本发明涉及一种有机相中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶抑制速测卡及其使用方法，属于实验室分析用具领域。
背景技术：
酶抑制法是一种发展较为成熟的农药残留快速检测方法，主要利用农药对酯酶活性的抑制作用，特异性地检测有机磷和氨基甲酸酯类农药。近年来，酶抑制法通过与不同的检测方法相联用，已开发出多种检测设备。其中，酶抑制速测卡利用纸质材料廉价易得、生物兼容性强等特性，展现出检测时间短、成本低等优势，在我国农药残留速测领域应用广泛。检测时，若样品中不含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留，酶活性未受抑制，可以正常水解底物生成一定量的产物，在纸质载体表面呈现一定的颜色、荧光等信号变化；而被测样品中含有该类农药时，农药成分对酶活性造成一定程度的破坏，使其无法正常催化水解底物，水解产物的生成量减少，相应的信号变化减少。利用这一原理，酶抑制速测卡可快速、有效地对大量样品进行可视化筛查。
目前，常规酶抑制速测卡主要由两部分组成，分别为酶区和底物区。在检测时，首先在酶区滴加试样进行酶抑制反应；待反应充分后，通过对折试纸条使得酶区和底物区充分接触，从而展开酶显色反应；最后，对比空白及样品的显色结果，判定样品中农药残留水平。由于大部分有机溶剂对酶活性具有抑制作用，常规酶抑制速测卡为了避免有机相溶液对固定化酶造成额外的干扰，在样品前处理过程中通常只能采用磷酸盐缓冲液等水相溶液作为提取溶剂。然而，大部分有机磷和氨基甲酸酯类农药水溶性较差，易溶于有机溶剂。因此，以水相主导的前处理过程难以提供高效的提取效率，在一定程度上影响了检测结果的准确性和可靠性，极大地限制了常规酶抑制速测卡的实用性。
因此，有必要针对以上问题，打破传统速测卡的构型模式，设计一款可与有机溶剂样品前处理相兼容的新型酶抑制速测卡，从而提升酶抑制速测卡检测性能。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种与有机相样品前处理相兼容的酶抑制速测卡，该检测卡能够兼容有机相溶剂的同时，避免有机溶剂对固定化酶活力造成额外的干扰，提高检测灵敏度、保障检测结果准确性。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种用于检测有机相中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶抑制速测卡，所述酶抑制速测卡由进样卡片、酶区卡片、底物卡片组成，所述进样卡片上设置进样区和环绕完全包围所述进样区的超惰性边缘，所述酶区卡片上设置酶区和环绕完全包围所述酶区的疏水边缘；所述底物卡片上设置底物区和环绕完全包围所述底物区的疏水边缘；
所述进样区、酶区、底物区均以试纸作为基底材料，其中酶区在试纸基底上固定有酶试剂，底物区在试纸基底上固定有显色底物；所述酶试剂一般为胆碱酯酶；所述显色底物一般为靛酚乙酸酯或吲哚乙酸酯。
疏水边缘可通过表面活性剂处理或透明塑料薄膜等材料形成疏水边缘，超惰性边缘可由特殊材料处理获得；
所述进样卡片上，环绕完全包围进样区的超惰性边缘，所述的超惰性是指疏水疏酯，由于卡片进样均为有机相溶液，因此进样区的边缘界限必须既不亲水，又无法被有机溶剂浸润，即为疏水疏酯，一般是用氟化材料来做边缘界限，氟化材料不亲水也不亲脂，可以较好的作为有机样品的进样范围界限。氟化材料可用常用的如特氟龙等。
所述进样卡片、酶区卡片、底物卡片三者可以相连也可以互不相连也可以任意两者相连，所述进样卡片、酶区卡片、底物卡片三者互不相连时，即为三张独立卡片。可相互对齐重叠贴合使用。
优选所述进样卡片、酶区卡片、底物卡片三张卡片连在一起成为整体，便于使用。
进一步，所述进样卡片、酶区卡片、底物卡片连在一起的方式可以有多种，连成整体后，需要满足进样区和酶区、酶区和底物区可通过折叠、对齐等方式能够完全重叠在一起，进行全面、有效的贴合接触；优选将酶区卡片置于进样卡片和底物卡片的中间。
更进一步，优选进样卡片、酶区卡片、底物卡片按顺序线性排列连接成长条形状。
或者将进样卡片、酶区卡片、底物卡片连接成l型，优选将酶区卡片置于l的拐角处，进样卡片和底物卡片分别位于l的两条相邻边。
所述进样卡片、酶区卡片、底物卡片相互连接时，卡片之间的连接线可设置为可折叠线，可通过折叠线折叠后重叠起来贴合接触。
所述酶区和底物区可通过将酶溶液、底物溶液分别固定于垫片上，再与试纸基底相连，也可直接通过在试纸基底上分隔出相应区域进行固定酶溶液和底物溶液。酶试剂、显色底物的固定方式都是本领域公知的。
所述进样区、酶区和底物区的构型、面积无特定要求，可以根据实验需要进行更改。
优选进样区、酶区和底物区的形状为圆型，更进一步，优选酶区的面积小于或等于进样区，酶区的面积小于或等于底物区，以保证酶区和进样区重叠贴合接触时，进样区能完全覆盖酶区；酶区和底物区重叠贴合时，底物区能完全覆盖酶区。
所述进样区可以根据实验需要加设样品过滤功能，通过通道将进样区与样品过滤区域相连，利用微流控纸芯片等技术实现固体杂质在线过滤功能。
本发明装置可以根据保存需求，在制备完成的速测卡表面覆盖塑料薄膜，使用时除去薄膜即可。
本发明还提供所述用于检测有机相中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶抑制速测卡的使用方法，所述方法包括以下步骤：
(1)在进样区滴加待测样品的有机相提取液，放置于室温下，待有机溶剂完全挥发后，一般观察进样区完全干燥即可，大概需要3-10分钟；
(2)在酶区滴加磷酸缓冲液，使酶区保持湿润；通过折叠或对齐方式将进样卡片和酶区卡片重叠贴合，使进样区与酶区完全贴合接触以促发酶抑制反应，在37℃下孵育10min；
(3)孵育完全后，将进样卡片和酶区卡片分离，解除进样区与酶区的接触，通过折叠或对齐等方式将酶区卡片和底物卡片重叠贴合，使酶区与底物区完全贴合接触以促发酶显色反应，在37℃下反应3min，然后将酶区卡片和底物卡片分离，观察酶区得到样品显色图；可根据实验需求，在底物区滴加适量磷酸缓冲液以保持显色反应处于湿润状态；
(4)以磷酸缓冲液作为对照溶液，按照步骤(1)、(2)、(3)同样步骤，与样品进行同时检测，观察酶区得到对照检测图；
(5)将样品显色图与对照检测图进行对比，对样品中农药残留水平进行定性分析：样品显色明显淡于对照显色，判定检测结果为阳性，表明样品中含有有机磷和氨基甲酸酯类农药残留；样品显色相对对照颜色无变化，判定检测结果为阴性，表明样品中不含有有机磷和氨基甲酸酯类农药残留。显色结果也可通过照相机、扫描仪等设备收集图像，并利用图像等软件处理数据，从而对样品中农残水平进行定量分析。
所述磷酸缓冲液一般为100mm,ph＝8.0的磷酸缓冲液。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的用于检测有机相中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶抑制速测卡，打破常规酶抑制速测卡构型模式，新增进样区卡片，这是以往常规酶抑制速测卡构型中没有的。现有技术中，常规酶抑制速测卡只含有酶区和底物区，样品直接加入酶区，导致样品无法用有机溶剂提取，用水相提取则提取效率差，无法保证完全提取；而如果用有机相提取样品，直接加入酶区检测，又会导致检测结果不准确，出现假阳性结果。
本发明创造性的增加进样卡片，利用纸质材料超大的比表面积，上样后可加速进样区有机溶剂的在线挥发，待有机溶剂挥干后，通过折叠、贴合等方式，依次展开酶抑制、显色反应，满足样品有机相前处理与酶抑制法相结合、有机溶剂与固定化酶零接触的双重需求，从而提高酶抑制速测卡检测灵敏度与准确性。
本发明设计合理，分区明确，结构灵活、简单，制作难度低、成本低廉，适合大规模量产；使用方便，操作简便，检测时间短、成本低，易于推广和使用，可适用于食品流通过程中大批量样品的高灵敏度、快速、准确筛查。
附图说明
图1是本发明的酶抑制速测卡的长条形结构示意图，图1中a为结构示意图，b图为实物图。
图2是本发明的酶抑制速测卡的l型结构示意图，图2中a和b为两种连接方式。
图3是本发明的酶抑制速测卡的独立卡片式结构示意图。
图4是本发明的酶抑制速测卡的使用流程图。
图5是常规酶抑制速测卡(a、c、e)和本发明(b、d、f)对水相溶液和有机相溶液的检测效果图。
具体实施方式
下面以具体实施例并结合图1、图2、图3来对本发明的酶抑制速测作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
如图1、2所示，本发明的酶抑制速测卡由进样卡片1、酶区卡片2、底物卡片3组成，所述进样卡片1上设置亲水的进样区1-1和环绕完全包围进样区1-1的超惰性边缘1-2，所述酶区卡片2上设置酶区2-1和环绕完全包围酶区2-1的疏水边缘2-2；所述底物卡片3上设置底物区3-1和环绕完全包围底物区3-1的疏水边缘3-2。
所述进样区1-1、酶区2-1、底物区3-1均以试纸作为基底材料，其中酶区2-1在试纸基底上固定酶试剂，底物区3-1在试纸基底上固定底物；所述酶试剂一般为胆碱酯酶；所述底物一般为靛酚乙酸酯或吲哚乙酸酯。
疏水边缘可通过表面活性剂处理或透明塑料薄膜形成；超惰性边缘采用疏水疏酯材料形成，可采用氟化材料如特氟龙。
所述进样卡片1、酶区卡片2、底物卡片3三者可以相连也可以互不相连也可以任意两者相连，所述进样卡片1、酶区卡片2、底物卡片3三者互不相连时，即为三张独立卡片，如图3所示。
优选所述进样卡片1、酶区卡片2、底物卡片3三张卡片连在一起成为整体，便于使用。
进一步，所述进样卡片1、酶区卡片2、底物卡片3连在一起的方式可以有多种，需要满足进样区1-1和酶区2-1、酶区2-1和底物区3-1可通过折叠、对齐等方式能够完全对齐重叠，进行全面、有效的贴合接触；优选将酶区卡片2置于进样卡片1和底物卡片3的中间。
更进一步，优选进样卡片1、酶区卡片2、底物卡片3按顺序排列连接成长条形状。图1即为为酶抑制速测卡的长条形结构示意图，
或者将进样卡片1、酶区卡片2、底物卡片3连接成l型，优选将酶区卡片3置于l的拐角处，进样卡片1和底物卡片2分别位于l的两条相邻边。图2中的a和b为l型的两种连接方式。
所述进样卡片、酶区卡片、底物卡片相互连接时，连接线可设置为可折叠线，可通过折叠线折叠后重叠起来贴合接触。
所述酶区和底物区可通过将酶溶液、底物溶液分别固定于垫片上，再与试纸基底相连，也可直接通过在试纸基底上分隔出相应区域进行固定酶溶液和底物溶液。酶溶液、底物溶液的固定方式都是本领域技术人员公知的。
优选进样区1-1、酶区2-1和底物区3-1的形状为圆型，更进一步，优选酶区2-1的面积小于或等于进样区1-1，酶区的面积2-1小于或等于底物区3-1，以保证酶区2-1和进样区1-1贴合接触时，进样区1-1能完全覆盖酶区2-1；酶区2-1和底物区3-1贴合时，底物区3-1能完全覆盖酶区2-1。
所述进样区可以根据实验需要加设样品过滤功能，通过通道将进样区与样品过滤区域相连，利用微流控纸芯片等技术实现固体杂质在线过滤功能。
采用本发明的酶抑制速测卡，可检测有机相溶液中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留，具体操作如下：
(1)参照图4(a)，在进样区滴加待测样品的有机相提取液，放置于室温下，待有机溶剂完全挥发后，一般观察进样区完全干燥即可，大概需要3-10分钟；
(2)参照图4(b)，在酶区滴加100mm,ph＝8.0的磷酸缓冲液，使酶区保持湿润；通过折叠或对齐方式将进样卡片和酶区卡片重叠贴合，使进样区与酶区完全贴合接触以促发酶抑制反应，在37℃下孵育10min；
(3)参照图4(c)，孵育完全后，将进样卡片和酶区卡片分离，解除进样区与酶区的接触，通过折叠或对齐等方式将酶区卡片和底物卡片重叠贴合，使酶区与底物区完全贴合接触以促发酶显色反应，在37℃下反应3min，然后将酶区卡片和底物卡片分离，观察酶区得到样品显色图；可根据实验需求，在底物区滴加适量磷酸缓冲液以保持显色反应处于湿润状态；
(4)以100mm,ph＝8.0的磷酸缓冲液作为对照溶液，按照步骤(1)、(2)、(3)同样步骤，与样品进行同时检测，观察酶区得到对照检测图；
(5)将样品显色图与对照检测图进行对比，对样品中农药残留水平进行定性分析：样品显色明显淡于对照显色，判定检测结果为阳性，表明样品中含有有机磷和氨基甲酸酯类农药残留；样品显色相对对照颜色无变化，判定检测结果为阴性，表明样品中不含有有机磷和氨基甲酸酯类农药残留。显色结果也可通过照相机、扫描仪等设备收集图像，并利用图像等软件处理数据，从而对样品中农残水平进行定量分析。
将常规酶抑制速测卡和本发明酶抑制速测卡进行对比测试，测试方法如下：
常规酶抑制速测卡只含有酶区和底物区，测试方法如下：
分别在3张常规酶抑制速测卡的酶区滴加40μl磷酸缓冲液(100mm，ph：8.0)，甲醇、甲醇中含0.05mg/l克百威的溶液，在37℃下孵育10min，然后通过折叠的方式将酶区和底物区完全重叠贴合接触，进行酶显色反应，在37℃下反应3min，将酶区和底物区分离，观察酶区颜色，显色反应后的结果分别如图5的a、c、e所示，a图为磷酸缓冲液，即为对照品，为阴性，与a图相比，c、e均颜色变淡，检测结果显示为阳性，表明常规酶抑制速测卡易受有机溶剂的干扰，无法有效辨别有机相溶液中农药浓度水平，在检测过程中易产生假阳性结果，难以保障检测结果的准确性。
新型酶抑制速测卡的检测方法如下：
分别在3张新型酶抑制速测卡的进样区滴加40μl磷酸缓冲液(100mm，ph：8.0)，甲醇、甲醇中含0.05mg/l克百威的溶液，放置于室温下，待水分和有机溶剂完全挥发后，在酶区滴加40μl磷酸缓冲液(100mm,ph:8.0)，使酶区保持湿润；通过折叠方式将进样区与酶区完全贴合接触以促发酶抑制反应，在37℃下孵育10min，孵育完全后，解除进样区与酶区的接触，通过折叠方式将酶区与底物区完全重叠贴合接触以促发酶显色反应，在37℃下反应3min，将酶区和底物区分离，观察酶区颜色，显色反应后的结果分别如图5的b、d、f所示，与b图对照品相比，d图无变化，也为阴性，而f图明显颜色变淡，结果表明，速测卡对不含农药的水相溶液和有机相溶液的检测结果均呈阴性，而对甲醇中0.05mg/l克百威的检测结果呈阳性，表明本发明速测卡不受检测溶液性质的限制，在兼容有机相待测液的同时可有效筛查溶液中农药残留情况，为酶抑制速测卡检测灵敏度及检测结果准确性的提升提供了良好的途径。
1.一种用于检测有机相中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶抑制速测卡，所述酶抑制速测卡由进样卡片、酶区卡片、底物卡片组成，所述进样卡片上设置进样区和环绕完全包围所述进样区的超惰性边缘，所述酶区卡片上设置酶区和环绕完全包围所述酶区的疏水边缘；所述底物卡片上设置底物区和环绕完全包围所述底物区的疏水边缘。
2.如权利要求1所述的酶抑制速测卡，其特征在于所述进样区、酶区、底物区均以试纸作为基底材料，其中酶区在试纸基底上固定酶试剂，底物区在试纸基底上固定显色底物。
3.如权利要求1所述的酶抑制速测卡，其特征在于所述进样卡片、酶区卡片、底物卡片三者相连或互不相连或任意两者相连。
4.如权利要求3所述的酶抑制速测卡，其特征在于所述进样卡片、酶区卡片、底物卡片连在一起成为整体；成为整体时，所述卡片上的进样区和酶区、以及酶区和底物区可通过折叠、对齐方式能够完全重叠在一起。
5.如权利要求4所述的酶抑制速测卡，其特征在于所述进样卡片、酶区卡片、底物卡片按顺序线性排列连接成长条形状。
6.如权利要求4所述的酶抑制速测卡，其特征在于所述连接成l型，酶区卡片位于l的拐角处，进样卡片和底物卡片分别位于l的两条相邻边。
7.如权利要求4所述的酶抑制速测卡，其特征在于所述进样卡片、酶区卡片、底物卡片相互连接时，卡片之间的连接线设置为可折叠线。
8.如权利要求1所述的酶抑制速测卡，其特征在于所述进样区、酶区和底物区的形状为圆型；所述酶区的面积小于或等于进样区，酶区的面积小于或等于底物区。
9.如权利要求1～9之一所述的酶抑制速测卡在检测有机相中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：
(1)在进样区滴加待测样品的有机相提取液，放置于室温下，待有机溶剂完全挥发；
(2)有机溶剂完全挥发后，在酶区滴加磷酸缓冲液，使酶区保持湿润；通过折叠或对齐方式将进样卡片和酶区卡片重叠贴合，使进样区与酶区完全贴合接触以促发酶抑制反应，在37℃下孵育10min；
(3)孵育完全后，将进样卡片和酶区卡片分离，解除进样区与酶区的接触，通过折叠或对齐等方式将酶区卡片和底物卡片重叠贴合，使酶区与底物区完全贴合接触以促发酶显色反应，在37℃下反应3min，然后将酶区卡片和底物卡片分离，观察酶区得到样品显色图；
(4)以磷酸缓冲液作为对照溶液，按照步骤(1)、(2)、(3)同样步骤，与样品进行同时检测，观察酶区得到对照检测图；
(5)将样品显色图与对照检测图进行对比，对样品中农药残留水平进行定性分析：样品显色明显淡于对照显色，判定检测结果为阳性，表明样品中含有有机磷和氨基甲酸酯类农药残留；样品显色相对对照颜色无变化，判定检测结果为阴性，表明样品中不含有有机磷和氨基甲酸酯类农药残留；显色结果也可通过照相机、扫描仪等设备收集图像，并利用图像等软件处理数据，对样品中农残水平进行定量分析。
技术总结