本发明属于药理学研究及药物筛选研究领域，具体涉及内皮素受体的两种不同亚型，即内皮素受体a型(eta)和内皮素受体b型(etb)的在内源性细胞上的模型建立，本发明还涉及eta和etb两种受体的配体筛选方法和分析。
背景技术：
内皮素受体属于g蛋白偶联受体中的视紫红质a类家族，根据其氨基酸序列不同，可分为两个亚型，内皮素受体a型(eta受体)和内皮素受体b型(etb受体)，这两个受体的分布和功能都不尽相同。其中，eta受体主要分布于肺动脉、肾动脉、冠状动脉、心脏等，etb受体主要分布于肾脏、大脑、肝脏等。eta受体主要通过与内源性配体内皮素-1作用，引起血管收缩，从而维持基础血压，etb受体主要将血液中过多的内皮素-1通过内吞作用清除，整个系统在维持血压稳定中发挥重要的作用。除此之外，内皮素受体系统对于血管重塑、动脉粥样硬化、心脏疾病和癌症等也有相关调节作用。同时内皮素受体的拮抗剂是治疗肺动脉高血压的临床药物，美国fda分别在2001年、2007年和2013年批准波森坦、安倍森坦和马替森坦，用于临床肺动脉高血压患者的治疗。因此研究和发现内皮素受体的配体在生命医学研究和药物发展上都有重要的意义。到目前为止，没有发现小分子的eta受体特异性激动剂，因此，这一模型和筛选方法的建立，对特异性配体的发现和受体的药理学等研究都有很大的帮助(a.p.davenport,etal.,endothelin,pharmacologicalreviews,2016,68,357-418；j.j.maguireanda.p.davenport,endothelinreceptorsandtheirantagonists,seminnephrol,2015,35,125-36；m.burnier,updateonendothelinreceptorantagonistsinhypertension,currenthypertensionreports,2018,20)。
对于gpcr受体的模型构建和配体筛选方法，通常建立于转染细胞模型上。而对于内源性细胞，更多用于检测化合物对于细胞内功能因子，如白细胞介素，nf-κb等的影响。dmr技术的特点在于，可以使用内源性细胞对gpcr受体进行模型构建和配体筛选。dmr技术的原理是，将探针分子或待测分子与细胞受体结合后引起的细胞底部的质量变化，通过远程波导光栅芯片转化成光信号输出，从而在一定时间内实时监测信号升降，判断探针分子或待测分子与受体的结合情况。因此，在内源性细胞上得到的dmr信号可以覆盖更广泛的信号通路，也使得检测环境更接近生物体的真实环境。但是，由于受体在每个细胞内的表达量和功能状态都不相同，使得对于特定gpcr在dmr技术平台上的模型构建是需要研究的。本发明技术在以往研究的基础上，通过多种技术手段，发现sh-sy5y细胞系和pc3细胞系都可以表达功能性的、可被dmr技术检测分析的eta受体，能够用于eta受体的模型构建和应用；u251细胞系可以表达功能性的、可被dmr技术检测分析的etb受体，能够用于etb受体的模型构建和应用。
技术实现要素：
本发明涉及gpcr中的eta和etb两个内皮素受体亚型的无标记配体细胞筛选模型的建立和应用，目的之一是采用无标记细胞整合药理学技术建立eta和etb受体的无标记配体细胞筛选模型；目的之二是将所建立的模型用于化合物库的受体活性筛选，为发现结构新颖、活性高、选择性强的eta或etb受体的激动剂或拮抗剂，用于后续的药物开发等；目的之三是用同一种技术发展两种不同亚型的受体模型，有利于对后续的实验结果进行比较。
本发明的技术方案为：
由内源性表达内皮素受体的细胞作为载体，通过光学生物传感器微孔板获得实时响应信号，通过对实时响应信号的处理结果来表征和评判内皮素受体配体的药理学特性，从而实现无标记内皮素受体细胞模型构建和筛选。
一种内皮素受体的两个亚型--a型(eta受体)和b型(etb受体)分别在不同细胞系上，用无标记细胞动态质量重置技术进行模型建立和配体筛选系统构建，其中eta受体模型在内源性表达eta受体的sh-sy5y和pc3细胞系上分别构建，etb受体模型在内源性表达etb受体的u251细胞系上构建。
所述eta受体模型由如下方法构建得到：
a.培养sh-sy5y或pc3细胞；
b.收获步骤a所培养的sh-sy5y或pc3细胞，接种到epic光学生物传感器微孔板中，置于培养箱中培养；
c.吸弃步骤b微孔板中培养细胞的培养基，加入一定体积的hbss缓冲液，置于epic仪器上平衡孵育至细胞状态稳定；
d.在系统上建立基线，在孔内加入一定量的eta受体激动剂或拮抗剂，继续监测细胞响应信号指定时间，记为步骤s1；
e.重新建立基线，每孔加入eta受体激动剂继续监测到指定时间，记为步骤s2；
f.以s1中的探针分子剂量与本身s1的dmr信号或者s2中eta受体激动剂引起dmr响应信号的对应关系，绘制量效关系曲线，计算激动剂或拮抗剂在eta受体上的药理学参数。完成eta受体模型在sh-sy5y或pc3细胞系上的构建。
所述eta受体筛选系统由如下方法构建得到：
a.培养sh-sy5y或pc3细胞；
b.收获步骤a所培养的sh-sy5y或pc3细胞，接种到epic光学生物传感器微孔板中，置于培养箱中培养；
c.吸弃步骤b微孔板中培养细胞的培养基，加入一定体积的hbss缓冲液，置于epic仪器上平衡孵育至细胞状态稳定；
d.在系统上建立基线，在孔内加入一定量的待测化合物，继续监测细胞响应信号到指定时间，记为步骤s1；
e.重新建立基线，每孔加入所需浓度的eta受体激动剂继续监测至指定时间，记为步骤s2；
f.以s1中待测化合物剂量与本身s1的dmr信号或者s2中eta受体激动剂引起dmr响应信号的对应关系，绘制量效关系曲线，计算待测化合物的在eta受体上的药理学参数。完成待测化合物在eta受体模型上的筛选。
所述etb受体模型由如下方法构建得到：
a.培养u251细胞；
b.收获步骤a所培养的u251细胞，接种到epic光学生物传感器微孔板中，置于培养箱中培养；
c.吸弃步骤b微孔板中培养细胞的培养基，加入一定体积的hbss缓冲液，置于epic仪器上平衡孵育至细胞状态稳定；
d.在系统上建立基线，在孔内加入一定量的etb受体激动剂或拮抗剂，继续监测细胞响应信号指定时间，记为步骤s1；
e.重新建立基线，每孔加入etb受体激动剂继续监测到指定时间，记为步骤s2；
f.以s1中的探针分子剂量与本身s1的dmr信号或者s2中etb受体激动剂引起dmr响应信号的对应关系，绘制量效关系曲线，计算激动剂或拮抗剂在etb受体上的药理学参数。完成etb受体在u251细胞系上的模型构建。
所述etb受体筛选系统由如下方法构建得到：
a.培养u251细胞；
b.收获步骤a所培养的u251细胞，接种到epic光学生物传感器微孔板中，置于培养箱中培养；
c.吸弃步骤b微孔板中培养细胞的培养基，加入一定体积的hbss缓冲液，置于epic仪器上平衡孵育至细胞状态稳定；
d.在系统上建立基线，在孔内加入一定量的待测化合物，继续监测细胞响应信号到指定时间，记为步骤s1；
e.重新建立基线，每孔加入所需浓度的etb受体激动剂继续监测至指定时间，记为步骤s2；
f.以s1中待测化合物剂量与本身s1的dmr信号或者s2中etb受体激动剂引起dmr响应信号的对应关系，绘制量效关系曲线，计算待测化合物的在etb受体上的药理学参数。完成待测化合物在etb受体模型上的筛选。
所述eta受体激动剂为下列之一：内皮素-1，内皮素-2，sarafotoxins6a。所述etb受体激动剂为下列之一：内皮素-1，内皮素-2，irl1620，sarafotoxins6b，bq3020。
本发明的有益效果主要有：应用本方法建立的eta和etb受体的模型和筛选策略，是在内源性表达待测受体的细胞内，具有广泛的下游信号通路，更接近体内的真实环境；同时，应用细胞动态质量重置技术，具有无标记、实时监测、通量高、操作简单的特点。将该技术发明可用于化合物库的受体活性筛选，也可以用于发现受体下游信号通路的激动剂和拮抗剂等。另外，该方法的扩展可以对受体的配体进行多种药理学参数的测定和解析。
说明书附图
图1为eta受体分别在sh-sy5y和pc3细胞系上的表征：(a)内皮素-1在sh-sy5y细胞系上的实时dmr曲线；(b)内皮素-1和ci1020在sh-sy5y细胞系上的量效关系曲线；(c)内皮素-1在pc3细胞系上的实时dmr曲线；(d)内皮素-1和安倍森坦在pc3细胞系上的量效关系曲线。
图2为etb受体分别用内皮素-1和irl1620两个激动剂在u251细胞系上的表征：(a)内皮素-1在u251细胞系上的实时dmr曲线；(b)内皮素-1和bq788在u251细胞系上的量效关系曲线；(c)irl1620在u251细胞系上的实时dmr曲线；(d)irl1620和bq788在u251细胞系上的量效关系曲线。
图3为多个拮抗剂在eta或etb受体上的量效关系曲线：(a)eta受体的选择性拮抗剂(ci1020，fr139317)和eta/etb受体双重拮抗剂(安倍森坦，波森坦)，用内皮素-1做激动剂，在pc3细胞系上的量效关系曲线；(b)etb受体的选择性拮抗剂(bq788，irl2500)和eta/etb受体双重拮抗剂(安倍森坦，波森坦)，用irl1620做激动剂，在u251细胞系上的量效关系曲线。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明，均通过常规商业途径获得；神经母瘤细胞系sh-sy5y，前列腺癌细胞系pc3和人神经胶质细胞瘤细胞系u251均购于中国科学院上海细胞库，内皮素-1(endothelin1)、irl1620、ci1020和bq788购于tocris生物科技公司，波森坦(bosentan)和安倍森坦(ambrisentan)购于大连美仑生物技术有限公司，fr139317和irl2500购于美国apexbio生物科技有限公司，
实施例1
eta受体在sh-sy5y细胞系上的表征
将sh-sy5y细胞接种于epic光学生物传感器384微孔板中，每孔约4.5×104个细胞，培养48小时后，吸弃培养基，加入孵育好的30μlhbss缓冲液，静置1小时待细胞状态稳定。建立2min的基线后，加入梯度的eta受体激动剂(如内皮素-1，从终浓度60nm起步，1/2倍递减至0.007324nm，共14个浓度点)或拮抗剂(如ci1020，其中ci1020从终浓度3000nm起步，1/2倍递减至0.366211nm，共14个浓度点)，每孔10μl，继续监测细胞响应信号1h，记为步骤1。重新建立基线，每孔加入终浓度为10nm的内皮素-1(10μl)，继续监测细胞响应信号1h，记为步骤2。
使用imagerbetav3.7软件将所得信号响应转化成数据导出，用microsoftexcel2010和graphpadprism6软件对导出数据进行处理。经过空白校正后，得到激动剂和拮抗剂的dmr信号(图1a)，ec50和ic50值的计算中，使用数据来自dmr信号响应的最高点对应的数值(图1b)。
经过计算，在sh-sy5y细胞系上，内皮素1的ec50值为5.71±0.48nm和0.11±0.03nm，ic50值为4.25±0.22nm和0.18±0.02nm。有两个值的可能原因是sh-sy5y细胞上eta受体有单体和二聚体两种状态，两者对内皮素-1的结合强度不同。ci1020的ic50值为2.23±0.25nm。
实施例2
eta受体在pc3细胞系上的表征
将pc3细胞接种于epic光学生物传感器384微孔板中，每孔约2.5×104个，培养24小时后，吸弃培养基，加入孵育好的30μlhbss缓冲液，静置1小时待细胞状态稳定。建立2min的基线后，加入梯度的eta受体激动剂(如内皮素-1，从终浓度60nm，1/2倍递减至0.007324nm，共14个浓度点)或拮抗剂(如安倍森坦，从终浓度1000nm起步，1/2倍递减至0.12207nm，共14个浓度点)，每孔10μl，继续监测细胞响应信号1h，记为步骤1。重新建立基线，每孔加入终浓度为10nm的内皮素-1(10μl)，继续监测细胞响应信号1h，记为步骤2。
使用imagerbetav3.7软件将所得信号响应转化成数据导出，用microsoftexcel2010和graphpadprism6软件对导出数据进行处理。经过空白校正后，得到激动剂和拮抗剂的dmr信号(图1c)，ec50和ic50值的计算中，使用数据来自dmr信号响应的最高点对应的数值(图1d)。
经过计算，在pc3细胞系上，内皮素-1的ec50值为9.62±1.01nm和0.24nm，ic50值为5.83±0.57nm和0.99nm。安倍森坦的ic50值分别为87.5±12nm和8.3±1.8nm。
实施例3
etb受体在u251细胞系上的表征
将u251细胞接种于epic光学生物传感器384微孔板中，每孔约2.0×104个，培养24小时后，换无血清的培养基将细胞饥饿处理24小时，吸弃培养基，加入孵育好的30μlhbss缓冲液，静置1小时待细胞状态稳定。建立2min的基线后，加入梯度的etb受体激动剂(如内皮素-1或irl1620，其中内皮素-1从终浓度60nm,1/2倍递减至0.007324nm，irl1620从终浓度200nm，1/2倍递减至0.024414nm，每个有14个浓度点)或拮抗剂(如波森坦，从终浓度40μm起步，1/2倍递减至4.88nm，共14个浓度点)，每孔10μl。若是激动剂，则继续监测细胞响应信号1h，若是拮抗剂，则处理10min，记为步骤1。重新建立基线，每孔加入终浓度为10nm的内皮素-1(10μl)或80nm的irl1620(10μl)，继续监测细胞响应信号1h，记为步骤2。
使用imagerbetav3.7软件将所得信号响应转化成数据导出，用microsoftexcel2010和graphpadprism6软件对导出数据进行处理。经过空白校正后，得到激动剂和拮抗剂的dmr信号(其中图2a为内皮素-1在多浓度下的dmr信号，图2c为irl1620在多浓度下的dmr信号)，ec50和ic50值的计算中，使用数据来自dmr信号响应的最高点对应的数值(其中图2b为以内皮素-1为激动剂得到的激动剂和拮抗剂的剂量关系曲线，图2d为以irl1620为激动剂的激动剂和拮抗剂的剂量关系曲线)。
经过计算，在u251细胞系上，内皮素-1的ec50值为18.58±1.67nm，ic50值为8.91±0.38nm，irl1620的ec50值为3.24±0.16nm，ic50值为4.93±0.32nm。波森坦对内皮素-1的ic50值为4.54±0.30μm，波森坦对irl1620的ic50值为1.83±0.11μm。
实施例4
4个eta受体拮抗剂在pc3细胞系上的亲和力测定
将pc3细胞接种于epic光学生物传感器384微孔板中，每孔约2.5×104个，培养24小时后，吸弃培养基，加入孵育好的30μlhbss缓冲液，静置1小时待细胞状态稳定。建立2min的基线后，加入梯度的eta受体拮抗剂(如ci1020、fr139317、安倍森坦和波森坦，)，每孔10μl，处理10min，记为s1。重新在仪器上建立基线，每孔加入终浓度为10nm的内皮素-1(10μl)，监测细胞响应信号1h，得到拮抗剂在不同浓度下对激动剂内皮素-1的信号影响，记为s2。
使用imagerbetav3.7软件将所得信号响应转化成数据导出，用microsoftexcel2010和graphpadprism6软件对导出数据进行处理。经过空白校正后，使用数据来自dmr信号响应的最高点对应的数值对拮抗剂的ic50值进行计算(图3a)。
计算结果显示，在pc3细胞系上，4个eta受体拮抗剂预处理细胞10min后，得到的ic50值如下：ci1020有2.8±0.5nm和117.5±37nm两个值，fr139317是10.7±5.2nm和2004.5±230nm两个值，安倍森坦是8.3±1.8nm和87.5±12nm两个值，波森坦是38.7±10.9nm和496.6±25nm两个值。由于pc3细胞可能表达eta的单体和二聚体两种受体状态，则与eta受体单体结合的亲和性由强到弱排序如下：ci1020>fr139317≈安倍森坦>波森坦。
实施例5
4个etb受体抑制剂在u251细胞系上的亲和力测定
将u251细胞接种于epic光学生物传感器384微孔板中，每孔约2.0×104个，培养24小时后，换无血清培养基将细胞饥饿处理24h。吸弃培养基，加入孵育好的30μlhbss缓冲液，静置1小时待细胞状态稳定。建立2min的基线后，加入梯度的etb受体拮抗剂(如bq788、irl2500、波森坦和安倍森坦)，每孔10μl，处理10min，记为s1。重新在仪器上建立基线，每孔加入终浓度为80nm的irl1620(10μl)，监测细胞响应信号1h，得到拮抗剂在不同浓度下对激动剂irl1620的信号影响，记为s2。
使用imagerbetav3.7软件将所得信号响应转化成数据导出，用microsoftexcel2010和graphpadprism6软件对导出数据进行处理。经过空白校正后，使用数据来自dmr信号响应的最高点对应的数值对拮抗剂的ic50值进行计算(图3b)。
计算结果显示，在u251细胞系上，4个etb受体拮抗剂预处理细胞10min后，得到的ic50值分别为：bq788的ic50值为13.65±1.6nm，irl2500的ic50值为460.26±112nm，安倍森坦的ic50值为1832±106nm，波森坦的ic50值为2477±146nm，即，四个拮抗剂与etb受体结合的亲和性有强到弱排序为：bq788>irl2500>安倍森坦>波森坦。
1.一种无标记内皮素受体细胞模型构建和筛选方法，其特征在于：由内源性表达内皮素受体的细胞作为载体，通过光学生物传感器微孔板获得实时响应信号，通过对实时响应信号的处理结果来表征和评判内皮素受体配体的药理学特性，从而实现无标记内皮素受体细胞模型构建和筛选。
2.如权利要求1所述的构建和筛选方法，其特征在于：以sh-sy5y或pc3细胞为载体，通过光学生物传感器微孔板得到实时响应信号，通过对实时响应信号的处理来建立eta受体模型；具体eta受体模型由如下方法构建得到：
a.培养sh-sy5y或pc3细胞；
b.收获步骤a所培养的sh-sy5y或pc3细胞，接种到epic光学生物传感器微孔板中，置于培养箱中培养；
c.吸弃步骤b微孔板中培养细胞的培养基，加入一定体积的hbss缓冲液，置于epic仪器上平衡孵育至细胞状态稳定；
d.在系统上建立基线，在孔内加入一定量的eta受体激动剂或拮抗剂，继续监测细胞响应信号指定时间，记为步骤s1；
e.重新建立基线，每孔加入eta受体激动剂继续监测到指定时间，记为步骤s2；
f.以s1中的探针分子剂量与本身s1的dmr信号或者s2中eta受体激动剂引起dmr响应信号的对应关系，绘制量效关系曲线，计算激动剂或拮抗剂在eta受体上的药理学参数，完成eta受体模型在sh-sy5y或pc3细胞系上的构建。
3.如权利要求1所述的构建和筛选方法，其特征在于：以u251细胞为载体，通过光学生物传感器微孔板得到实时响应信号，通过对实时响应信号的处理来建立etb受体模型；具体etb受体模型由如下方法构建得到：
a.培养u251细胞；
b.收获步骤a所培养的u251细胞，接种到epic光学生物传感器微孔板中，置于培养箱中培养；
c.吸弃步骤b微孔板中培养细胞的培养基，加入一定体积的hbss缓冲液，置于epic仪器上平衡孵育至细胞状态稳定；
d.在系统上建立基线，在孔内加入一定量的etb受体激动剂或拮抗剂，继续监测细胞响应信号指定时间，记为步骤s1；
e.重新建立基线，每孔加入etb受体激动剂继续监测到指定时间，记为步骤s2；
f.以s1中的探针分子剂量与本身s1的dmr信号或者s2中etb受体激动剂引起dmr响应信号的对应关系，绘制量效关系曲线，计算激动剂或拮抗剂在etb受体上的药理学参数，完成etb受体在u251细胞系上的模型构建。
4.如权利要求1所述的构建和筛选方法，其特征在于：以sh-sy5y或pc3细胞为载体，通过光学生物传感器微孔板得到实时响应信号，通过对实时响应信号的处理来建立eta受体筛选系统；具体eta受体筛选系统由如下方法构建得到：
a.培养sh-sy5y或pc3细胞；
b.收获步骤a所培养的sh-sy5y或pc3细胞，接种到epic光学生物传感器微孔板中，置于培养箱中培养；
c.吸弃步骤b微孔板中培养细胞的培养基，加入一定体积的hbss缓冲液，置于epic仪器上平衡孵育至细胞状态稳定；
d.在系统上建立基线，在孔内加入一定量的待测化合物，继续监测细胞响应信号到指定时间，记为步骤s1；
e.重新建立基线，每孔加入所需浓度的eta受体激动剂继续监测至指定时间，记为步骤s2；
f.以s1中待测化合物剂量与本身s1的dmr信号或者s2中eta受体激动剂引起dmr响应信号的对应关系，绘制量效关系曲线，计算待测化合物的在eta受体上的药理学参数。完成待测化合物在eta受体模型上的筛选。
5.如权利要求1所述的构建和筛选方法，其特征在于：以u251细胞为载体，通过光学生物传感器微孔板得到实时响应信号，通过对实时响应信号的处理来建立etb受体筛选系统；具体etb受体筛选系统由如下方法构建得到：
a.培养u251细胞；
b.收获步骤a所培养的u251细胞，接种到epic光学生物传感器微孔板中，置于培养箱中培养；
c.吸弃步骤b微孔板中培养细胞的培养基，加入一定体积的hbss缓冲液，置于epic仪器上平衡孵育至细胞状态稳定；
d.在系统上建立基线，在孔内加入一定量的待测化合物，继续监测细胞响应信号到指定时间，记为步骤s1；
e.重新建立基线，每孔加入所需浓度的etb受体激动剂继续监测至指定时间，记为步骤s2；
f.以s1中待测化合物剂量与本身s1的dmr信号或者s2中etb受体激动剂引起dmr响应信号的对应关系，绘制量效关系曲线，计算待测化合物的在etb受体上的药理学参数。完成待测化合物在etb受体模型上的筛选。
6.如权利要求2或4任一所述的构建和筛选方法，其特征在于：所用的eta受体激动剂为下列之一：内皮素-1，内皮素-2，sarafotoxins6a。
7.如权利要求3或5任一所述的构建和筛选方法，其特征在于：所用的etb受体激动剂为下列之一：内皮素-1，内皮素2，irl1620，sarafotoxins6b，bq3020。
8.如权利要求1所述的方法在筛选eta和etb受体或其信号转导途径中的激动剂或拮抗剂的应用。
9.如权利要求1所述的方法在检测eta和etb任一受体的配体与eta和etb任一受体的结合活性中的应用。
技术总结