本发明涉及一种碱性磷酸酶的灵敏检测方法，属于生物分析技术领域。
背景技术：
碱性磷酸酶(alp)是一种广泛存在于生物组织中的膜结合酶，由于生物体内alp水平的异常往往与许多疾病密切相关，因此被广泛用作临床诊断的生物标志物。目前在明确催化机理的基础上，研究人员建立了多种检测碱性磷酸酶活性的方法，包括电化学法、荧光法、比色法和表面增强拉曼光谱法等。在上述方法中，光学方法，特别是荧光法，具有可靠、灵敏度高、使用方便、响应速度快、仪器要求低等优点，非常适合于高通量分析和实时检测。通常，碱性磷酸酶的荧光检测方法是通过比较酶底物和碱性磷酸酶触发的水解产物的荧光响应来实现的。例如，利用alp产物的荧光猝灭能力和cu2 对焦磷酸盐和磷酸盐的区分能力，设计了许多荧光传感器。但这样的模式存在低信号输出高的检测背景以及相对较低的灵敏度和选择性等不足。
相比之下，荧光开关法由于具有假信号少、选择性好、灵敏度高等优点而备受关注。抗坏血酸2-磷酸(aapi)是碱性磷酸酶(alp)活性测定中最常用的特异性底物之一，在alp存在下，aapi可以水解并转化为抗坏血酸(aa)。与aapi相比，酶产物aa表现出更强的还原能力，在碱性条件下更容易脱氢。利用碱性磷酸酶(alp)对aapi的催化水解作用和aa的还原能力，构建新兴的碱性磷酸酶荧光分析方法具有重要意义。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种简便、灵敏、快速的检测碱性磷酸酶活性的荧光方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是提供：一种碱性磷酸酶的灵敏检测方法，包括以下步骤：
(1)将aapi溶液分别和一系列活性浓度梯度的alp溶液混合，反应；
(2)在步骤(1)的反应液中分别加入des溶液，反应；
(3)对步骤(2)的反应液分别进行荧光测定，构建alp活性浓度和荧光强度的线性关系；
(4)利用线性关系，得到待检测alp溶液活性浓度。
aapi溶液的浓度为0.1m。
一系列活性浓度梯度的alp溶液的活性浓度为：5、10、20、30、40mu/ml。
alp溶液为alp的trisbuffer溶液，trisbuffer溶液的浓度为0.1m，含2mmmgcl2，0.2mmzncl2，ph＝8.0。
des溶液的浓度为15mm。
aapi溶液、alp溶液、des溶液的体积比为1：4：4。
步骤(1)中反应温度为37℃，时间为50min。
步骤(2)中反应温度为37℃，时间为30min。
荧光测定的条件为激发波长383nm，狭缝2nm。
本发明的有益效果：
1、设计一种基于抗坏血酸2-磷酸(aapi)的荧光开关法alp检测方法，具有假信号少、灵敏度高、选择性好、检测快速等优点。
2、4,4'-二叠氮二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠四水合物(des)作为荧光探针，具有成本低、检测简单、灵敏度高等优点。
3、利用alp对于磷酸基团的特异性，与aapi反应生成抗坏血酸aa，然后，aa与des反应产生较强荧光，从而实现对alp活性的测定。
4、实验证明，检测线性范围：5-40mu/ml，相关系数为0.998，检出限1.46mu/ml，具有较高选择性和抗干扰能力，为后期应用于临床检测奠定重要基础。
附图说明
图1为alp和aapi，alp和des，aapi和des，alp、aapi和des的荧光发射光谱。
图2为aa和des的荧光激发光谱和荧光发射光谱。
图3为不同alp活性浓度对荧光信号的影响(alp浓度分别为5mu/ml、10mu/ml、20mu/ml、30mu/ml、40mu/ml、50mu/ml、60mu/ml、80mu/ml、100mu/ml)。
图4为荧光强度与alp活性浓度(mu/ml)的关系(alp浓度分别为5mu/ml、10mu/ml、20mu/ml、30mu/ml、40mu/ml、50mu/ml、60mu/ml、80mu/ml、100mu/ml)。
图5为检测方法的选择性结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1：alp活性浓度的荧光检测步骤
将alp溶于0.1m的trisbuffer溶液(ph＝8.0，含2mmmgcl2，0.2mmzncl2)中，配制成一系列活性浓度梯度的alp溶液(5、10、20、30、40mu/ml)，不同活性浓度的alp溶液各取100μl，分别和25μlaapi溶液(0.1m，超纯水溶解)混合，在37℃下反应50min，随后，在上述反应液中分别加入100μldes溶液(15mm，超纯水溶解)，在37℃下继续反应30min，之后将各反应液分别用超纯水稀释到600μl后，使用荧光分光光度计，在激发波长383nm，狭缝2nm下进行荧光测定，构建alp活性浓度和荧光强度的线性关系。最后，将待检测alp溶液参照上述方法分别与aapi溶液和des溶液反应，并进行荧光测定，利用构建的线性关系，得到待检测alp溶液活性浓度。
实施例2：检测方法的可行性验证
配制四种混合溶液，分别为：
1、alp(100μl，100mu/ml)和aapi(25μl，0.1m)
2、alp(100μl，100mu/ml)和des(100μl，15mm)
3、aapi(25μl，0.1m)和des(100μl，15mm)
4、alp(100μl，100mu/ml)，aapi(25μl，0.1m)和des(100μl，15mm)
上述四种混合溶液在37℃下反应30min后，用超纯水稀释至600μl后用荧光分光光度计在激发波长383nm，狭缝2nm下进行荧光激发谱测定(见图1)。如图1所示，仅有第四种混合溶液出现较强荧光，而1、2、3并未检测出明显荧光吸收峰，证明实验可行。
实施例3：aa和des的荧光吸收谱和发射谱
aa溶液(25μl，0.01m)和des溶液(100μl，15mm)在37℃下反应30min后，用超纯水稀释至600μl后分别进行荧光激发谱和荧光发射谱扫描(见图2)。如图2所示，从aa和des的荧光吸收谱和发射谱上可以看出，aa和des的最大荧光吸收峰在383nm，aa和des的荧光最大发射峰在465nm。
实施例4：检测时间的优化
参照实施例1的方法，改变alp和aapi的反应液和des的混合液的反应时间(其它条件不变)，即分别检测alp和aapi的反应液和des的混合液在5min、10min、15min、20min、25min、30min的荧光强度，以优化检测时间。结果表明，30min时混合液的荧光强度基本不变，因此取30min作为最佳的检测时间。
实施例5：检测方法对alp的检测线性范围研究
按照实施例1的方法，分别检测一系列活性浓度(5、10、20、30、40、50、60、80、100mu/ml)alp溶液的荧光强度(见图3、4)。如图3、4所示，在5mu/ml到40mu/ml的范围内，荧光强度和碱性磷酸酶活性浓度存在良好的线性关系，线性方程为f＝4068calp-1320(r2＝0.998)，检测限为1.46mu/ml。
实施例6：检测方法的选择性研究
按照实施例1的方法，分别检测使用浓度为0.05mg/ml的葡萄糖氧化酶(gox)、多巴胺(da)、牛血清白蛋白(bsa)、胃蛋白酶(pepsin)代替alp，与des反应后的荧光信号强度(见图5)。如图5所示，干扰物荧光信号强度与空白几乎相当，说明本发明方法具有较好的选择性。
实施例7：回收率实验
分别配制溶于10％(v/v)稀释的人血清中活性浓度为5mu/ml、20mu/ml、40mu/ml的alp溶液，按照实施例1的方法进行检测，与标准浓度5mu/ml、20mu/ml、40mu/ml相比，回收率分别为105％，rsd值为6.3％；96％，rsd值5.6％；109％，rsd值4.9％。表明检测方法具有良好的准确性。
1.一种碱性磷酸酶的灵敏检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将aapi溶液分别和一系列活性浓度梯度的alp溶液混合，反应；
(2)在步骤(1)的反应液中分别加入des溶液，反应；
(3)对步骤(2)的反应液分别进行荧光测定，构建alp活性浓度和荧光强度的线性关系；
(4)利用线性关系，得到待检测alp溶液活性浓度。
2.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的灵敏检测方法，其特征在于，aapi溶液的浓度为0.1m。
3.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的灵敏检测方法，其特征在于，一系列活性浓度梯度的alp溶液的活性浓度为：5、10、20、30、40mu/ml。
4.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的灵敏检测方法，其特征在于，alp溶液为alp的trisbuffer溶液，trisbuffer溶液的浓度为0.1m，含2mmmgcl2，0.2mmzncl2，ph＝8.0。
5.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的灵敏检测方法，其特征在于，des溶液的浓度为15mm。
6.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的灵敏检测方法，其特征在于，aapi溶液、alp溶液、des溶液的体积比为1：4：4。
7.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的灵敏检测方法，其特征在于，步骤(1)中反应温度为37℃，时间为50min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的碱性磷酸酶的灵敏检测方法，其特征在于，步骤(2)中反应温度为37℃，时间为30min。
9.根据权利要求8所述的碱性磷酸酶的灵敏检测方法，其特征在于，荧光测定的条件为激发波长383nm，狭缝2nm。
技术总结