>0，小叶炎症，以及分级：li＝1，轻度小叶炎症，li＝2，中度小叶炎症，li＝3，重度小叶炎症(kleiner&makhlouf，2016)。
在另一实施方式中，本发明还提供了一种对nash活动性指数(ai)进行确定和分期的方法，所述方法包括将肝细胞气球样变和小叶炎症的单独评分相加：ai＝0或1，无nash；ai>1，并且至少hb＝1且li＝1。
在另一个实施方式中，本发明允许在肝活检组织中脂肪变性评分的确定和最小脂肪变性评分为1的基础上，对健康对象或患者中的nafld进行临床诊断。
在另一个实施方式中，本发明允许在nafld患者的肝活检组织中活动性指数的确定的基础上，对对象、特别是nafld患者中的nash进行临床诊断：ai≥2，并且至少hb＝1且li＝1。
在另一个实施方式中，对象中肝纤维化的检测和定量是基于肝活检组织中的图案识别和评分：f＝0，无纤维化，f>0，检测到纤维化，以及分级：f＝1，极少纤维化，f＝2，显著纤维化，f＝3，中度纤维化，f＝4，重度纤维化。
在特定实施方式中，对象中肝脏脂肪变性的检测和定量是基于肝活检组织中的图案识别和评分：s＝0，少于5％的脂肪变性；s＝1，6％-33％的脂肪变性；s＝2，34％-66％的脂肪变性；s＝3，大于66％的脂肪变性(kleiner&makhlouf，2016)。
在其他特定实施方式中，对象中微观脂肪变性和宏观脂肪变性的表征是基于肝活检组织中的图案识别、细胞大小和形态分析以及评分。
在其他实施方式中，特定组织学图案相对于门静脉、窦、小叶静脉或其他亚结构的定位和分布可以提供关于肝病的宝贵的补充信息。
在特定实施方式中，所述组织学情况的分析可以被完全自动化。在另一个实施方式中，组织学nash参数的定量可以被自动化。在其他实施方式中，组织学nash参数的定量可以被自动化并整合在生物图像分析软件(特别是qupath平台)中。
根据另一目的，本发明涉及一种将对象分类为用于nafld、nash或肝纤维化的治疗的潜在接受者(待治疗或tbt)或非接受者(非待治疗或ntbt)的方法，所述方法是基于凭借本文中提出的自动化方法实现的nafld患者中活动性指数和纤维化的可靠检测和定量以及如下所定义的tbt与ntbt患者之间的差异分析。
通过另一个方面，本发明还允许纤维化的临床预后，所述预后是在将纤维化dl模型和肝纤维化形态计量学模型应用于肝活检组织的组织学载片的基础上对nafld或nash患者的肝纤维化演变成肝硬化和肝脏结果的风险的预后。
本发明还提供了一种监测nafld活动、nash活动和/或肝纤维化分期的演变的方法，所述方法是基于对象的肝活检组织的组织学载片的使用dl模型的图案识别和评分和与过去在同一对象中收集的活检组织的差异分析。自动化脂肪变性评分可以被进一步包括在所述方法中。
本发明还提供了一种确定nafld、nash或肝纤维化治疗在对象中的效率的方法，所述方法是基于将肝细胞气球样变、小叶炎症、纤维化dl模型和肝纤维化形态计量学模型应用于肝活检组织的免疫组织学载片，通过对象的肝活检组织和过去在同一对象中收集的另一个活检组织中的图案和评分之间的差异分析。自动化脂肪变性评分可以被进一步包括在所述方法中。
本发明还提供了一种预测对象对特定治疗的响应(nafld、nash活动和肝纤维化分期的变化的预测)(响应对象)的方法，所述方法是基于将肝细胞气球样变、小叶炎症、纤维化dl模型和肝纤维化形态计量学模型应用于肝活检组织的免疫组织学载片，以及响应者与非响应者之间的比较。自动化脂肪变性评分可以被进一步包括在所述方法中。
附图说明
图1：用于图案识别和评分方法开发的流程的示意性概述。
从物理载玻片的接收直至自动化nash和肝评分的预测的计算病理学流程的概述。
阶段i：全载片成像(wsi)。将载片用载玻片扫描仪扫描并遵照dicom的建议储存大的多分辨率多平面图像，以便于储存、观察和分析。
阶段ii：wsi的预处理。使用5x的载片展示图来自动发现成像伪影(空气泡、灰尘、盖片碎片)和组织处理伪影(组织折叠、组织碎片)。
阶段iii：从wsi提取生物医学相关图像。提取代表了微观图案(细胞)和宏观图案(组织区域)的图像以待分析。
阶段iv：nash和肝纤维化自动评分。将预测模型首先用微观图案(气球样变和炎症)和宏观图案(nash纤维化、肝纤维化)训练。然后将这些模型应用于单独的微观和宏观图案图像，为每个活检组织载玻片预测：气球样变的肝细胞的数目，炎性细胞的数目，nash纤维化模式，肝纤维化胶原比例面积和肝纤维化形态学指数(对于每个宏观图案来说)。然后将微观和宏观图案定量转变成气球样变评分、炎症评分、纤维化评分、肝胶原比例面积和形态学指数。
图2：患者样品和图像数据的分解，用于为炎症、气球样变、纤维化和肝纤维化形态计量学分析产生深度学习模型。
图3：内部开发的计算病理学流程的概述，覆盖了全载片成像(wsi)数据管理分析和可视化。
图4：基于细胞的和视野(fov)图像的图示说明，所述图像代表了用于炎症、气球样变和纤维化深度学习模型开发的训练和校验集。
a)左图示出了用于炎症模型的训练和校验的代表了炎性细胞和正常肝细胞核的训练和校验集的细胞图像。右图示出了用于气球样变模型的校验的气球样变和正常肝细胞的几个实例。b)代表了训练和校验数据集中被深度学习纤维化模型自动识别的5种图案的fov的实例。仅显示出背景噪音或非常少的活检组织材料(<＝5％)的所有fov在我们的计算病理学流程的更早的预处理步骤中被自动过滤。c)纤维化形态计量学分析的图示说明。从左至右，将原始图像(第一张图)归一化，并从背景提取前景胶原染色(第二张图)。然后分析归一化的胶原图像(第三张图)以提取纤维化隔膜的形态特性(第四张图)和cpa测量(第五张图，蓝色圆圈指示非隔膜胶原区域)。
图5：来自于炎症、气球样变和纤维化的深度学习模型的开发和校验过程的结果。
a)左图示意示出了用于相应地动态改变学习比率以适应于学习循环迭代的方法。实心红线表示代价/损失函数(即阴性似然比)随学习循环迭代的变化，而实心蓝线示出了当我们接近局部最小值时学习比率的适应性(即动态降低)。高亮实心红线示出了第二学习过程，其被实施以改进局部最小值参数，所述过程被重复几次以尽可能接近最优解。b)气球样变模型在训练和校验集上的性能表现随学习迭代循环的变化。c)在训练和校验集上的训练和校验强度水平(在x-轴中表示的研究中的所有样品中，每个强度水平一条线)。d)在训练组群中cpa的半自动和全自动测量值的相关性。
图6：来自于自动化炎症评分流程的校验的结果。a)10个高倍视野(hpf)的自动随机选择的图示说明。(从左至右)第一张图像示出了原始肝活检组织图像(用苏木精和曙红染色，h&e)的实例，第二张图像示出了等同于显微镜下20x的hpf的所有可能的hpf的产生(蓝色是大部分为背景和血管区域的高亮hpf，红色是对炎症评估来说有效的高亮hpf)，并且第三张图像示出了20个随机选择的hpf(在所有有效的hpf中)，其被选择用于炎症评分(即自动和手动)。b)使用wsi方法和在标准显微镜上，在10个随机选择的hpf上病灶的平均数目的手动计数的相关性。c)以表格示出了基于显微术与基于wsi的炎症评分(从由指南定义的平均病灶数转化而来(kliener，2005，6:1313-1321))之间的一致性。d)以图示出了每种炎症评分类别(x-轴的组)的每位患者(组群i)的炎性细胞(其由dl模型自动识别)的总数的分布。
图7：来自于肝纤维化cpa测量的开发和校验过程的结果。
a)每个纤维化评分患者组(组群vi)的全自动cpa测量的分布。b)具有中度(f1&f2)和晚期(f3)纤维化评分的患者(组群vi)的全自动隔膜形态的分布。
图8：自动活动性评分流程的数据工作流程的示意表述。
a)用于校验自动评分流程的不同研究组群的说明。b)在定量过程之前qupat开源构架内的图像操作工作流程的示意表述。c)用于用户校验或被用作诊断辅助的炎症和活动性评分的可视化绘图的说明。低分辨率组织切片上的圆圈对应于在光学显微镜下20x放大倍数的视野的尺寸和形状。在这个切片的下方部分上，示出了在qupath中如何注释炎症病灶和气球样变肝细胞以供终端用户校验或校正的实例。
图9：脂肪变性、炎症和气球样变结果向开源平台qupath的整合。
a)qupath用户界面的视图，所述用户界面允许浏览、项目wsi管理、图像分析、图案识别和数据分析。b)用h&e染色的肝切片上的不同图像分析输出，说明了qupath的数据提取和分析潜力。c)在数字载片上绘图的基于细胞的结果(例如脂质泡)的说明。
图10：用于nash和肝纤维化自动评分的阶段iv的详情和工作流程。
发明详述
本发明人提供了一种用于组织学图像的自动化图案识别和评分方法的新方法。
本发明提供了一种在数字化载片上的深度学习构架，用于在fov水平上自动识别和评分肝细胞气球样变、肝小叶炎症、nash纤维化和肝纤维化组织学图案。
这种构架可以被进一步扩展到数字化载片上脂肪变性的识别、定量、评分和/或定位。
根据本发明，术语“肝组织活检”是一种包括获取小块肝组织以使用显微镜检查损伤或疾病的征象的程序。
根据本发明，术语“组织学图像”是用适合于观察特定细胞或组织特点的染色法染色的组织病理学载片。苏木精和曙红(h&e)是示例性染色剂。当在亮视野显微镜下观察时，苏木精染色核酸并显现出蓝色/紫色，而曙红染色蛋白质并显现出粉色/红色。因此对于大多数组织来说，细胞核是蓝色的，而细胞质取决于其组成成分可以从透明到红色到紫色不等。
根据本发明，术语“脂肪变性”在光学显微镜水平上，在苏木精和曙红(h&e)染色的基础上，通常被定义为含有脂质的透明液泡。肝细胞脂肪变性是nafld的标志，并且目前nafld的诊断要求在超过5％的肝细胞中脂肪变性。
根据本发明，术语“宏观脂肪变性”或“大泡脂肪变性”对应于最常见形式的脂肪变性，并且可能由脂质的过量供应引起。
根据本发明，术语“微观脂肪变性”或“微泡脂肪变性”以细胞中积累的小的胞质内脂肪泡(脂质体)为特征。常见原因是四环素类、妊娠急性脂肪肝、瑞氏综合征和丙型肝炎。
根据本发明，细胞或组织结构的“参比图像”是由病理学家确定的代表了所述细胞或组织结构的快照。这种参比图像可以经受不同的图像处理以获得代表了肝活检组织载片中可能存在的不同细胞图案的图像。例如，参比图像可以经受缩放、染色和/或形态学转变。此外，可以从一个或多个参比图像产生参比图像集。例如，一个参比图像可以如前所述进行转变以获得代表了参比图像集的至少2、3、4、5、6、7、8、9或至少10个不同的经转变的图像。作为示例，可以使用缩放、染色和形态修改从100个单独的细胞或组织参比图像产生100个参比图像的集，代表了每种可能的细胞或组织图案。
缩放、染色和形态线性修改可以在所述参比图像的0直至20％的范围内。
在特定实施方式中，所述缩放、染色和形态线性修改可以在所述参比图像的0直至20％的范围内。
在特定实施方式中，形态和缩放修改可以以下述形式使用：即从0直至20％的线性和仿射转变。
在更特定实施方式中，形态和缩放修改可以以下述形式使用：即从0直至10％的线性和仿射转变。
在特定实施方式中，染色修改可以是色度从0直至5％的随机转变。
根据本发明，“染色剂和图案注释特有的参比图像”是用于组织的每种病理特点的染色归一化的图像。
根据本发明，“染色剂和nash参数特有的参比图像”是用于每种nash参数的染色归一化的图像。
根据本发明，“图案注释”被定义为组织的病理学特点。在nafld患者中，肝组织的特定病理学特点可以是肝细胞气球样变、小叶炎症、脂肪变性、肝或nash纤维化。
根据本发明，“微观图案”被定义为细胞结构，即气球样变的细胞、炎性细胞。
根据本发明，“宏观图案”被定义为相邻组织区，即纤维化。
根据本发明，术语“肝细胞气球样变”在光学显微镜水平上，在苏木精和曙红(h&e)染色的基础上，通常被定义为细胞膨大到正常肝细胞直径的1.5-2倍并伴有细胞质稀少。更通常地，它是指肝细胞死亡的过程。当然，在本发明中可以使用h&e之外的其他染色来确定所述特点的存在。
根据本发明，术语“小叶炎症”是指在苏木精和曙红(h&e)染色的肝活检组织切片的显微镜检查时存在小叶炎症病灶(成团的炎性细胞)。当然，在本发明中可以使用h&e之外的其他染色来确定所述特点的存在。
根据本发明，术语“纤维化”或“肝纤维化”是指在染色(例如苏木精和曙红和番红花(hes)、三色、天狼星红或天狼猩红染色)的肝活检组织切片的显微镜检查时存在纤维状结缔组织。
根据本发明，“活动性指数”是指肝细胞气球样变和小叶炎症评分的总和。
根据本发明，“nafld活动性评分”或“nas”是指如下所述的脂肪变性、肝细胞气球样变、小叶炎症评分的总和：
-脂肪变性评分：0：<5％；1：5-33％；2：34-66％和3：>66％；
-小叶炎症评分(病灶/x20视野)：0：无；1：<2；2：2-4和3：>4；
-气球样变变性评分：0：无；1：很少；2：许多。
根据本发明，术语“nafld”或“非酒精性脂肪性肝病”是指其中在不存在过量饮酒的情况下脂肪在肝脏中沉积(肝脏脂肪变性)，并伴有或不伴有炎症和纤维化的征象的病症。
根据本发明，术语“nafld活动水平”是指nafld进展，并通过本文中所定义的脂肪变性评分的提高来定义。nafld活动水平也指nafld向nash或纤维化的进展和nash严重性。
根据本发明，术语“nash”或“非酒精性脂肪性肝炎”是指在不存在过量饮酒的情况下并在排除其他肝脏疾病如病毒性肝炎(hcv、hbv)等后，以在组织学检查时肝脂肪变性、肝细胞气球样变和肝脏炎症的同时存在(即nas≥3，其中脂肪变性至少1分、小叶炎症至少1分并且肝细胞气球样变评分至少1分)为特征的nafld病症。
根据本发明，术语“nash活动水平”是指nash进展，并通过nas评分相比于用于定义nash的最低参数的提高来定义，所述最低参数是s＝1、li＝1和hb＝1。nash活动水平也指nash向不可逆nash和/或纤维化的进展和nash严重性。
根据本发明，术语“活跃nash”是指以nas≥4为特征的nash，其中脂肪变性评分至少1分、小叶炎症评分至少1分并且肝细胞气球样变评分至少1分。
根据本发明，“待治疗对象”或“tbt对象”是其疾病活动评分(例如nas或活动性指数)和/或肝纤维化分期使其符合用于nafld、nash和/或肝纤维化的治疗的条件的对象。相反，“非待治疗对象”或“ntbt对象”是其疾病活动评分(例如nas或活动性指数)和/或肝纤维化分期没有高到应该接受用于nafld、nash和/或肝纤维化的治疗的对象。因此，tbt对象也被称为nafld、nash和/或肝纤维化治疗的“接受者”或“潜在接受者”。在本发明中，优选的tbt对象是：
i)具有nash的对象，
ii)具有活跃nash的对象，
iii)具有肝脏显著、中度或重度纤维化的对象，
iv)具有nash和纤维化的对象。
所述定义涵盖了定义本发明的不同变化形式的各种不同的nash活动性值和纤维化分期。
本发明的优选变化形式如下详细描述。
第一种tbt变化形式(tbt2)：
tbt2对象被定义为表现出下述肝组织活检来源的等级的对象：
-脂肪变性评分≥1
-肝细胞气球样变评分≥1
-小叶炎症评分≥1
-nas(nafld活动评分)≥4
-纤维化分期≥2(例如纤维化分期等于2、3或4，特别是2或3)。
引申开来，ntbt2对象与tbt2对象的差异在于脂肪变性、肝细胞气球样变、小叶炎症评分、nas和/或纤维化分期中低至少一级。
第二种tbt变化形式(tbt1)：
tbt1对象被定义为表现出下述肝组织活检来源的等级的对象：
-脂肪变性评分≥1
-肝细胞气球样变评分≥1
-小叶炎症评分≥1
-nas(nafld活动评分)≥4
-纤维化分期≥1(例如纤维化分期等于1、2、3或4)。
引申开来，ntbt1对象与tbt1对象的差异在于脂肪变性、肝细胞气球样变、小叶炎症评分、nas和/或纤维化分期中低至少一级。
第三种tbt变化形式(tbt7)：
tbt7对象被定义为表现出下述肝组织活检来源的等级的对象：
-脂肪变性评分≥1
-肝细胞气球样变评分≥1
-小叶炎症评分≥1
-nas(nafld活动评分)≥4
-纤维化分期＝1b、1c、2、3或4。
引申开来，ntbt7对象与tbt7对象的差异在于脂肪变性、肝细胞气球样变、小叶炎症评分、nas和/或纤维化分期中低至少一级。
根据本发明，术语“cpa”或“胶原比例面积”是指胶原染色面积与组织总面积的总比例。标记物可以是天狼猩红或其他染料(即三色)。在活检组织水平上cpa被报告为总的病理性胶原面积与活检组织总面积的比率。在患有非酒精性脂肪性肝病的患者中cpa是长期结果的独立预测物。
根据本发明，术语“dl”或“深度学习”是机器学习研究的新领域，引入它的目的是将机器学习移动到更接近其原始目标之一：人工智能。深度学习涉及学习多种水平的表现和抽象，其有助于使数据例如图像变得对图案分析和分类有意义。
根据本发明，术语“cnn”或卷积神经网络是机器学习中的一类深度、前馈式人工神经网络，其已被应用于分析视觉意象(图像识别和分类)。
根据本发明，术语“dl模型”可以将cnn用于图案识别或分析和分类。
本发明涉及一种在对象中表征肝细胞气球样变的发生和等级的方法，所述方法包括使用肝细胞气球样变dl模型在所述对象的肝活检组织中确定肝细胞气球样变评分。
本发明还涉及一种在对象中表征肝细胞小叶炎症的发生和等级的方法，所述方法包括使用小叶炎症dl模型在所述对象的肝活检组织中确定小叶炎症评分。
本发明涉及一种在对象中表征脂肪变性的发生和等级的方法，所述方法包括使用自动化过程在所述对象的肝活检组织中确定脂肪变性评分。
本发明还涉及用于脂肪变性、肝细胞气球样变、小叶炎症、nash纤维化和肝纤维化的专门的归一化方法。
本发明涉及对象中微观脂肪变性和宏观脂肪变性的表征，其基于肝活检组织中的图案识别、细胞大小和形态分析和评分。
本发明还涉及特定组织学图案相对于门静脉、窦、小叶静脉或其他亚结构的定位和分布，可以提供关于肝脏病理的宝贵的补充信息。
本发明涉及组织学情况分析的全自动化。
本发明还涉及组织学nash参数的定量的自动化。
本发明还涉及组织学nash参数的定量的自动化和在生物图像分析软件(特别是qupath平台)中的集成。
本发明还涉及对象中nash活动性指数的确定和评分的方法，所述方法包括在所述对象的肝活检组织中确定肝细胞气球样变和小叶炎症评分。
本发明还涉及在nafld患者中诊断nash的方法，所述方法包括使用dl模型在所述对象的肝活检组织中确定肝细胞气球样变和小叶炎症评分。ai＝0或1，无nash；ai>1并且至少hb＝1且li＝1。
本发明还涉及在对象中确定肝纤维化的发生和分期的方法，所述方法包括在所述对象的肝活检组织中确定纤维化评分、用于dl分析的nash纤维化评分和用于cpa和形态计量学分析的肝纤维化评分。
由于肝纤维化是大多数慢性肝病的共同结果，因此本发明还涉及诊断和检测由其他纤维化肝病造成的显著或晚期肝纤维化，所述肝病例如：病毒性肝炎(hbv、hcv等)，酒精性脂肪性肝炎，胆道疾病(原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、自体免疫性肝炎、威尔森氏病、α1抗胰蛋白酶缺乏症)。
本发明还涉及一种将对象分类为用于nash和/或纤维化的治疗的潜在接受者(tbt)或非接受者(ntbt)的方法，所述方法包括在所述对象的肝活检组织中应用肝细胞气球样变、小叶炎症和纤维化dl模型、纤维化形态计量学模型和脂肪变性定量。
本发明还涉及一种对在不存在治疗的情况下对象中的nafld或nash活动演变的风险进行预后的方法，所述方法包括在所述对象的肝活检组织中应用肝细胞气球样变、小叶炎症和纤维化dl模型、纤维化形态计量学模型和脂肪变性定量。
本发明还涉及一种对在不存在治疗的情况下对象中的纤维化演变成肝硬化和肝脏临床结果的风险进行预后的方法，所述方法包括在所述对象的肝活检组织中应用肝细胞气球样变、小叶炎症和纤维化dl模型、纤维化形态计量学模型和脂肪变性定量。
本发明还涉及一种监测对象中nafld或nash活动的演变(即进展或消退)的方法，所述方法包括在所述对象的肝活检组织中应用肝细胞气球样变、小叶炎症和纤维化dl模型、纤维化形态计量学模型和脂肪变性定量。
本发明还涉及一种监测对象中肝纤维化的演变(即进展或消退)的方法，所述方法包括在所述对象的肝活检组织中应用肝细胞气球样变、小叶炎症和纤维化dl模型、纤维化形态计量学模型和脂肪变性定量。
本发明还涉及一种在对象中预测患者对nafld、nash和/或肝纤维化的特定治疗的响应的方法，所述方法包括在所述对象的肝活检组织中应用肝细胞气球样变、小叶炎症和纤维化dl模型、纤维化形态计量学模型和脂肪变性定量。
因此，本发明涉及一种在对象中诊断和检测nafld的方法，所述方法基于在所述对象的肝活检组织中应用肝细胞气球样变、小叶炎症和纤维化dl模型、纤维化形态计量学模型和脂肪变性定量。
根据本发明，提供了方法以：
-表征肝脂肪变性的发生
-表征对象中肝细胞气球样变(hepatocellarorhepatocyteballooning)的发生
-表征对象中小叶炎症的发生
-表征对象中肝纤维化和nash纤维化的发生
-表征对象中nash的发生。
因此，根据本发明，提供了方法以：
-表征对象中肝细胞气球样变的发生
-表征对象中小叶炎症的发生
-表征对象中肝纤维化和nash纤维化的发生
-表征对象中nash的发生。
此外，根据本发明，提供了方法以：
-将所述对象诊断为具有脂肪变性和/或更晚期的肝脂肪变性，
-将所述对象诊断为具有肝细胞气球样变和/或更晚期的肝细胞气球样变评分，
-将所述对象诊断为具有小叶炎症和/或更晚期的小叶炎症评分，
-将所述对象诊断为具有肝纤维化和/或更晚期的肝纤维化分期和nash纤维化，
-在nafld患者中将所述对象诊断为具有nash。
此外，根据本发明，提供了方法以：
-将所述对象诊断为具有肝细胞气球样变和/或更晚期的肝细胞气球样变评分，
-将所述对象诊断为具有小叶炎症和/或更晚期的小叶炎症评分，
-将所述对象诊断为具有肝纤维化和/或更晚期的肝纤维化分期和nash纤维化，
-在nafld患者中将所述对象诊断为具有nash。
此外，根据本发明的方法允许：
-确定脂肪变性评分，
-确定肝细胞气球样变评分，
-确定小叶炎症评分，
-确定nash相关活动性指数，
-确定对象中的nash纤维化分期，
-确定对象中的肝纤维化分期，
-确定对象中nash的严重性，
-确定nash患者中病情的进展或消退。
此外，根据本发明的方法允许：
-确定肝细胞气球样变评分，
-确定小叶炎症评分，
-确定nash相关活动性指数，
-确定对象中的nash纤维化分期，
-确定对象中的肝纤维化分期，
-确定对象中nash的严重性，
-确定nash患者中病情的进展或消退。
此外，根据本发明，提供了方法以：
-确定微观脂肪变性或宏观脂肪变性
-确定小叶或门炎症
-确定窦周、门周、门纤维化
-确定组织活检样品中nash参数的具体位置(病灶的位置、气球样变细胞的位置等)
-确定感兴趣的生物学信息的定性绘图。
此外，根据本发明的方法允许：
-将对象分类为用于nafld的治疗的接受者或非接受者，
-将对象分类为用于nash的治疗的接受者或非接受者，
-将对象分类为用于肝纤维化的治疗的接受者或非接受者，
-将对象分类为用于肝细胞气球样变的治疗的接受者或非接受者，
-将对象分类为用于小叶炎症的治疗的接受者或非接受者。
此外，根据本发明的方法允许：
-将对象分类为用于nash的治疗的接受者或非接受者，
-将对象分类为用于肝纤维化的治疗的接受者或非接受者，
-将对象分类为用于肝细胞气球样变的治疗的接受者或非接受者，
-将对象分类为用于小叶炎症的治疗的接受者或非接受者。
此外，根据本发明的方法允许：
-在药物给药以治疗nafld疾病的基础上评估医学治疗的效能，
-在药物给药以治疗nash疾病的基础上评估医学治疗的效能，
-在药物给药以治疗纤维化疾病的基础上评估医学治疗的效能，
-在药物给药以治疗肝细胞气球样变疾病的基础上评估医学治疗的效能，
-在药物给药以治疗小叶炎症疾病的基础上评估医学治疗的效能。
此外，根据本发明的方法允许：
-在药物给药以治疗nash疾病的基础上评估医学治疗的效能，
-在药物给药以治疗纤维化疾病的基础上评估医学治疗的效能，
-在药物给药以治疗肝细胞气球样变疾病的基础上评估医学治疗的效能，
-在药物给药以治疗小叶炎症疾病的基础上评估医学治疗的效能。
此外，根据本发明的方法允许：
-在医学治疗施用后确定nafld患者中病情的进展或消退，
-在医学治疗施用后确定nash患者中病情的进展或消退，
-在医学治疗施用后确定患有纤维化的患者中病情的进展或消退，
-在医学治疗施用后确定患有肝细胞气球样变疾病的患者中病情的进展或消退，
-在医学治疗施用后确定患有小叶炎症疾病的患者中病情的进展或消退。
此外，根据本发明的方法允许：
-在医学治疗施用后确定nash患者中病情的进展或消退，
-在医学治疗施用后确定患有纤维化的患者中病情的进展或消退，
-在医学治疗施用后确定患有肝细胞气球样变疾病的患者中病情的进展或消退，
-在医学治疗施用后确定患有小叶炎症疾病的患者中病情的进展或消退。
此外，根据本发明的方法允许：
-预测患者是否能接受治疗nafld疾病的医学治疗，即是所述医学治疗的(潜在)响应者还是(潜在)非响应者，
-预测患者是否能接受治疗nash疾病的医学治疗，即是所述医学治疗的(潜在)响应者还是(潜在)非响应者，
-预测患者是否能接受治疗肝纤维化疾病的医学治疗，即是所述医学治疗的(潜在)响应者还是(潜在)非响应者，
-预测患者是否能接受治疗肝细胞疾病的医学治疗，即是所述医学治疗的(潜在)响应者还是(潜在)非响应者，
-预测患者是否能接受治疗小叶炎症疾病的医学治疗，即是所述医学治疗的(潜在)响应者还是(潜在)非响应者。
此外，根据本发明的方法允许：
-预测患者是否能接受治疗nash疾病的医学治疗，即是所述医学治疗的(潜在)响应者还是(潜在)非响应者，
-预测患者是否能接受治疗肝纤维化疾病的医学治疗，即是所述医学治疗的(潜在)响应者还是(潜在)非响应者，
-预测患者是否能接受治疗肝细胞疾病的医学治疗，即是所述医学治疗的(潜在)响应者还是(潜在)非响应者，
-预测患者是否能接受治疗小叶炎症疾病的医学治疗，即是所述医学治疗的(潜在)响应者还是(潜在)非响应者。
在某些实施方式中，所述用于确定对象是否患有nafld的方法包括提供来自于对象、特别是怀疑患有所述被评估的病症的对象的肝活检组织，并将dl模型应用于脂肪变性参数，以指示所述被评估的病症的存在。
在某些实施方式中，所述用于确定对象是否具有nash或活跃nash或显著肝纤维化或小叶炎症或肝细胞气球样变或用于确定对象是否是特定药物的药物接受者(tbt)或潜在药物接受者的方法，包括提供来自于怀疑具有所述被评估的病症的对象的肝活检组织，并将dl模型应用于各个组织学参数，以指示所述被评估的病症的存在或不存在，或将所述对象诊断为具有nash或显著肝纤维化或小叶炎症或肝细胞气球样变，或指明所述对象是潜在的药物接受者(tbt)或响应者。
在特定实施方式中，所述对象正患有nafld，因此本发明的方法允许确定药物用于治疗nafld疾病的效能，将所述对象分类为用于nafld的治疗的响应者/非响应者，或监测所述对象的nafld状态的演变。
在特定实施方式中，所述对象正患有nash，因此本发明的方法允许确定药物用于治疗nash疾病的效能，将所述对象分类为用于nash的治疗的响应者/非响应者，或监测所述对象的nash状态的演变。
直至图案识别之前的组织学图像的预处理：
本发明的方法分析组织学图像。
组织学图像是染色的组织病理学载片。本领域技术人员知道如何产生这些图像。主要步骤是组织采集，包括使所述组织化学和物理稳定化的处理，在支持材料块中的包埋，切片，以及染色以产生对比。
在特定实施方式中，执行的染色允许区分细胞组件或组成成分。例如，所述染色可能适合于允许区分细胞核、胞质溶胶和组织组分。
说明性的染色剂包括油红o、苏木精和曙红、天狼星红、三色、苏木精/曙红/番红花(hes)、天狼猩红、角蛋白18、荧光染色剂和免疫染色。
在特定实施方式中，在本发明中使用的染色剂是第一载片上的苏木精和曙红(h&e)和第二载片上的天狼猩红。
在特定实施方式中，所述染色剂可以是一个载片上的三色染色剂。
然后将所述组织学图像数字化。
图像数字化
本发明的方法是基于肝活检组织的数字化图像的分析。图像获取可以通过任何图像获取手段来进行。例如，所述图像使用全载片扫描仪或相机来数字化。
在特定实施方式中，所述获取产生高分辨率全载片图像(wsi)。这种高分辨率可以在1,000x1,000像素至1,000x200,000像素之间，例如2,000x2,000像素至2,000x200,000像素之间、例如3,000x5,000像素至3,000x150,000像素之间、例如10,000x20,000像素至10,000x150,000像素之间的范围内。例如，对于5mmx35mm的载片来说，可以以每个像素0.25μm的分辨率产生具有20,000x140,000像素的分辨率的图像。
在另一个实施方式中，数字化以专用格式(例如svs(leica)或mrx(3dhistech)类型的格式)进行，然后可以将所述数字图像转变成更适合于计算病理学工作流程的另一种格式(特别是作为基于拼图的dicom格式)。这种适合的格式包括基于拼图的格式例如dicom格式。
在另一个实施方式中，数字化以适合于计算病理学工作流程或生物图像分析软件的格式例如基于拼图的格式如dicom格式直接进行。
然后可以将所述数字化载片分解成较小尺寸的拼图。例如，可以将所述数字化载片分解成尺寸对应于感兴趣的组织或细胞图案的拼图。在特定实施方式中，所述拼图的尺寸略微大于预期的细胞尺寸(考虑到细胞可能气球样变，即可能具有比正常细胞大2倍的尺寸这一事实，以及活检样品载片制备可能使细胞变形这一事实)。例如，可以产生尺寸为512x512像素的拼图。
感兴趣区域的鉴定
对于分析来说，每种变异性来源都可能代表显著的障碍。固定不良的组织将不被良好地切割并可能具有模糊的外观，消除了重要的线索例如边缘。已被干燥的组织可能会收缩并具有不良的形态和染色对比度。切片伪影属于最常遇到的情况，并且可能产生组织中的折叠、来自于钝刀片的颤动伪影(被观察为交替的明暗区域)或组织碎片的丢失。
本发明的方法在待分析的组织学图像上的所选组织区上实施。
根据特定实施方式，图案识别模型在载片图像上实施，以从所述载片的背景总面积(以例如mm2为单位表示)中辨别出组织。确定将载片的中空和无组织区域排除在外的活检样品部分的轮廓，其代表了活检组织总面积。活检组织面积的互补部分被定义为载片背景总面积。
在特定实施方式中，将图案识别应用到所述全载片图像。
在其他特定实施方式中，对所述全载片图像的5x表述图进行图案识别。
在另一个特定实施方式中，将图案识别应用到染色的全载片图像的5x表述图，所述染色用以区分细胞区室和/或纤维化，例如天狼猩红。
所述图案识别模型的应用排除了组织折叠伪影以及代表空气泡、组织碎片和灰尘的小的孤立区域。
本发明的方法提供了组织学图像上的所选组织区用于分析。
染色归一化
染色可能是变异性的关键来源，因为它在载片上产生颜色和对比。染色伪影可以包括使用苏木精或曙红的浅染色、沉淀的苏木精(在显微镜下被观察为蓝块)或缺少苏木精、曙红或两者的染色。这些伪影被病理学家充分了解，但对依靠颜色的自动组织学分析系统来说可能造成问题。因此对于自动组织学图像分析来说优选地进行染色归一化。
在特定实施方式中，染色归一化使用颜色归一化技术例如直方图均衡化。
在另一个特定实施方式中，所述组织学图像被分离成仅苏木精(仅h)和仅曙红(仅e)的图像(有时被称为颜色解卷积)，然后将这些图像分别归一化，然后重新合并。
在另一个实施方式中，不同的方法是直接估算单一染色剂图像。
在另一个实施方式中，不同的方法是颜色反转技术。
在优选实施方式中，从20x的图像，将染色从任何其他染色剂复染解卷积，并针对所述染色剂和图案注释特有的参比图像进行归一化。
在优选实施方式中，所述标准化的图像允许自动分析。
细胞结构鉴定
本发明的方法可以鉴定标准化的组织学图像上的细胞结构。
核检测
组织学图像中的核检测具有挑战性，因为核可以紧密簇集，并且其尺寸、形状和颜色随着细胞类型而变。核检测的基本方法包括像素的颜色聚类。
在特定实施方式中，从20x的图像，将细胞核的染色从任何其他染色的复染解卷积。
应用核染色形态学操作以增强圆形、略圆的结构。
在另一个实施方式中，将使用活动轮廓的其他方法用于精炼核的初始颜分割，检测核种子点，或将核检测设定为分类问题。
在特定实施方式中，低于面积(10像素)、圆度(与完美圆度的相关性＝0.7)或圆形度(与完美圆度的相关性＝0.7)的一定阈值的核被过滤掉。
在优选实施方式中，应用核染色形态学操作以增强圆形、略圆的结构，并对得到的图像进行适应性稳健背景分割算法以分割所有细胞核。低于面积、圆度和圆形度的一定阈值的核将被过滤掉。
胞质溶胶外延定位
发现胞质溶胶外延的方法包括像素的颜色聚类。
在特定实施方式中，使用核的中心，以不再存在染色或到达邻近细胞的边界为条件，通过迭代的掩模生长过程来模拟胞质溶胶的外延。
在另一个实施方式中，使用核的中心和其他染色剂，以不再存在染色或到达邻近细胞的边界为条件，通过迭代的掩模生长过程来模拟胞质溶胶的外延。
所述外延的细胞区域从原始图像提取并确定了细胞快照图像，所述细胞快照被定义为边界框。
单个细胞图像(微观图案)的提取
本发明的方法从标准化的组织学图像上的细胞结构提取单个细胞图像。
目前的方法依靠组织学特异性特点来提取细胞快照。
在特定实施方式中，使用细胞结构的参比图像对各个图像进行归一化。
在优选实施方式中，细胞快照被提取并针对参比图像色度配置文件(每种染色剂组合一个配置文件)进行归一化。
说明性的归一化过程可以包括：细胞快照的主要染色色度通道的解卷积，参比配置文件染色色度通道的解卷积，来自于细胞快照的每个通道相对于参比配置文件的稳健z-评分，以及将归一化的解卷积通道合并成一个细胞快照图像。
相邻组织区(宏观图案)的提取
本发明的方法也可以从标准化的组织学图像上的细胞结构提取相邻细胞组织区。
发现相邻组织的基本方法包括像素的颜色聚类。
在特定实施方式中，使用参比图像将每个细胞图像或fov归一化。
在特定实施方式中，使用参比图像色度配置文件对各个图像进行归一化。
在优选实施方式中，微观图案被提取并针对参比图像色度配置文件(每种染色剂组合一个配置文件)进行归一化。
归一化过程可以包括：相邻细胞组织区的主要染色色度通道的解卷积，参比配置文件染色色度通道的解卷积，来自于相邻细胞组织区的每个通道相对于参比配置文件的稳健z-评分，以及将归一化的解卷积通道合并成一个相邻细胞组织区图像。
肝细胞气球样变的评分方法
事先进行图像获取、数字化、感兴趣的区域的鉴定、归一化以及微观和宏观图案的定位。
在优选实施方式中，所述染色使用h&e进行。
在其他特定实施方式中，读取在图像上以x20的放大倍数进行。
本发明的方法可以在归一化的组织学全组织图像上自动鉴定气球样变细胞，定量气球样变细胞的数目，并对肝细胞气球样变进行评分。应用在图案识别模型和形态学判据的基础上区分气球样变的肝细胞和正常肝细胞的图案识别方法和气球样变细胞检测dl模型。
将关于微观图案气球样变肝细胞的模型应用于所有细胞快照，以针对细胞结构的参比图像计算类别概率并预测类别标签(最高概率标签)。
在特定实施方式中，使用最佳气球样变细胞检测dl模型鉴定气球样变的肝细胞的预测概率高于90％。
在优选实施方式中，使用最佳气球样变细胞检测dl模型鉴定气球样变的肝细胞的预测概率高于95％。
在特定实施方式中，细胞质的角蛋白8/18免疫染色的丧失可以证实气球样变细胞的鉴定。
气球样变细胞的总数可以被表示为气球样变细胞占细胞总数的百分率，或根据nash临床研究网络(crn)表示为肝细胞气球样变评分：肝细胞气球样变评分＝0对应于nafld活动性评分中的“无”，肝细胞气球样变评分＝1对应于“很少的气球样变细胞”，并且肝细胞气球样变评分＝2对应于“许多细胞/显著气球样变”。
在特定实施方式中，肝细胞气球样变评分＝0可以对应于所有肝细胞中平均0.02％的气球样变肝细胞，肝细胞气球样变评分＝1可以对应于平均0.11％的气球样变肝细胞，肝细胞气球样变评分＝2可以对应于平均0.51％的气球样变肝细胞。
用于肝细胞气球样变的图案识别和评分气球样变细胞dl模型可以被集成到开源计算病理学软件或生物图像分析软件(例如qupath)中，以提高用户的接受度和体验。
气球样变细胞的位置可以提供感兴趣的生物学信息。
在特定实施方式中，当所述图案识别和评分气球样变细胞dl模型(气球样变流程)被集成到计算病理学软件或生物图像分析软件(例如qupath)中时，可以进行感兴趣的生物学信息的定性绘图。
小叶炎症的评分方法
事先进行图像获取、数字化、感兴趣的区域的鉴定、归一化以及微观和宏观图案的定位。
在优选实施方式中，所述染色使用h&e或h&e和天狼猩红进行。
在其他特定实施方式中，读取在图像上以x20的放大倍数进行。
在特定实施方式中，确定等同于显微镜下20x高倍视野的所有fov。
通过计算机在全载片图像上随机确定具有感兴趣的区域的视野(fov)。
在特定实施方式中，确定全载片图像上的所有fov。具体来说，所述fov等同于显微镜下的20x高倍视野。
在其他特定实施方式中，通过计算机程序随机选择一定数量fov。例如，可以随机选择2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或超过40个fov。在特定实施方式中，选择的fov的数目在5至15个fov的范围内。在特定实施方式中，这个数目在8至12个fov、特别是9至11个fov的范围内，例如在全载片图像上选择具有感兴趣的区域的10个fov。
这些随机选择的fov代表了进一步研究的潜在区域的自动选择，所述区域的重要性可以由实验操作人员校验从而为实验操作人员提供帮助，或由本发明的模型自动校验。
在特定实施方式中，fov的选择还包括由一个或多个用户手动指定fov。
肝门区域被排除在小叶炎症的读取之外。
在特定实施方式中，带有感兴趣的区域的视野从非肝门区域中的一组随机产生的fov中选择。
在更特定实施方式中，带有感兴趣的区域的视野从小叶内区域中的一组随机产生的fov中选择。
在特定实施方式中，视野由模型选择并由模型或实验操作人员校验。
在特定实施方式中，视野通过炎性细胞dl模型在小叶内区域中产生并随机提交给实验注释者以校验所述选择的视野，特别是10个视野。
本发明的方法可以在归一化的组织学全组织图像上自动鉴定炎症病灶，定量炎症病灶的数目，并对小叶炎症进行评分。应用图案识别方法和炎性细胞dl模型来区分炎性细胞和其他细胞。应用从数字化活检样品图像识别肝门区域的图案识别方法和模型。
将关于微观图案炎性细胞的模型应用于所有细胞快照，以针对细胞结构的参比图像计算类别概率并预测类别标签(最高概率标签)。
在特定实施方式中，使用最佳炎性细胞检测dl模型鉴定炎性细胞或病灶的预测概率高于90％。
在优选实施方式中，使用最佳炎性细胞检测dl模型鉴定炎性细胞或病灶的预测概率高于95％。
将10个所选视野上的炎性病灶的平均数目转变为小叶炎症评分。在特定实施方式中，所述评分按照nash临床研究网络(crn)：小叶炎症评分＝0对应于nafld活动性评分中的“无病灶，小叶炎症评分＝1对应于“<2个病灶/200x”，小叶炎症评分＝2对应于“2-4个病灶/200x”，小叶炎症评分＝3对应于“>4个病灶/200x”。
在特定实施方式中，10个fov上的炎性病灶的平均数目不被转变为评分并遵从线性演化。
用于肝脏炎症的图案识别和评分炎性细胞dl模型可以被集成到开源计算病理学软件或生物图像分析软件(例如qupath)中，以提高用户的接受度和体验。
炎性细胞或病灶的位置可以提供感兴趣的生物学信息。
在特定实施方式中，当所述图案识别和评分炎性细胞dl模型(炎症流程)被集成到计算病理学软件或生物图像分析软件(例如qupath)中时，可以进行感兴趣的生物学信息的定性绘图。
脂肪变性的评分方法
进行图像获取、数字化、感兴趣的区域的鉴定。
在优选实施方式中，所述染色使用h&e进行。
在另一特定实施方式中，读取在图像上以x5的放大倍数进行。
对每个视野进行染色归一化，并确定区分细胞结构和液泡的阈值。
本发明的方法可以在归一化的组织学图像上自动鉴定脂质泡，定量脂质的面积并对脂肪变性进行评分。所述图案识别和评分脂肪变性区域的方法在脂质泡的图案识别模型和形态学判据的基础上区分脂质泡和白色区域。将关于微观图案脂质泡的模型应用于所有细胞快照。
在特定实施方式中，每个视野确定一个阈值，用于将脂质泡与细胞结构区分开。
所述图案识别方法和评分脂肪变性区域模型选择性地过滤掉在形态学上与脂质泡不相似(过于小，或足够大但不对应于预先确定的形态学特性)的白色区域。
脂肪变性的总面积根据nash临床研究网络(crn)被表示成脂肪变性评分：脂肪变性评分＝0对应于nafld活动性评分中的“<5％”，脂肪变性评分＝1对应于“5-33％”，脂肪变性评分＝2对应于“33-66％”，脂肪变性评分＝3对应于“>66％”。
在特定实施方式中，脂肪变性总面积被表示成全部组织区域的百分数。
在特定实施方式中，可以将微观脂肪变性与宏观脂肪变性区分开。
在特定实施方式中，脂肪变性的位置可以提供感兴趣的生物学信息。
在另一个特定实施方式中，脂肪变性细胞计数可以代替脂肪变性的总面积。
所述用于脂肪变性的图案识别和评分脂肪变性区域模型可以被集成到开源计算病理学软件或生物图像分析软件(例如qupath)中，以提高用户接受度和体验。
在特定实施方式中，当所述图案识别和评分脂肪变性区域dl模型被集成到计算病理学软件或生物图像分析软件(例如qupath)中时，可以进行感兴趣的生物学信息的定性绘图。
nash纤维化的评分方法
事先进行图像获取、数字化、感兴趣的区域的鉴定、归一化以及微观和宏观图案的定位。
在优选实施方式中，所述染色使用h&e或h&e和天狼猩红进行。
在其他特定实施方式中，读取在图像上以x5的放大倍数进行。
将关于宏观图案nash纤维化的图案识别和评分nash纤维化模型应用于全载片图像的所有预先归一化的fov。
定义了基于nashcrn/kleiner的nash纤维化评分：纤维化分期＝0“无”，纤维化分期＝1“窦周(轻度至中度)或门周”，纤维化分期＝2“窦周和门周”，纤维化分期＝3“桥接纤维化”，和纤维化分期＝4“肝硬化”。
在特定实施方式中，可以将门和门周纤维化与窦或窦周纤维化区分开。
在其他特定实施方式中，可以诊断桥接纤维化。
所述用于nash纤维化的图案识别和评分模型可以被集成到开源计算病理学软件或生物图像分析软件(例如qupath)中，以提高用户接受度和体验。
nash纤维化的位置可以提供感兴趣的生物学信息。
在特定实施方式中，当所述图案识别和评分nash纤维化dl模型(炎症流程)被集成到计算病理学软件或生物图像分析软件(例如qupath)中时，可以进行感兴趣的生物学信息的定性绘图。
肝纤维化的评分方法
事先进行图像获取、数字化、感兴趣的区域的鉴定、归一化以及微观和宏观图案的定位。
在优选实施方式中，所述染色使用h&e或h&e和天狼猩红进行。
在其他特定实施方式中，读取在图像上以x5的放大倍数进行。
将关于宏观图案肝纤维化的图案识别和评分模型应用于全载片图像的所有预先归一化的fov。
肝纤维化评分被定义为所有fov上的平均分形指数、除了被预测为门区的fov之外的所有fov上的平均分形指数或每类fov的平均分形指数。
所述用于肝纤维化的图案识别和评分模型可以被集成到开源计算病理学软件或生物图像分析软件(例如qupath)中，以提高用户接受度和体验。
肝纤维化的位置可以提供感兴趣的生物学信息。
在特定实施方式中，当所述图案识别和评分肝纤维化dl模型(炎症流程)被集成到计算病理学软件或生物图像分析软件(例如qupath)中时，可以进行感兴趣的生物学信息的定性绘图。
根据特定实施方式，提供了肝组织学载片的这种新的图案识别和评分自动方法的顺序操作，其描述了计算病理学流程的创新功能。说明性地，提供了下述阶段1至4作为按照本发明进行的完整分析的实例。
阶段1：
数字化：将载玻片数字化。本发明人将载片在svs(leica)或mrxs(3dhistech)类型的专用格式下数字化，但所述获取可以通过任何其他的图像读取器进行。根据另一个实施方式，数字化以适合于计算病理学工作流程的格式例如基于拼图的dicom格式进行。
存储：然后将数字文件链接到数据库中的生物医学相关信息。
格式变换：如果数字化在专用格式下进行，则将所述专用格式下的数字图像转变成更适合于计算病理学工作流程的另一种格式(例如基于拼图的dicom格式)，例如使用免费软件(例如openslide)。
阶段2：
发现组织：将图案识别模型应用于wsi(用标准的h&e/天狼猩红染色的载片)的5x表述图。确定将载片的中空和非组织区域排除在外的活检组织部分的轮廓。
发现载片背景：将图案识别模型应用于wsi(用标准的h&e/天狼猩红染色的载片)的5x表述图。确定将载片的中空和非组织区域排除在外的载片背景部分的轮廓。从wsi总面积，载片背景总面积(以mm2为单位)的补足部分被定义为活检组织总面积。
发现组织和载片伪影：将图案识别模型应用于wsi(用标准的苏木精-曙红(h&e)染色/天狼猩红染色的载片)的5x表述图。组织折叠和染色伪影以及代表空气泡、组织碎片和灰尘的小的孤立区域被自动鉴定并确定轮廓。
阶段3：
发现细胞核：
从20x的原始图像，首先从任何其他染色剂复染将细胞核的染色解卷积。
对核染色应用形态学操作以增强圆形、略圆的结构。
在从前一步得到的图像上应用适应性稳健背景分割算法以分割所有细胞核。
低于面积、圆度和圆形度的一定阈值的核被过滤掉。
围绕每个核定义边界框。
发现胞质溶胶外延：
使用核的中心和其他染色剂，以不再存在染色或到达邻近细胞的边界为条件，通过迭代的掩模生长过程来模拟胞质溶胶的外延。
最大边界框在延伸的细胞区域的基础上确定，并从定义了细胞快照图像的原始图像提取。
细胞快照图像被定义为所述边界框。
提取单个细胞图像(微观图案)：
细胞快照被提取并针对参比图像色度配置文件(每种染色剂组合一个配置文件)进行归一化。
归一化步骤包括下述步骤：
细胞快照的主要染色色度通道的解卷积。
参比配置文件染色色度通道的解卷积。
来自于细胞快照的每个通道相对于参比配置文件的稳健z-评分。
将归一化的解卷积通道合并成一个细胞快照图像并本地保存在物理文件中以备进一步处理。
在去除边界框后将归一化的解卷积通道合并成一个核快照图像。
将核快照保存在本地物理文件中。
提取相邻细胞组织区(宏观图案)：
对于前面步骤中的每个细胞图像，将它提取自的fov(图像拼图)按照与微观图案相关的归一化步骤进行归一化。
在归一化后，将fov图像保存在本地物理文件中。
阶段4
在微观图案气球样变肝细胞上训练模型：
有经验的用户手动选择一组代表正常肝细胞和气球样变肝细胞的细胞快照图像。
使事先在imagenet数据集上训练过的深度学习模型适应于上面定义的所述一组细胞快照图像。
使用梯度下降，有经验的用户为气球样变细胞快照图案识别确定最佳深度学习配置。
在微观图案炎性细胞上训练模型：
重复用于炎性细胞和正常肝细胞细胞核快照的训练步骤。
在宏观图案nash纤维化上训练模型：
有经验的用户从纤维化染色的wsi图像手动选择一组代表下述fov的细胞fov图像：
正常fov(无胶原)
窦周fov(围绕窦分支的胶原)
门周fov(围绕门区分支的胶原)
门fov(存在于门区中的胶原)
桥接fov(以桥的形式存在于主要血管结构门区与中央静脉之间的胶原)。
使事先在imagenet数据集上训练过的深度学习模型适应于上面定义的所述一组fov图像。
使用梯度下降，有经验的用户为nash纤维化图案识别确定最佳深度学习配置。
在宏观图案肝纤维化上训练模型：
有经验的用户从纤维化染色的wsi图像手动选择一组代表下述fov的细胞fov图像：
正常fov(无胶原)
窦周fov(围绕窦分支的胶原)
门周fov(围绕门区分支的胶原)
门fov(存在于门区中的胶原)
桥接fov(以桥的形式存在于主要血管结构门区与中央静脉之间的胶原)。
将解卷积应用于以前定义的数据集以将纤维化染色与任何其他另外的染色分开。
为了表征在由有经验的用户选择的fov图像中定义的每种fov类型的形态学特性，应用分形分析。
使用“龙形曲线”作为基本图案，将分形分析应用于纤维化解卷积的通道。
在由有经验的用户选择的fov图像中所定义的每个fov子集中进行统计分析，以计算平均值、中值、最小值、最大值、标准偏差。
在分形指数的基础上确定每个fov的分类边界的阈值被定义为平均值 /-2xstd。
将模型应用于典型的wsi图像：
提取微观和宏观图案：如阶段3中为图像提取和归一化所定义的来进行。
气球样变
将模型应用于所有细胞快照并计算类别概率和预测类别标签(最高概率标签)。
用于wsi的气球样变评分细胞计数被定义为具有预测标签“气球样变细胞”并且预测概率>95％的气球样变细胞的数目。
用于wsi的气球样变评分细胞比例被定义为气球样变细胞的数目与细胞总数的比率。
炎症
使用来自于rexhepaj等(eurrespirj.2015dec；46(6):1762-72)的方法仅从wsi的活检组织部分随机选择fov。
过滤掉具有大液泡结构的fov。
有经验的用户首先选择10个fov。
将模型应用于来自于上述fov的所有细胞快照，并计算类别概率和预测类别标签(最高概率标签)。
用于wsi的炎症评分细胞计数被定义为具有预测标签“炎性细胞”并且预测概率>95％的炎性细胞的数目。
如kleiner等(2005)所定义的炎症评分由有经验的用户在上述10个fov上手动确定。
nash纤维化
将在训练模型中定义的模型应用于所有预先归一化的fov中的宏观图案nash纤维化上。
在来自于kleiner等(2005)的指南的基础上确定nash纤维化评分。
肝纤维化
将在训练模型中定义的模型应用于所有预先归一化的fov中的宏观图案肝纤维化上。
将肝纤维化评分定义为：
所有fov上的平均分形指数。
将被预测为门区的fov排除在外的所有fov上的平均分形指数。
确定每种fov类别的平均分形指数。
根据另一方面，本发明还涉及包括脂肪变性图案识别和评分在内的完全自动化和/或数字化。脂肪变性评分可以通过经典方法或使用dl方法的图案识别和评分来确定。
最后，本发明提供了计算病理学流程的创新功能，它们是：
1)图案识别
·脂肪变性：
-用于过滤掉形态学上与脂质泡相似的假阳性区(看起来像脂质泡但属于血管结构的白色空间)的算法。
-用于选择性过滤掉形态学上不与脂质泡相似的白色区域(过于小，或足够大但不对应于预先确定的形态学特性)的算法。
-半自动辅助法，用于帮助人类注释者提供隐含的脂肪变性的更稳健的估算。
·炎症
-用于在炎性细胞核与正常肝细胞核之间做出区分的新的图案识别方法和模型。
-用于从数字化活检样品图像识别门区的新的图案识别方法和模型。
-将基于细胞的预测转变成临床炎性评分的方法。
·气球样变
-在气球样变肝细胞的图案识别模型和形态判据的基础上用于在气球样变的核与正常肝细胞之间做出区分的新的图案识别方法和模型。
·纤维化
-用于区分活检组织切片中的主要纤维化图案的新的图案识别方法和模型。
-用于过滤掉载片的区域以便避免与来自非病理性胶原阳性区域的偏差的新方法。
-使用隔膜分析用于提高纤维化评分3和4的间隔尺寸(granularity)的用于亚组分析的新方法。
2)数据管理和分析
-基于现有组织病理学和分析知识，作者们定义了代表关键图案和细胞类型的数学模型。
-在实验期间产生可能被错误地解释的数据的潜在伪影的模型
-被开发并整合到工作流程中以应对染色变异性并便于所有上述图案识别模型的泛化的新方法。
-大多数上述工作是基于在现有数据分析和组织病理学领域知识的基础上改编/修改的现有技术。
-所有现有方法均受许可覆盖，允许进行全面开发和商业化。
在某些实施方式中，由于本发明的方法，可以做出决定以为对象提供生活方式建议或提供至少一种nafld、nash或肝纤维化疗法。这种将对象分为接受者或tbt患者的分类是基于dl模型应用和与ntbt相比的肝细胞气球样变、小叶炎症和纤维化的评分。
因此，本发明还涉及抗nafld、抗nash或抗纤维化化合物，其用于在有需要的对象中治疗nafld、nash或肝纤维化的方法中，其中所述对象由于根据本发明的方法而被鉴定。
说明性的抗nash和抗纤维化化合物如下列出：
-式(i)的化合物
其中：
x1表示卤素、r1或g1-r1基团；
a表示ch＝ch或ch2-ch2基团；
x2表示g2-r2基团；
g1和g2相同或不同，表示氧或硫原子；
r1表示氢原子、未取代的烷基、芳基或被一个或多个卤素原子、烷氧基或烷硫基、环烷基、环烷硫基或杂环基团取代的烷基；
r2表示至少被–coor3基团取代的烷基，其中r3表示氢原子或被或未被一个或多个卤素原子、环烷基或杂环基团取代的烷基；
r4和r5相同或不同，表示被或未被一个或多个卤素原子、环烷基或杂环基团取代的烷基；
或其可药用盐；
-乙酰辅酶a羧化酶抑制剂如gs-0976、nd-654、ac-8632和pf05175157；
-抗lps抗体如imm-124-e；
-顶端钠相互依赖性胆汁酸转运蛋白抑制剂如a-4250、volixibat、以前被称为shp-625的maralixibat、gsk-2330672、elobixibat和cj-14199；
-生物活性脂类如5-羟基二十碳五烯酸(15-hepe、ds-102)、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸；
-大麻素cb1受体拮抗剂如grc-10801、mri-1569、mri-1867、dbpr-211、am-6527、am-6545、ness-11-sm、cxb-029、gcc-2680、tm-38837、org-50189、pf-514273、bms-812204、zyo-1、azd-2207、azd-1175、奥替那班、伊必那班、溴乙那班、利莫那班、屈那班、slv-326、v-24343和o-2093；
-半胱天冬酶抑制剂如恩利卡生、belnacasan、nivocasan、idn-7314、f-573、vx-166、yjp-60107、mx-1122、idn-6734、tlc-144、sb-234470、idn-1965、vx-799、sdz-220-976和l-709049；
-组织蛋白酶抑制剂如vby-376、vby-825、vby-036、vby-129、vby-285、org-219517、ly3000328、rg-7236和bf/pc-18；
-ccr拮抗剂如cenicriviroc(ccr2/5拮抗剂)、pg-092、rap-310、incb-10820、rap-103、pf-04634817和ccx-872；
-二酰基甘油-o-酰基转移酶(dgat)抑制剂如以前被称为isis-dgat2rx的ionis-dgat2rx、ly-3202328、bh-03004、kr-69530、ot-13540、azd-7687和abt-046；
-二肽基肽酶iv(dpp4)抑制剂依格列汀、维格列汀、福格列汀、阿格列汀、沙格列汀、tilogliptin、安奈格列汀、西他列汀、瑞格列汀、美格列汀、戈格列汀、曲格列汀、替格列汀、杜格列汀、利格列汀、吉格列汀、yogliptin、betagliptin、imigliptin、奥格列汀、维达列汀和地格列汀；
-双重nox(nadph氧化酶)1&4抑制剂，如以前被称为gkt137831的gkt-831(2-(2-氯苯基)-4-[3-(二甲基氨基)苯基]-5-甲基-1h-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2h,5h)-二酮)和gkt-901；
-细胞外基质蛋白调节剂如cnx-024、cnx-025和sb-030；
-脂肪酸合酶(fas)抑制剂如tvb-2640、tvb-3664、tvb-3166、tvb-3150、tvb-3199、tvb-3693、bzl-101、2-十八碳炔酸、mdx-2、fasnall、mt-061、g28ucm、mg-28、hs-160、gsk-2194069、kd-023和西洛他唑；
-硬脂酰coa去饱和酶-1抑制剂/脂肪酸胆汁酸偶联物(fabac)；
-法尼酯x受体(fxr)激动剂如奥贝胆酸(oca)、gs-9674、ljn-452、edp-305、akn-083、int-767、gnf-5120、ly2562175、inv-33、ntx-023-1、ep-024297、px-103、sr-45023；
-成纤维细胞生长因子19(fgf-19)重组体如ngm-282；
-成纤维细胞生长因子21(fgf-21)激动剂如以前被称为bms-986036的peg-fgf21、yh-25348、bms-986171、yh-25723、ly-3025876和nnc-0194-0499；
-半乳凝素3抑制剂如gr-md-02、td-139、ang-4021、galectin-3c、ljpc-201、tfd-100、gr-md-03、gr-md-04、gm-md-01、gm-ct-01、gm-ct-02、gal-100和gal-200；
-胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物如索马鲁肽、利拉鲁肽、艾塞那肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利西拉肽、洛塞那肽、efpeglenatide、taspoglutide、mkc-253、dlp-205和ormd-0901；
-glp-1受体激动剂；
-g-蛋白偶联受体(gpcr)调节剂如cnx-023；
-整合蛋白抑制剂：plianttherapeutic的整合蛋白抑制剂，indalotherapeutics的整合蛋白抑制剂，stlouisuniversity的整合蛋白抑制剂，proagio和gsk-3008348；
-白三烯(lt)/磷酸二酯酶(pde)/脂氧合酶(lo)抑制剂如tipelukast(以前被称为mn-001)、托鲁司特、硫鲁司特、masilukast、扎鲁司特、普鲁司特、孟鲁司特、gemilukast、维鲁司特、aklukast、pobilikast、西那司特和伊拉司特；
-大环内酯类：索利霉素，阿奇霉素和红霉素；
-mirna拮抗剂如以前被称为azd4076的rg-125、rgls-5040、rg-101、mgn-5804和mrg-201；
-mmp9刺激剂如elastomicab的mmp9刺激剂；
-单克隆抗体如柏替木单抗、ngm-313、靶向il-20的mab、以前被称为gc1008的fresolimumab(抗tgfβ抗体)、以前被称为btt-1023的timolumab、namacizumab、奥马珠单抗、雷珠单抗、贝伐单抗、lebrikizumab、依帕珠单抗、felvizumab、马妥珠单抗、monalizumab、瑞利珠单抗、inebilizumab、foralumab(ni-0401、抗-cd3)、simtizumab(gs-6624)、针对loxl2的mab和抗tnf抗体优特克单抗；
-mtor调节剂如msdc-0602、与svp-西罗莫司共同给药的aav基因疗法；
-核受体配体如以前被称为dv928的dur-928；
-p2y13蛋白激动剂如cer-209；
-蛋白酶活化受体(par)-2拮抗剂如pz-235和np-003；
-蛋白激酶调节剂如cnx-014、mb-11055、alf-1、芒果苷、氨来呫诺、gs-444217、reg-101和缬氨酸；
-pparα激动剂如非诺贝特、环丙贝特、pemafibrate、吉非罗齐、氯贝丁酯、比尼贝特、克利贝特、氯贝酸、尼可贝特、吡贝特、普拉贝脲、罗尼贝特、theofibrate、托考贝特和sr10171；
-pparγ激动剂如吡格列酮、氘化吡格列酮、罗格列酮、efatutazone、atx08-001、oms-405、chs-131、thr-0921、ser-150-dn、kdt-501、ged-0507-34-levo、clc-3001和all-4；
-pparδ激动剂如gw501516(endurabol或({4-[({4-甲基-2-[4-(三氟甲基)苯基]-1,3-噻唑-5-基}甲基)硫烷基]-2-甲基苯氧基}乙酸))或mbx8025(seladelpar或{2-甲基-4-[5-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-2h-[l,2,3]三唑-4-基甲基硫烷基]-苯氧基}-乙酸)或gw0742([4-[[[2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基-5-噻唑基]甲基]硫基]-2-甲基苯氧基]乙酸)或l165041或hpp-593或ncp-1046；
-pparα/γ激动剂如saroglitazar、阿格列扎、莫格列扎、tesaglitazar和dsp-8658；
-pparα/δ激动剂如elafibranor、t913659；
-pparγ/δ激动剂如共轭亚油酸(cla)如t3d-959；
-pparα/γ/δ激动剂或ppar泛激动剂如iva337或tta(十四烷基硫代乙酸)或补骨脂二氢黄酮甲醚或gw4148或gw9135、或苯扎贝特或lobeglitazone或cs038；
-rho相关蛋白激酶2(rock2)抑制剂如kd-025、trx-101、ba-1049、lyc-53976、ins-117548和rki-1447；
-信号调控激酶1(ask1)抑制剂如gs-4997；
-钠-葡萄糖转运(sglt)2抑制剂，如remogliflozin，达格列净，恩格列净，埃格列净，sotagliflozin，伊格列净，tianagliflozin，坎格列净，托格列净，janagliflozin，bexagliflozin，鲁格列净，舍格列净，hec-44616，ast-1935和pld-101；
-硬脂酰coa去饱和酶-1抑制剂/脂肪酸胆汁酸偶联物如aramchol、grc-9332、steamchol、tsn-2998、gsk-1940029和xen-801；
-甲状腺激素受体β(thrβ)激动剂，如vk-2809，mgl-3196，mgl-3745，skl-14763，sobetirome，bct-304，zyt-1，mb-07811和伊罗替罗；
-toll样受体2和4(tlr-2和4)拮抗剂如纳曲酮、jkb-121、m-62812、瑞沙托维、dendrophilin、cs-4771、ayuv-1、ayuv-25、ni-0101、eda-hpve7和eritoran；
-酪氨酸激酶受体(rtk)调节剂、cnx-025和kbp-7018；
-血管黏附蛋白-1(vap-1)抑制剂如pxs-4728a、cp-664511、prx-167700、asp-8232、rtu-1096、rtu-007和btt-1023；
-维生素d受体(vdr)激动剂如钙化醇、阿法骨化醇、1,25-二羟基维生素d3、维生素d2、维生素d3、骨化三醇、维生素d4、维生素d5、双氢速甾醇、钙泊三醇、他卡西醇、1,24-二羟基维生素d3和帕立骨化醇；
-乙酰辅酶a羧化酶抑制剂如gs-0976、nd-654、ac-8632、和pf05175157；
-其他乙酰辅酶a羧化酶抑制剂如cp640186、gemcabene和mk-4074；
-腺苷a3受体激动剂如2-(1-己炔基)-n-甲基腺苷、piclidenosoncf101(ib-meca)、namodenosoncf-102、2-cl-ib-meca、cp-532,903、肌苷、luf-6000和mrs-3558；
-醛固酮拮抗剂和盐皮质激素受体拮抗剂如apararenone(mt3995)、阿米洛利、螺内酯、依普利酮、坎利酮和坎利酸钾、孕酮、屈螺酮、孕二烯酮和贝尼地平；
-amp活化蛋白激酶刺激剂如pxl-770、mb-11055、debio-0930b、甲福明、cnx-012、o-304、芒果苷钙盐、艾曲波帕、carotuximab和imeglimin；
-胰淀素受体激动剂和降钙素受体激动剂包括但不限于kbp-042和kbp-089；
-靶向转化生长因子β2的反义寡核苷酸，包括但不限于asph-0047、imc-tr1和isth-0047；
-血管生成素相关蛋白-3抑制剂如aro-ang3、ionis-anggptl3-lrx或akcea-angptl3lrx、evinacumab和aln-ang；
-抗lps抗体如imm-124-e；
-顶端钠相互依赖性胆汁酸转运蛋白抑制剂如a-4250、volixibat、以前被称为shp-625的maralixibat、gsk-2330672、elobixibat和cj-14199；
-无水甜菜碱或rm-003；
-胆汁酸如奥贝胆酸(oca)和udca、去甲熊去氧胆酸和熊二醇；
-生物活性脂类如5-羟基二十碳五烯酸(15-hepe、ds-102)；
-大麻素cb1受体拮抗剂如grc-10801、mri-1569、mri-1867、dbpr-211、am-6527、am-6545、ness-11-sm、cxb-029、gcc-2680、tm-38837、org-50189、pf-514273、bms-812204、zyo-1、azd-2207、azd-1175、奥替那班、伊必那班、溴乙那班、利莫那班、屈那班、slv-326、v-24343和o-2093；
-大麻素cb2受体模拟物如anabasum(resunab、jkt-101)；
-半胱天冬酶抑制剂如恩利卡生(emricasan)、belnacasan、nivocasan、idn-7314、f-573、vx-166、yjp-60107、mx-1122、idn-6734、tlc-144、sb-234470、idn-1965、vx-799、sdz-220-976、l-709049；
-组织蛋白酶抑制剂如vby-376、vby-825、vby-036、vby-129、vby-285、org-219517、ly3000328、rg-7236、bf/pc-18；
-ccr拮抗剂如cenicriviroc(ccr2/5拮抗剂)、pg-092、rap-310、incb-10820、rap-103、pf-04634817、ccx-872；
-ccr3趋化因子调节物和嗜酸性粒细胞趋化因子2配体抑制剂；
-二酰基甘油-o-酰基转移酶(dgat)抑制剂如以前被称为isis-dgat2rx的ionis-dgat2rx、ly-3202328、bh-03004、kr-69530、ot-13540、azd-7687、abt-046；
-二肽基肽酶iv(dpp4)抑制剂依格列汀、维格列汀、福格列汀、阿格列汀、沙格列汀、tilogliptin、安奈格列汀、西他列汀、瑞格列汀、美格列汀、戈格列汀、曲格列汀、替格列汀、杜格列汀、利格列汀、吉格列汀、yogliptin、betagliptin、imigliptin、奥格列汀、维达列汀、地格列汀；
-双重nox(nadph氧化酶)1&4抑制剂如以前被称为gkt137831的gkt-831、gkt-901；
-细胞外基质蛋白调节剂cnx-024、cnx-025、sb-030；
-硬脂酰coa去饱和酶-1抑制剂/脂肪酸胆汁酸偶联物(fabac)；
-法尼酯x受体(fxr)激动剂如奥贝胆酸(oca)、gs-9674、ljn-452、edp-305、akn-083、int-767、gnf-5120、ly2562175、inv-33、ntx-023-1、ep-024297、px-103、sr-45023；
-脂肪酸如ω-3脂肪酸、omacor或mf4637、鱼油、多不饱和脂肪酸(efamax、optiepa)；
-脂肪酸合酶(fas)抑制剂如tvb-2640、tvb-3199、tvb-3693、bzl-101、2-十八碳炔酸、mdx-2、fasnall、mt-061、g28ucm、mg-28、hs-160、gsk-2194069、kd-023和西洛他唑；
-成纤维细胞生长因子19(fgf-19)受体配体或fgf-19的有功能的工程化变体；
-成纤维细胞生长因子19(fgf-19)重组体如ngm-282；
-成纤维细胞生长因子21(fgf-21)激动剂如以前被称为bms-986036的peg-fgf21、yh-25348、bms-986171、yh-25723、ly-3025876、nnc-0194-0499；
-半乳凝素3抑制剂如gr-md-02、td-139、ang-4021、galectin-3c、ljpc-201、tfd-100、gr-md-03、gr-md-04、gm-md-01、gm-ct-01、gm-ct-02、gal-100、gal-200；
-胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物如索马鲁肽、利拉鲁肽、艾塞那肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利西拉肽、洛塞那肽、efpeglenatide、taspoglutide、mkc-253、dlp-205、ormd-0901；
-glp-1受体激动剂如ly-3305677和长效胃泌酸调节素；
-g-蛋白偶联受体(gpcr)调节剂如cnx-023；
-g-蛋白偶联受体84拮抗剂(gpr84拮抗剂)、结缔组织生长因子配体抑制剂和游离脂肪酸受体1激动剂(ffar1激动剂)如pbi-4050、pbi-4265、pbi-4283和pbi-4299；
-生长激素；
-刺猬细胞信号传导途径抑制剂如vismodegib、tak-441、ipi-926、saridegib、索尼德吉/erismodegib、bms-833923/xl139、pf-04449913、taladegib/ly2940680、ets-2400、shr-1539和cur61414；
-回肠胆汁酸钠共转运蛋白抑制剂如a-4250、gsk-2330672、volixibat、cj-14199和elobixibat；
-免疫调节剂如pbi-4050、pbi-4265、pbi-4283、pbi-4299和aic-649；
-胰岛素敏化剂和mch受体-1拮抗剂如msdc-0602k、msdc-0602、csti-100和amri；
-整合蛋白抑制剂，如plianttherapeutic的整合蛋白抑制剂，indalotherapeutics的整合蛋白抑制剂，stlouisuniversity的整合蛋白抑制剂，proagio、gsk-3008348；
-己酮糖激酶抑制剂如jnj-28165722、jnj-42065426、jnj-42152981、jnj-42740815、jnj-42740828和pf-06835919；
-白三烯(lt)/磷酸二酯酶(pde)/脂氧合酶(lo)抑制剂如tipelukast(以前被称为mn-001)、托鲁司特、硫鲁司特、masilukast、扎鲁司特、普鲁司特、孟鲁司特、gemilukast、维鲁司特、aklukast、pobilikast、西那司特、伊拉司特；
-赖氨酰氧化酶同源物2抑制剂如rappaport、intermune、pharmaxis、ab-0023、simtuzumab、pxs-5382a和pxs-5338；
-大环内酯类：索利霉素，阿奇霉素和红霉素；
-mirna拮抗剂如以前被称为azd4076的rg-125、rgls-5040、rg-101、mgn-5804、mrg-201；
-巨噬细胞甘露糖受体调节剂如ab-0023、mt-1001、[18f]fb18mhsa、xemys、锝tc99mtilmanocept和cdx-1307；
-甲基cpg结合蛋白2调节剂和转谷氨酰胺酶抑制剂，包括但不限于半胱胺、ec半胱胺、肠溶包衣重酒石酸半胱胺、bennu的重酒石酸半胱胺(肠溶包衣)、raptor的重酒石酸半胱胺(肠溶包衣)、重酒石酸半胱胺、dr半胱胺、延迟释放的肠溶包衣重酒石酸半胱胺、巯基乙胺、bennu的巯基乙胺(肠溶包衣)、raptor的巯基乙胺(肠溶包衣)、rp-103、rp-104、procysbi和巯基乙胺(肠溶包衣)；
-金属蛋白酶mmp9刺激剂如elastomicab的mmp9刺激剂；
-线粒体载体蛋白家族抑制剂和线粒体磷酸载体蛋白抑制剂包括但不限于tro-19622、trophos、奥利索西、rg-6083或ro-7090919；
-髓过氧化物酶抑制剂包括但不限于pf-06667272；
-单克隆抗体如柏替木单抗、ngm-313、靶向il-20的mab、以前被称为gc1008的fresolimumab(抗tgfβ抗体)、以前被称为btt-1023的timolumab、namacizumab、奥马珠单抗、雷珠单抗、贝伐单抗、lebrikizumab、依帕珠单抗、felvizumab、马妥珠单抗、monalizumab、瑞利珠单抗和inebilizumab；
-mtor调节剂如msdc-0602、与svp-西罗莫司共同给药的aav基因疗法；
-nad依赖性脱乙酰酶sirtuin刺激剂，pde5抑制剂如ns-0200；
-nf-κb抑制剂如lc-280126；
-烟酸如尼克酸或维生素b3；
-烟酸受体(gpr109)激动剂如ari-3037mo、mmf、luf6283、阿昔呋喃、ibc293、mk-1903、gsk256073、mk-6892、mk-0354、slx-4090、洛美他派、lexibulin、apabetalone、阿昔呋喃、拉罗皮兰、达珀利奈、安塞曲匹、incb-19602、st-07-02、洛美沙星、尼克酸和受控释放/拉罗皮兰；
-硝唑尼特(ntz)、其活性代谢物替唑尼特(tz)或tz的其他前体药物例如rm-5061；
-非甾类消炎药(nsaid)包括但不限于f-351、水杨酸酯(阿司匹林)、对乙酰氨基酚、丙酸衍生物(布洛芬、萘普生)、乙酸衍生物(吲哚美辛、双氯芬酸)、烯醇酸衍生物(吡罗昔康、保泰松)、邻氨基苯甲酸衍生物(甲氯芬酸、氟芬那酸)、选择性cox-2抑制剂(塞来昔布、帕瑞昔布)和磺酰苯胺类(尼美舒利)；
-核受体配体如以前被称为dv928的dur-928；
-p2y13蛋白激动剂如cer-209；
-pdgfr调节剂如bot-501和bot-191；
-苯丙氨酸羟化酶刺激剂如pegvaliase、沙丙蝶呤、aav-pah、cdx-6114、墨蝶呤、rmn-168、altu-236、etx-101、hepastem、咯利普兰和前列地尔；
-蛋白酶活化受体(par)-2拮抗剂如pz-235、np-003；
-蛋白激酶调节剂如cnx-014、mb-11055、alf-1、芒果苷、氨来呫诺、gs-444217、reg-101、缬氨酸；
-pparα激动剂如非诺贝特、环丙贝特、pemafibrate、吉非罗齐、氯贝丁酯、比尼贝特、克利贝特、氯贝酸、尼可贝特、吡贝特、普拉贝脲、罗尼贝特、theofibrate、托考贝特、sr10171；
-pparγ激动剂如吡格列酮、氘化吡格列酮、罗格列酮、efatutazone、atx08-001、oms-405、chs-131、thr-0921、ser-150-dn、kdt-501、ged-0507-34-levo、clc-3001、all-4；
-pparδ激动剂如gw501516(endurabol或({4-[({4-甲基-2-[4-(三氟甲基)苯基]-1,3-噻唑-5-基}甲基)硫烷基]-2-甲基苯氧基}乙酸))或mbx8025(seladelpar或{2-甲基-4-[5-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-2h-[l,2,3]三唑-4-基甲基硫烷基]-苯氧基}-乙酸)或gw0742([4-[[[2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基-5-噻唑基]甲基]硫基]-2-甲基苯氧基]乙酸)或l165041或hpp-593或ncp-1046；
-pparα/γ激动剂如saroglitazar、阿格列扎、莫格列扎、tesaglitazar、dsp-8658；
-pparα/δ激动剂如elafibranor、t913659；
-pparγ/δ激动剂如共轭亚油酸(cla)、t3d-959；
-pparα/γ/δ激动剂或ppar泛激动剂如iva337或tta(十四烷基硫代乙酸)或补骨脂二氢黄酮甲醚或gw4148或gw9135或苯扎贝特或lobeglitazone或cs038；
-rho相关蛋白激酶2(rock2)抑制剂如kd-025、trx-101、ba-1049、lyc-53976、ins-117548、rki-1447；
-信号调控激酶1(ask1)抑制剂如gs-4997；
-钠-葡萄糖转运(sglt)2抑制剂如remogliflozin、达格列净、恩格列净、埃格列净、sotagliflozin、伊格列净、tianagliflozin、坎格列净、托格列净、janagliflozin、bexagliflozin、鲁格列净、舍格列净、hec-44616、ast-1935、pld-101；
-硬脂酰coa去饱和酶-1抑制剂/脂肪酸胆汁酸偶联物如aramchol、grc-9332、steamchol、tsn-2998、gsk-1940029、xen-801；
-甲状腺受体β(thrβ)激动剂如vk-2809、mgl-3196、mgl-3745、skl-14763、sobetirome、bct-304、zyt-1、mb-07811、伊罗替罗；
-toll样受体4(tlr-4)拮抗剂如纳曲酮、jkb-121、m-62812、瑞沙托维、dendrophilin、cs-4771、ayuv-1、ayuv-25、ni-0101、eda-hpve7、eritoran；
-酪氨酸激酶受体(rtk)调节剂如cnx-025、kbp-7018；
-血管黏附蛋白-1(vap-1)抑制剂如pxs-4728a、cp-664511、prx-167700、asp-8232、rtu-1096、rtu-007、btt-1023；
-维生素d受体(vdr)激动剂如钙化醇、阿法骨化醇、1,25-二羟基维生素d3、维生素d2、维生素d3、骨化三醇、维生素d4、维生素d5、双氢速甾醇、钙泊三醇、他卡西醇、1,24-二羟基维生素d3、帕立骨化醇；
-维生素e和异构体、与维生素c和阿托伐他汀组合的维生素e。
在特定实施方式中，所述fas抑制剂是选自下面的化合物列表的化合物：
在另一个特定实施方式中，所述fas抑制剂选自：
在特定实施方式中，所述fas抑制剂是tvb-2640。
其他抗nash药剂包括kb-ge-001和ngm-386和ngm-395和nc-10以及tcm-606f。其他抗nash药剂包括icosabutate、nc-101、naia-101考来维仑和prc-4016。
可用于本发明的实践的说明性、非限制性抗纤维化药剂包括：
-血管紧张素ii受体阻断剂包括但不限于厄贝沙坦；
-靶向转化生长因子β2(tgf-β2)的反义寡核苷酸；
-生物活性脂质；
-半胱天冬酶抑制剂；
-双重法尼酯x受体(fxr)/tgr5激动剂；
-nox(nadph氧化酶)抑制剂，例如双重nox(nadph氧化酶)1&4抑制剂；
-半乳凝素3抑制剂；
-免疫调节剂；
-整合蛋白抑制剂；
-巨噬细胞甘露糖受体调节剂；
-金属蛋白酶-9(mmp-9)刺激剂；
-单克隆抗体；
-nf-κb抑制剂；
-非甾类消炎药(nsaid)；和
-pdgfr调节剂。
其他抗纤维化药剂包括hec-585、inv-240、rnai治疗剂(例如silencetherapeutics)和samirna程序(bioneercorp)。
其他说明性抗纤维化药剂包括吡非尼酮或受体酪氨酸激酶抑制剂(rtki)例如尼达尼布、索拉非尼和其他rtki，或血管紧张素ii(at1)受体阻断剂，或ctgf抑制剂，或容易干扰tgfβ和bmp激活的途径的任何抗纤维化化合物，包括潜在tgfβ复合体的激活剂例如mmp2、mmp9、thbs1或细胞表面整合蛋白，tgfβ受体i型(tgfbri)或ii型(tgfbrii)和它们的配体例如tgfβ、激活素、抑制素、nodal、抗苗勒管激素、gdf或bmp，辅助共受体(也被称为iii型受体)，或smad依赖性经典途径的组分包括调节性或抑制性smad蛋白，或smad非依赖性或非经典途径(包括mapk信号传导、tak1、rho样gtp酶信号传导途径、磷脂酰肌醇-3激酶/akt途径、tgfβ诱导的emt过程或包括hh配体或靶基因在内的经典和非经典刺猬信号传导途径的各种支分)的成员，或wnt或容易影响tgfβ的notch途径的任何成员。
根据特定实施方式，所述抗纤维化药剂不是选自下述的药剂：吡非尼酮或受体酪氨酸激酶抑制剂(rtki)例如尼达尼布、索拉非尼和其他rtki，或血管紧张素ii(at1)受体阻断剂，或ctgf抑制剂，或容易干扰tgfβ和bmp激活的途径的任何抗纤维化化合物，包括潜在tgfβ复合体的激活剂例如mmp2、mmp9、thbs1或细胞表面整合蛋白，tgfβ受体i型(tgfbri)或ii型(tgfbrii)和它们的配体例如tgfβ、激活素、抑制素、nodal、抗苗勒管激素、gdf或bmp，辅助共受体(也被称为iii型受体)，或smad依赖性经典途径的组分(包括调节性或抑制性smad蛋白)，或smad非依赖性或非经典途径(包括mapk信号传导、tak1、rho样gtp酶信号传导途径、磷脂酰肌醇-3激酶/akt途径、tgfβ诱导的emt过程或包括hh配体或靶基因在内的经典和非经典刺猬信号传导途径的各种支分)的成员，或wnt或容易影响tgfβ的notch途径的任何成员。
在特定实施方式中，nash或肝纤维化的治疗包括给药选自下述的式(i)的化合物：1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮，1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-异丙氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮，1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮，1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮，1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮，1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮，1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮，2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基丙酸和2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基-丙酸异丙酯，或其可药用盐。在本发明的其他特定实施方式中，所述式(i)的化合物是1-[4-甲基硫苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮或其可药用盐。
应该理解，上面的描述以及后文的实施例旨在说明而不是限制本发明的范围。对于本发明所属领域的技术人员来说，在本发明的范围之内的其他方面、优点和修改将是显而易见的。
具体实施方式
材料和方法
临床前研究设计
将来自于从开发组群i(n＝111)选出的用h&e染色的活检组织样品的细胞快照用于训练、测试和校验气球样变和炎症预测模型。
对于这些模型的独立校验来说，我们使用了来自于组群ii(n＝92)的一组细胞快照(图2)。
在所述训练、测试和校验组群(iii-v)中，将动物喂食增补有胆固醇的缺乏胆碱、限定l-氨基酸的饮食(cdaa/chol饮食)以诱导纤维化。
组群iii(n＝72)被用于训练和校准纤维化分期预测方法。
组群iv(n＝28)和v(n＝105)被用于独立校验(图2)。并行地，专业用户为所述研究中包括的所有在这些样品评估nash活动(即炎症和气球样变的肝细胞)和kleiner纤维化分期。
一个另外的组群(组群vi，n＝79)被用于炎症定量流程的独立校验。
所有炎症、气球样变和纤维化分期注释由专业组织学家做出。对于气球样变参数来说，专业用户数字化注释(在所有活检组织样品中)所有存在的气球样变细胞和少量邻近正常肝细胞。
成像
使用内部开发的数据管理流程，将所有数字化的载片分解成512x512像素的拼图(图3)。为了对nash活动进行评分，从几张切片选择代表炎性细胞和气球样变肝细胞的20x下的单独的细胞快照。为每个模型选择相等数目的正常肝细胞的快照作为阴性对照(图4a)。为了对肝纤维化进行评分，选择代表肝纤维化的主要组织学图案的510个视野(fov)作为训练集(图4b)。使用173个fov的单独的测试集来选择用于进一步校验的最佳模型。然后选择由肝纤维化dl模型所定义的病理学相关fov(阴性、窦周、门周、桥接)，用于胶原形态计量学测量。开发了一种内部(不依赖于染色剂的)算法将所有组织学图像(在给定的分辨率下)归一化到参比图像。在这个归一化步骤后，我们对病理学相关fov应用隔膜形态测量算法和cpa定量(图4c)。在人工排除重要的血管区之后，专业注释者在训练组群的所有样品上独立地定量(3dhistotech，quantcenter)cpa水平。
在数字化后，对数字载玻片进行处理以提取高(20x0.5μm)和低放大倍数的表述图(4x2μm)。对于纤维化cpa的半自动化定量来说，专业注释者从每个样品数字表述图人工排除重要的血管区域。在图像分析之前手动调整将胶原与染色背景分开的半自动化强度阈值，以便实现最佳的可能定量结果(3dhistotech，quantcenter)。对于每个活检组织样品来说，在对所有fov进行dl纤维化分期图案识别后，独立地应用全自动cpa和隔膜分析流程，以定量胶原形态和总表达。使用dl预测过滤掉非病理性fov。为了能够比较炎症的全自动和手动评分，向炎症流程添加了ad-hoc步骤以：
a)发现wsi的组织区。
b)发现在显微镜下等同于20x高倍视野的所有fov。
c)在也不包括重要的门区的所检测的组织区域中自动并随机地选择20个fov。在第二个手动步骤中，专业注释者可以选择符合已建立的评分标准的前10个fov(kleiner,2005,41:1313-1321)。
d)使用所选的fov，将dl炎症模型应用于在20x下提取的单个细胞核。
如指南(kleiner,2005,41:1313-1321)所定义的，由组织学家对相同的fov手动进行评分，以与自动评分进行比较。
统计学习
卷积神经网络(cnn)被用于构建检测炎性细胞、气球样变肝细胞的各个模型和识别nash纤维化的组织学图案的第三个模型。对于所有cnn来说，初始权重和体系结构改编自先前在imagenet数据集(deng，2009)上训练的网络(szegedy，2015)。然后将fov预测转化成nashkleiner纤维化分期，以与对应的病理学家评分进行比较。
如指南(kleiner,2005,41:1313-1321)所定义的，将来自于dl肝纤维化评分的fov预测转化成nashkleiner纤维化评分，以与对应的病理学家评分进行比较。在活检组织水平上cpa被报告为病理性胶原总面积与活检组织总面积的比率。使用cohen’skappa来定量在所有可用组群上手动和全自动纤维化评分之间的一致性。
结果
nash小叶炎症dl模型的开发
在第一次学习迭代中，采用了学习步骤的逐步迭代(图5a)。鉴定并探索了损失函数(即阴性似然比)的几个本地最小值。选择最佳网络(训练损失和校验损失之间的最佳权衡)作为最终模型，在独立的数据集(组群i)中显示出区分炎性细胞与正常肝细胞的优异的准确性(91％)。
nash肝细胞气球样变dl模型的开发
将与炎症类似的开发方法用于这种cnn模型。有趣的是，在第二次迭代中实现了好得多的本地最小值探索(图5b)，并且对于区分气球样变细胞与正常肝细胞(组群i)同样显示出优异的准确性(98.2％)。此外，在571个气球样变的肝细胞的独立数据集中，526个气球样变的肝细胞被准确(92.1％)识别(组群ii)。
肝纤维化dl模型的开发
与炎症和气球样变模型相同，最佳地探索了cnn参数空间。最终模型在识别独立的校验集(组群iii)中的所有纤维化图案时显示出优异的准确性：(a)胶原阴性区域(在40个fov中99.24％准确度)，(b)胶原阳性窦(在35个fov中79％准确度)，(c)血管区(在35个fov中86％准确度)，(d)胶原阳性门脉三联管(在26个fov中88％准确度)，(e)桥接纤维化(在37个fov中92.24％准确度)。
肝纤维化形态计量学模型的开发
胶原强度水平的组群内和组群间变异性的初始评估显示出显著差异(图5c)。这说明了偏倚胶原形态计量学测量的可能影响和对归一化步骤的需要。在所述归一化步骤后，在训练组群中半自动和全自动cpa测量的比较显示出良好的相关性水平(图5d)。所述两组结果之间的差异由通过全自动方法移除的非病理性区域和背景染色造成。
纤维化模型的临床校验
不同纤维化评分(组群v)中的cpa水平的方差分析，显示出仅在全自动cpa测量上可见的在f0与f1(p-值＝0.006)或f2(p-值＝0.032)之间有显著差异(图6a-b)。胶原隔膜的形态分析(图6c)在不同类型的fov之间(即所有病理性fov中)显示出显著差异。由于预期随着疾病严重性(纤维化分期)发生胶原表达的形态变化，因此这些差异证实了dl预测的准确性。此外，在被转化成kleiner纤维化分期(kleiner,2005,41:1313-1321)的fovdl图案预测与由训练有素的组织学家手动确定的纤维化评分之间观察到良好的一致性(在训练集中k＝0.77)。
nash肝细胞气球样变图案识别模型的校验
选择最佳气球样变细胞检测dl模型(准确度＝98％，组群i)以在细胞水平上应用于校验组群(组群ii)上所有可用的活检样品。
研究了所述模型在所有注释的气球样变(n＝422)和相邻正常肝细胞(n＝149)上的校验。结果显示出在这个独立于组群的细胞集上优异的预测准确度(93.8％)(表1)。独立的注释者复审了假阳性(fp)和阴性(fn)预测的细胞，以调查错误标记的细胞注释的量(表1)。在fn中，第二复审者认为21/23的细胞是气球样变的肝细胞。
表1：源自于对校验组群ii的nash气球样变流程预测与手动注释的比较的列联表。粗体数字是由专业注释者和自动化流程正确预测的细胞的数目。斜体分别是第二独立复审者对假阳性和假阴性预测的注释。
下一步是将所述流程应用于全部活检样品并与手动注释进行比较。与炎症的定量相同，将气球样变模型应用于校验组群(n＝19)的子集。我们观察到评分之间在气球样变细胞计数方面的差异以及手动和自动气球样变评分之间的一致性(表2)。
表2：源自于作为代表性样品集的校验组群ii上的nash气球样变流程评分预测与手动注释的比较的列联表。粗体数字是由专业注释者和自动化流程正确预测的细胞的数目。
nash自动肝细胞小叶炎症流程的校验
首先将炎症流程应用于20个代表性样品(组群vi)以校验用于炎症评分的10个hpf的自动选择过程(图6)。基于显微术与wsi的评分之间平均病灶数目的比较显示出优异的相关性(r＝0.907)。此外，当病灶数被转化成评分(kleiner,2005,41:1313-1321)时，存在完美的一致性。这些结果显示出后一种方法适合于随访研究中所有剩余校验活检样品(组群vi)的大规模分析。
炎性细胞图案识别模型的校验
选择最佳炎性细胞检测dl模型(准确度＝91％，组群i)应用于全部组群(组群i和vi)。
考虑到重要的每个样品的细胞数(～106)并且为了获得完整数据(即整个活检样品)，将炎症的分析应用于代表了所有炎症评分的几个样品(n＝31)(组群i)。当观察总小叶炎症的分布时，观察到低和高评分之间的显著差异(p-值<0.001)。
纤维化图案识别模型的临床校验
所述深度学习算法在fov水平上预测纤维化组织学图案时显示出优异的准确性(准确度＝88％，组群iii)。此外，在转化成kleiner纤维化分期(kleiner,2005,41:1313-1321)的fov值与由训练有素的组织学家手动确定的纤维化评分之间观察到良好的一致性(在训练集中k＝0.77，并且在校验研究k＝0.93、k＝0.70)(表3)。
表3：源自于由专业组织学家所确定的和通过自动化纤维化评分流程所预测的nash纤维化评分的比较的列联表。(从左至右)表的左侧示出了来自于训练组群中的比较的结果，在中间我们示出了来自于第一个独立校验(组群iv)的结果，并且在右侧中描述了来自于第二个独立组群(组群v)上的校验的结果(粗体数字指示存在一致性的案例的数目)。
nash纤维化形态计量学分析流程的校验
将dl纤维化图案模型应用于所有可用的活检样品fov(组群iii-v)。在纤维化自动评分预测后，将这些数据与手动纤维化评分进行比较(表3)。对于胶原表达来说，调查了不同纤维化分期之间形态计量学测量的分布(组群v)。正如以前显示的(huang，2013)，在f0、f1&f2与f3之间存在cpa平均水平的显著差异(图7a)。然而，f1和f2中检测到的cpa水平仍然相近，这是由于在基础的活检组织切片中观察到的胶原量没有显著变化。在调查隔膜形态分析的分布(图7b)时，观察到这种度量更好地消除f1与f2之间的差异(p-值＝0.042)。
集成到生物图像分析软件例如qupath中
qupath提供了开发在自助服务应用中改善人工智能(ai)算法的终端用户体验的插件程序的能力(bankhead等，2017)。作者们说明了如何可以将dl模型集成在开源计算病理学软件(例如qupath)中以提高用户接受度和体验(图8)。
将所有流程集成到开源平台qupath中，允许用户审阅和验证最大化活动性评分(不仅如此，也集成了纤维化和脂肪变性流程)，在组织切片的数字表述图上使用感兴趣的区域(例如脂肪变性泡、炎性病灶、气球样变细胞、胶原纤维)的绘图作为评分/诊断辅助物(图9)。
结论：
深度学习范式可用于生成具有优异性能的模型，用于自动执行nash组织学解释。这样的自动解释在微观或宏观细胞(fov)水平和活检组织水平上都是准确的。在所有流程中集成稳健的归一化步骤，使量化过程无需任何修改即可扩展到新的组群。
气球样变评分可以高准确度全自动进行，并且也可以用作评分辅助(突出显示潜在的气球样变肝细胞)，确保不遗漏任何气球样变的肝细胞。
对于炎症的评分来说，基于wsi的方法可以替代基于显微术的方法。这种方法可以与dl炎性细胞图案识别和病灶计数相结合，以完全自动化所述评分过程。
关于纤维化模型，在活检组织水平上对预测进行汇总后，当与人类专家注释进行比较时验证了预测的临床评分的准确性。纤维化fov模式图案的预测对于cpa和隔膜定量也具有附加价值，可以将它们特别聚焦于活检组织切片的病理相关区域上。cpa和隔膜形态可用于更好地区分所有纤维化评分。
尽管已经提出了几种方法从活检组织图像自动定量胶原表达图案(cpa、隔膜形态学)，但是没有任何先前的研究证明自动化nash纤维化评分的可行性。我们展示了所述过程如何实现全自动，以及此外如何探索dl预测信息以聚焦于病理学相关区域中胶原表达的定量。
最后，将nash活动性水平与纤维化演变的风险相关联和将纤维化分期与长期肝脏结果(肝硬化、肝移植、hcc或肝死亡)的风险相关联的技术现状，支持了将dl用于评估纤维化演变成肝硬化的风险并用于估算长期严重并发症的风险。
将炎症和气球样变流程集成到qupath中，为用户提供了感兴趣的生物学信息(即病灶的位置、气球样变细胞的位置、脂肪变性的位置等)的定量结果和定性绘图。
与手动注释相比，集成在qupath中的基于dl的评分系统允许对活检组织中的所有细胞进行详尽且可重复的分析。例如，它们对专家更难以解释的特定细胞区域给予了特殊关注。这些预测评分可在临床前研究中用于高通量活性评分，并在将来作为临床应用的辅助诊断工具。
参考文献
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1.一种对来自于对象的肝活检组织中的肝细胞气球样变进行确定和评分的方法，所述方法包括：
-提供来自于所述对象的肝活检组织载片；
-将所述载片提交到深度学习模型，以识别肝细胞气球样变的图案并对来自于所述肝活检组织载片的肝细胞气球样变进行评分；
其中肝细胞气球样变如下在0至2的范围内评分：hb＝0，无肝细胞气球样变；hb＝1，中度肝细胞气球样变；和hb＝2，重度肝细胞气球样变。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述深度学习模型事先基于训练数据进行训练，所述训练数据从包含正常肝细胞和气球样变肝细胞的肝活检组织成像数据获得。
3.一种对来自于对象的肝活检组织中的肝细胞小叶炎症进行确定和评分的方法，所述方法包括：
-提供来自于所述对象的肝活检组织载片；
-将所述载片提交到深度学习模型，以识别肝细胞小叶炎症的图案并对来自于所述肝活检组织载片的肝细胞小叶炎症进行评分；
其中小叶炎症如下在0至3的范围内评分：li＝0，无炎症；li＝1，轻度炎症；li＝2，中度炎症；和li＝3，重度炎症。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述深度学习模型事先基于训练数据进行训练，所述训练数据从包含炎性细胞和正常肝细胞的肝活检组织成像数据获得。
5.根据权利要求3所述的方法，其中fov的选择还包括由一个或多个用户手动指定的fov。
6.一种在对象中诊断nash的方法，其中将根据权利要求1或2所确定的hb评分与根据权利要求3或4所确定的li评分相加以确定从0至5分级的活动性指数(ai)，其中如果ai≥2并且hb≥1且li≥1，则所述对象被诊断为nash对象。
7.一种在对象中诊断nash的方法，其中当根据权利要求1或2所确定的hb评分为至少1、根据权利要求3或4所确定的li评分为至少1、并且来自于同一对象的脂肪变性评分为至少1时，确诊nash。
8.一种对对象中的nash纤维化或肝纤维化进行确定和评分的方法，所述方法包括：
-提供来自于所述对象的肝活检组织载片；
-将所述载片提交到深度学习模型，以识别肝纤维化的图案和/或测量胶原比例面积(cpa)，并对来自于所述肝活检组织载片的肝纤维化进行评分；
其中肝纤维化如下评分：f＝0，无肝纤维化；f＝1，极少肝纤维化；f＝2，显著肝纤维化；f＝3，中度肝纤维化；和f＝4，重度肝纤维化。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述深度学习模型事先基于训练数据进行训练，所述训练数据从包含正常组织和含胶原组织的肝活检组织成像数据获得。
10.根据权利要求9所述的方法，训练数据来自于：
正常视野(fov)(无胶原)；
窦周fov(围绕窦分支的胶原)；
门周fov(围绕门区分支的胶原)；
门fov(存在于门区内的胶原)；和
桥接fov(以桥的形式存在于主要血管结构门区与中央静脉之间的胶原)。
11.一种对对象中的肝脏脂肪变性或肝脂肪变性进行确定和评分的方法，所述方法包括：
-提供来自于所述对象的肝活检组织载片；
-将所述载片提交到自动化过程，以识别来自于所述肝活检组织载片的肝脂肪变性或肝脏脂肪变性的图案；
其中肝脂肪变性或肝脏脂肪变性如下评分：s＝0，小于5％的脂肪变性；s＝1，6％-33％的脂肪变性；s＝2，34％-66％的脂肪变性；和s＝3，大于66％的脂肪变性。
12.一种对对象中的肝脏脂肪变性或肝脂肪变性进行确定和评分的方法，所述方法包括：
-提供来自于所述对象的肝活检组织载片；
-将所述载片提交到深度学习模型，以识别来自于所述肝活检组织载片的肝脂肪变性或肝脏脂肪变性的图案；
其中肝脂肪变性或肝脏脂肪变性如下评分：s＝0，小于5％的脂肪变性；s＝1，6％-33％的脂肪变性；s＝2，34％-66％的脂肪变性；和s＝3，大于66％的脂肪变性。
13.一种基于脂肪变性细胞图案识别、细胞大小和形态分析来表征对象中的微观脂肪变性和宏观脂肪变性并在肝活检组织中进行评分的方法。
14.一种指定与门静脉、窦、小叶静脉或其他亚结构相关的特定组织学图案的定位和分布并提供关于肝脏病理的补充信息的工具。
15.一种基于使用深度学习模型对来自于对象的肝活检组织进行图案识别和评分来将所述对象分类为用于nash和/或nash纤维化或肝纤维化治疗的潜在接受者(tbt)或非接受者(ntbt)的方法。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述深度学习模型是在权利要求1至13所述的方法中执行的深度学习模型。
17.根据权利要求16所述的方法，其中tbt对象和ntbt对象具有下述肝活检组织等级：
a)tbt1：
脂肪变性评分≥1
肝细胞气球样变评分≥1
小叶炎症评分≥1
nas(nafld活动评分)≥4
纤维化分期≥1(例如纤维化分期等于1、2、3或4)
ntbt1：
与tbt1的差异在于在任何的脂肪变性评分、肝细胞气球样变评分、小叶炎症评分、nas或纤维化分期中低至少一级；
或
b)tbt2：
脂肪变性评分≥1
肝细胞气球样变评分≥1
小叶炎症评分≥1
nas(nafld活动评分)≥4
纤维化分期≥2(例如纤维化分期等于2、3或4，特别是2或3)
ntbt2：
与tbt的差异在于在任何的脂肪变性评分、肝细胞气球样变评分、小叶炎症评分、nas或纤维化分期中低至少一级；
或
c)tbt7：
脂肪变性评分≥1
肝细胞气球样变评分≥1
小叶炎症评分≥1
nas(nafld活动评分)≥4
纤维化分期＝1b、1c、2、3或4
ntbt7：
与tbt的差异在于在任何的脂肪变性评分、肝细胞气球样变评分、小叶炎症评分、nas或纤维化分期中低至少一级。
18.一种基于使用深度学习模型对来自于对象的肝活检组织进行图案识别和评分用于监测所述对象中nafld活动、nash活动或肝纤维化的演变的方法或用于评估在所述对象中nafld、nash纤维化或肝纤维化治疗的效率的方法。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述深度学习模型是在权利要求1至13所述的方法中执行的深度学习模型。
20.一种对nash或肝纤维化进行自动评分的方法，所述方法包括提供来自于所述对象的肝活检组织的载片，并进行下述步骤：
-全载片成像(wsi)的步骤，包括将所述全载片的图像数字化并储存；
-wsi预处理的步骤，包括自动发现伪影例如成像伪影(例如空气泡、灰尘或盖片碎片)和组织处理伪影(例如组织折叠或组织碎片)；
-从预处理过的wsi图像提取生物医学相关图像的步骤，包括提取代表微观图案(例如细胞，例如正常细胞和病理细胞，特别是气球样变肝细胞和/或炎性肝细胞)和宏观图案(例如包含或不包含纤维化的组织区域)的图像；
-nash和肝纤维化自动评分的步骤，其包括：
i)将所述提取的图像提供给深度学习模型，其中所述深度学习模型事先基于成套的微观图案和宏观图案训练数据进行过训练；
ii)将所述模型应用于单个微观和宏观图案图像以预测每个活检组织载玻片的：气球样变肝细胞的数目，炎性细胞的数目，nash纤维化图案，肝纤维化胶原比例面积和肝纤维化形态学指数(对于每个宏观图案来说)；
iii)将微观和宏观图案定量数据转化成气球样变评分、炎症评分、纤维化评分、肝胶原比例面积和形态学指数。
21.根据权利要求20所述的方法，其中提取生物医学相关图像的步骤如下进行：
-发现细胞核；
-发现胞质溶胶外延；
-提取单个细胞图像(微观图案)；和
-提取相邻细胞组织区(宏观图案)。
22.一种组织学图像预处理方法，所述方法包括：
-提供肝活检组织的图像；
-将组织学图像的染色针对所述染色剂特有的参比图像进行归一化，并且对微观图案表征和宏观图案表征进行图案注释；以及
-检测用于微观图案表征的细胞结构，特别地如下进行：
-第一步骤细胞核表征；和
-第二步骤胞质溶胶外延定位。
23.一种组织学图像图案注释方法，所述方法包括使用下述步骤进行肝细胞气球样变检测和评分：
-使用气球样变细胞图案识别和评分dl模型鉴定微观图案；和
-对肝细胞气球样变进行评级。
24.一种组织学图像图案注释方法，所述方法包括使用下述步骤进行小叶炎症检测和评分：
-选择代表性数量的fov；
-使用炎性细胞图案识别和评分dl模型鉴定微观图案；和
-对小叶炎症进行评级。
25.一种组织学图像图案注释方法，所述方法包括使用下述步骤进行脂肪变性检测和评分：
-视野的单个染色归一化；
-鉴定脂肪变性区域图案；和
-对脂肪变性进行评级。
26.一种组织学图像图案注释方法，所述方法包括使用下述步骤进行nash纤维化检测和评分：
-提取相邻组织区(宏观图案)；
-对纤维化进行分期；和
-检测和评分。
27.一种组织学图像图案注释方法，所述方法包括使用下述步骤进行肝纤维化检测和评分：
-提取相邻组织区(宏观图案)；
-确定所有fov上的平均分形指数、除了被预测为门区的fov之外的所有fov上的平均分形指数、或每类fov的平均分形指数；和
-检测和评分。
28.一种组织学图像图案注释方法，所述方法包括实施根据权利要求21至27所述的方法中的至少一者，特别是所有的方法。
29.一种组织学图像图案注释方法，所述方法包括实施根据权利要求23、24和27所述的方法中的至少一者，特别是所有方法。
30.根据权利要求29所述的方法，其还包括实施权利要求25所述的方法。
31.一种通过计算机实施的肝活检组织的组织学图像图案注释方法，所述方法包括：
-在肝活检组织的数字化图像中鉴定感兴趣的区域；
-任选地将染色归一化；
-鉴定细胞结构，特别是通过细胞核鉴定和胞质溶胶外延定位进行；和
-提取单个细胞图像(或者被称为“微观图案”)；和/或
-提取相邻组织区(或者被称为“宏观图案”)。
32.一种抗nafld、抗nash或抗纤维化化合物，其分别用于患有nafld、nash或肝纤维化的对象的治疗方法中，其中根据权利要求15至19中任一项将所述对象诊断或分类为由于nafld、nash或肝纤维化而待治疗的患者。
33.一种数据处理装置，其包含用于执行权利要求1至31中任一项所述的方法的机构。
34.一种计算机程序产品，其包含当所述程序被计算机执行时引起所述计算机执行权利要求1至31中任一项所述的方法的指令。
35.一种计算机可读存储介质，其包含当被计算机执行时引起所述计算机执行权利要求1至31中任一项所述的方法的指令。
技术总结