本发明涉及试剂检测领域，具体涉及一种检测钙离子浓度的试剂。
背景技术：
钙是人体必需的元素之一，也是人体内含量最多的元素之一，与各种生理活动密切相关。血钙的异常(增高或者降低)与多种疾病相关，如高钙血症、甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退、多发性骨髓瘤、骨恶性肿瘤、胰腺炎等有关。因此，血钙的测定具有重要的意义。
目前血钙的常用测定方法有络合滴定法、原子吸收法，这些方法都需要相关的仪器设备和接受过专门训练的检测人员，操作复杂，检测速度慢，且这些专业仪器设备不便于携带，检测成本昂贵。
与上述检测方法相比，比色法较为易行，目前在临床中应用更为广泛。其中，以邻甲酚酞络合酮比色法灵敏度最高。邻甲酚酞络合酮是金属络合染料，原作为金属指示剂滴定钙，后有人作为显色剂用于光度法测定生物样品中的钙。
但是邻甲酚酞络合酮比色法固有的缺点是检测响应度低，特别是在检测对象中钙离子浓度较低时，检测的吸光度相应值不灵敏，且难以达到线性标准；试剂应用于试纸时，对不同浓度钙离子的显色效果差异更不明显，这些问题均限制了邻甲酚酞络合酮在检测血液中钙离子方面的应用。另外，由于血液中的钙离子与镁等离子均可以与邻甲酚酞络合酮反应形成紫色络合物，因此血液中钙以外其他离子对显色产物的干扰为检测准确性带来一定影响。通常检测试剂中会加入掩蔽剂最大程度的减少其他离子对钙离子检测的影响。例如，常用8-羟基喹啉等掩蔽剂对血液中的镁离子进行掩蔽，但是不同掩蔽剂对镁离子的掩蔽效果可能存在一定差异，各类掩蔽剂对于血钙测定的掩蔽效果目前仍有待研究。因此，目前临床仍急需一种灵敏度好、准确度高的血液钙离子检测试剂。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种使用方便、检测快速准确、灵敏度高的用于血液钙离子检测的试剂组合物、试纸和试剂盒。
本发明的第一方面是提供一种用于血液钙离子浓度检测的试剂组合物，所述试剂组合物包含第一检测液和第二检测液，所述第一检测液包含多聚甲醛和第一缓冲液，所述第二检测液包含邻甲酚酞络合酮、第二缓冲剂、表面活性剂、掩蔽剂和二乙胺。
优选的，所述第一缓冲液包括甲酸、氯化钠、碳酸钠和硫酸钠。
优选的，所述第一缓冲液包括1-3ml/l甲酸、10-20g/l氯化钠、1-10g/l碳酸钠和20-40g/l硫酸钠。
优选的，所述第一缓冲液由含1.2ml/l甲酸、14.5g/l氯化钠、6g/l碳酸钠和31.3g/l硫酸钠的水溶液组成。
优选的，所述第一检测液中包含5-15g/l多聚甲醛。
更优选的，所述第一检测液中包含10g/l多聚甲醛。
优选的，所述邻甲酚酞络合酮在第二检测液中的含量为5-20g/l；更优选的，所述邻甲酚酞络合酮的含量为10g/l。
优选的，所述第二缓冲剂选自n-环己基-3-氨基丙磺酸、n-环己基-2-氨基乙磺酸或其组合。
更优选的，所述第二缓冲剂为n-环己基-2-氨基乙磺酸。
优选的，所述第二缓冲剂在第二检测液中的含量为1-10g/l；更优选的，所述第二缓冲剂为6g/ln-环己基-2-氨基乙磺酸。
优选的，所述掩蔽剂选自8-羟基喹啉、8-羟基喹啉-5-磺酸、n-苯甲酰-n-苯基羟胺或其组合。
更优选的，所述掩蔽剂为n-苯甲酰-n-苯基羟胺。
优选的，所述掩蔽剂在第二检测液中的含量为1-10g/l；更优选的，所述掩蔽剂为2g/ln-苯甲酰-n-苯基羟胺。
优选的，所述表面活性剂选自聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧乙烯月桂酸醚、对叔辛基酚聚氧乙烯醚、吐温20或其组合。
更优选的，所述表面活性剂选自聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧乙烯月桂酸醚和吐温20的组合。
优选的，所述表面活性剂在第二检测液中的含量为0.05-0.2g/l；更优选的，所述表面活性剂为90mg/l聚乙烯吡咯烷酮、20mg/l聚环氧乙烯月桂酸醚和1ml/l吐温20。
优选的，所述二乙胺在第二检测液中的含量为20-50ml/l；更优选的，所述二乙胺的含量为30-40ml/l。
更优选的，所述第二检测液由含10g/l邻甲酚酞络合酮、6g/ln-环己基-2-氨基乙磺酸、2g/ln-苯甲酰-n-苯基羟胺、90mg/l聚乙烯吡咯烷酮、20mg/l聚环氧乙烯月桂酸醚、1ml/l吐温20和37.5ml/l二乙胺的水溶液组成。
本发明的第二方面是提供一种用于血液钙离子浓度检测的试纸，所述试纸由基板、滤纸片和上述第二检测液制备而成，所述滤纸片位于所述基板上，所述滤纸片浸渍第二检测液5-30分钟，真空干燥10-30分钟即得。
优选的，所述滤纸片浸渍第二检测液10分钟，50℃真空干燥20分钟即得。
本发明的第三方面是提供一种用于血液钙离子浓度检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述第一检测液、上述试纸、比色卡和使用说明书。
优选的，所述比色卡的制备方法为：分别配制0mmol/l、2.5mmol/l、5.0mmol/l、7.5mmol/l、10mmol/l的钙离子标准溶液；将上述试纸分别浸于上述五种钙离子标准溶液中，1分钟后取出，静置1分钟至显色完全，即得。
优选的，所述比色卡呈现浅红到深红色的5个色阶。
本发明的第四方面是提供上述试剂组合物、上述试纸或上述试剂盒在检测血液钙离子浓度中的应用。
优选的，所述应用是非治疗目的的。
优选的，所述检测血液钙离子浓度的检测范围为0-10mmol/l。
优选的，所述试剂组合物检测血液钙离子浓度中的应用中，先将待测血液加入第一检测液中，充分混匀静置后，再加入第二检测液进行显色反应。
优选的，所述试剂盒检测血液钙离子浓度中的应用中，先将待测血液加入第一检测液中，充分混匀静置后，再将固定有第二检测液的试纸浸入处理后的待测血液中进行显色反应。
本发明具有积极有益的效果：
本发明的发明人意外发现，选用n-环己基-3-氨基丙磺酸溶液、n-环己基-2-氨基乙磺酸溶液等特定缓冲液可以显著提高检测试剂对血液钙离子的检测灵敏度。另外，选用8-羟基喹啉-5-磺酸、n-苯甲酰-n-苯基羟胺代替8-羟基喹啉可以更加有效的掩蔽待测血液中镁离子对检测结果的影响，提高检测的准确性。基于上述优点，本发明的试剂组合物、试纸及试剂盒成本低廉，操作简单，检测结果快速准确、灵敏度高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1本发明试剂组合物1的配制
(1)配制第一缓冲液：取处方量的甲酸、氯化钠、碳酸钠和硫酸钠，加入适量蒸馏水，配制成含有1.2ml/l甲酸、14.5g/l氯化钠、6g/l碳酸钠和31.3g/l硫酸钠的第一缓冲液；
(2)配制第一检测液：在步骤(1)的第一缓冲液中加入适量多聚甲醛，得到含10g/l多聚甲醛的第一检测液；
(3)配制第二检测液：取处方量的邻甲酚酞络合酮、n-环己基-2-氨基乙磺酸、n-苯甲酰-n-苯基羟胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧乙烯月桂酸醚、吐温20、二乙胺，加入适量蒸馏水，配制成含10g/l邻甲酚酞络合酮、6g/ln-环己基-2-氨基乙磺酸、2g/ln-苯甲酰-n-苯基羟胺、90mg/l聚乙烯吡咯烷酮、20mg/l聚环氧乙烯月桂酸醚、1ml/l吐温20、37.5ml/l二乙胺的第二检测液；
(4)配制试剂组合物：将步骤(2)和(3)中配制好的第一检测液和第二检测液分别装入不同包装容器中储存，即得。
实施例2本发明试剂组合物2的配制
将实施例1中的第二缓冲剂由n-环己基-2-氨基乙磺酸替换成等摩尔的n-环己基-3-氨基丙磺酸，其余组分和制备工艺与实施例1相同，即得本发明的试剂组合物2。
实施例3本发明试剂组合物3的配制
将实施例1中的掩蔽剂由n-苯甲酰-n-苯基羟胺替换成等摩尔的8-羟基喹啉-5-磺酸，其余组分和制备工艺与实施例1相同，即得本发明的试剂组合物3。
实施例4本发明试剂组合物4的配制
将实施例2中的掩蔽剂由n-苯甲酰-n-苯基羟胺替换成等摩尔的8-羟基喹啉-5-磺酸，其余组分和制备工艺与实施例2相同，即得本发明的试剂组合物4。
实施例5-8本发明试纸1-4的制备
将滤纸片浸入实施例1配制第二检测液中，10分钟后取出，置于50℃真空干燥箱中干燥20分钟。将干燥后的滤纸片固定在基板上，即制成本发明的试纸1。
参照上述方法，将滤纸片分别浸入实施例2-4配制第二检测液中，其余步骤相同，即制成本发明的试纸2-4。
实施例9-12本发明试剂盒1-4的制备
(1)比色卡的制备
分别配制0mmol/l、2.5mmol/l、5.0mmol/l、7.5mmol/l、10mmol/l的钙离子标准溶液；将实施例5制备得到的试纸分别浸于上述五种钙离子标准溶液中，1分钟后取出，静置1分钟至显色完全，即得用于检测血液钙离子浓度的比色卡，比色卡呈现浅红到深红色5个色阶。
(2)试剂盒的制备
取实施例1配制的第一检测液180μl，装入容器中，将装有第一检测液的容器、实施例5制备的试纸条1、上述比色卡和使用说明书一同装入包装内，即得本发明的试剂盒1。
参照上述方法，取实施例6-8制备得到的试纸2-4装入包装内，其余步骤相同，即得本发明的试剂盒2-4。
实施例13本发明试剂盒的使用方法
(1)血液样品前处理
取实施例9制备得到的试剂盒1，将待测血浆20μl加入装有1第一检测液的容器中，充分震荡混匀，静置5分钟。
(2)血液样品钙离子浓度检测
取试剂盒1中的试纸1浸入处理后的待测样品，1分钟后取出，静置1分钟至显色完全。将显色后的试纸1与比色卡的颜色进行比较，确定试纸1中显示颜色对应的钙离子浓度范围，最终估算出待测血液中的钙离子浓度。
试验例1本发明试剂组合物中第二缓冲剂筛选试验
1、测试样品制备
钙离子溶液的制备：首先制备10mmol/l的氯化钙水溶液，再依次用蒸馏水稀释，分别制备2、4、6和8mmol/l的氯化钙溶液，备用。
对照品1的制备：在上述5个浓度的钙离子溶液中依次加入处方量的邻甲酚酞络合酮、缓冲剂2-氨基-2-甲基-1-丙醇，使各对照品溶液中邻甲酚酞络合酮含量为15mmol/l，2-氨基-2-甲基-1-丙醇含量为30mmol/l，加入适量乙二胺，调节ph值至11，备用。
试验品1-2的制备：分别将缓冲剂2-氨基-2-甲基-1-丙醇替换成等摩尔的n-环己基-3-氨基丙磺酸(试验品1)和n-环己基-2-氨基乙磺酸(试验品2)，其余制备步骤与对照品1相同。
2、试验方法
用1cm比色皿，以蒸馏水作为空白试剂进行调零，将上述不同钙离子浓度的对照品1、试验品1和试验品2分别于540nm波长处测试钙离子的吸光度，每个样品测定3次，以3次测定的平均值作为该样品的最终吸光度值。
3、试验结果
本发明不同第二缓冲剂对各浓度钙离子的吸光度结果如下表1所示。
表1不同第二缓冲剂对各浓度钙离子的吸光度
表1试验结果显示，与作为对比品的2-氨基-2-甲基-1-丙醇相比，本发明使用的n-环己基-3-氨基丙磺酸缓冲剂和n-环己基-2-氨基乙磺酸缓冲剂对钙离子具有更大的吸光度值，表明本发明选择的上述缓冲剂对于血液中钙离子检测的响应灵敏度更高。
试验例2本发明试剂组合物中掩蔽剂筛选试验
1、测试样品制备
钙、镁离子溶液的制备：分别取氯化钙溶液和氯化镁溶液，按照一定比例混合依次配制成镁离子浓度均为10mmol/l，钙离子浓度分别为2、4、6、8和10mmol/l的钙、镁离子溶液，备用。
对照品2的制备：在上述5个浓度的钙、镁离子溶液中依次加入处方量的邻甲酚酞络合酮、缓冲剂n-环己基-2-氨基乙磺酸和掩蔽剂8-羟基喹啉，使各对照品溶液中邻甲酚酞络合酮含量为15mmol/l，n-环己基-2-氨基乙磺酸含量为30mmol/l，8-羟基喹啉的含量为10mmol/l，加入适量乙二胺，调节ph值至11，备用。
试验品3-4的制备：分别将掩蔽剂8-羟基喹啉替换成等摩尔的8-羟基喹啉-5-磺酸(试验品3)和n-苯甲酰-n-苯基羟胺(试验品4)，其余制备步骤与对照品2相同。
2、试验方法
用1cm比色皿，以蒸馏水作为空白试剂进行调零，将上述不同钙离子浓度的对照品2、试验品3和试验品4分别于540nm波长处测试钙离子的吸光度，每个样品测定3次，以3次测定的平均值作为该样品的最终吸光度值。
3、试验结果
本发明不同掩蔽剂对各浓度钙离子的吸光度影响如下表2所示。
表2不同掩蔽剂对各浓度钙离子的吸光度
表2试验结果显示，使用8-羟基喹啉作为掩蔽剂时，不同浓度钙离子样品检测的吸光度值均比不含镁离子和8-羟基喹啉掩蔽剂的样品(即表1中试验品2)显著升高，表明检测样品中仍存留未掩蔽的镁离子，即8-羟基喹啉未能完全掩蔽镁离子。与之相比，8-羟基喹啉-5-磺酸和n-苯甲酰-n-苯基羟胺作为掩蔽剂的样品的吸光度值较不含镁离子和8-羟基喹啉掩蔽剂的样品无显著性差异，因此两者掩蔽镁离子的效果优于对比品的8-羟基喹啉。上述试验证实本发明选择的掩蔽剂可完全掩蔽镁离子，确保血液中钙离子含量的准确测定。
1.一种用于血液钙离子浓度检测的试剂组合物，所述试剂组合物包含第一检测液和第二检测液，所述第一检测液包含多聚甲醛和第一缓冲液，所述第二检测液包含邻甲酚酞络合酮、第二缓冲剂、表面活性剂、掩蔽剂和二乙胺。
2.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述第一缓冲液包括甲酸、氯化钠、碳酸钠和硫酸钠。
3.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述第一缓冲液包括1-3ml/l甲酸、10-20g/l氯化钠、1-10g/l碳酸钠和20-40g/l硫酸钠。
4.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述第一检测液中包含5-15g/l的多聚甲醛。
5.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述第二缓冲剂选自n-环己基-3-氨基丙磺酸、n-环己基-2-氨基乙磺酸或其组合。
6.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述掩蔽剂选自8-羟基喹啉、8-羟基喹啉-5-磺酸、n-苯甲酰-n-苯基羟胺或其组合。
7.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述表面活性剂选自聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧乙烯月桂酸醚、对叔辛基酚聚氧乙烯醚、吐温20或其组合。
8.一种用于血液钙离子浓度检测的试纸，其特征在于，所述试纸由基板、滤纸片和权利要求1-7任一项所述的第二检测液制备而成，所述滤纸片位于所述基板上，所述滤纸片浸渍所述第二检测液5-30分钟，真空干燥10-30分钟即得。
9.一种用于血液钙离子浓度检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-7任一项所述的第一检测液、权利要求8所述的试纸、比色卡和使用说明书。
10.权利要求1-7任一项所述的试剂组合物、权利要求8所述的检测试纸或权利要求9所述的检测试剂盒在检测血液钙离子浓度中的应用。
技术总结