本发明属于污染物检测领域，涉及一种铅离子检测设备及其制备和检测方法，具体涉及一种基于dna水凝胶的铅离子检测设备及其制备和检测方法。
背景技术：
重金属产业对我国社会经济发展以及科学技术进步起到了重要的推动作用，随着重金属产品利用度加大，人们逐渐认识到重金属元素对生态环境的破坏是非常严重的，威胁着人类的生存安全。众所周知，铅是重金属当中的一种，由于铅离子(pb2 )在环境中不能被生物降解,而且可以通过食物链在生物体内富集，甚至可以转化为毒性更强的化学形态。所以重金属离子进入生物体后,会对生物体的正常生理功能和代谢功能造成不同程度的干扰和损害,从而使生物体表现为中毒现象,严重时甚至死亡。因此预防、处理铅污染已经关系到人类的生命健康问题，如何发掘高灵敏和高选择性测定铅离子浓度的方法具有极其重要的意义。
传统的重金属检测技术包括原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、原子发射光谱法等，这些方法都能够很好的检测痕量重金属离子，但这些方法在检测的过程中普遍存在过程繁琐、仪器费用昂贵、携带困难等其缺陷，并且会因元素、光谱等干扰而无法进行有效地测定。中国专利cn105296598a(基于8-17dnazyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用)公布了利用脱氧核酶以及荧光淬灭原理实现铅离子的检测的方案。其中，脱氧核酶(dnazyme)由一个碱基环和两条单链侧臂构成，在金属离子的作用下发生构象改变，能将与其互补的单链dna链或单链rna链连接或切断。但是现有技术的检测手段需要使用荧光基团和淬灭基团的标记核酸，检测的灵敏度有限；并且该检测方法缺少信号放大策略，导致检出限值稍高(该现有技术的pb2 的最低检测限为20nm)，不能满足对痕量铅离子检测的需求。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于dna水凝胶的铅离子检测方法，本方法结合脱氧核酶和电化学方法，通过信号放大策略，可提高对铅离子的检测的灵敏度和降低检测限值。
为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：
一种基于dna水凝胶的铅离子检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)制备修饰电极：所述修饰电极包括固定在外层的dna水凝胶，所述dna水凝胶包括由底物链和丙烯酰胺聚合形成的聚丙烯酰胺复合物p1、由酶链和丙烯酰胺聚合形成的聚丙烯酰胺复合物p2和蛋白质分子；酶链为脱氧核酶，底物链上有酶链的识别序列，酶链用于在铅离子激活后在所述识别序列切割底物链，且在酶链和底物链的5’端均修饰有丙烯酰胺基；
步骤(2)电化学检测：将待测样品加入所述修饰电极上的dna水凝胶中，使酶链切割底物链，获得待测电极，再测定待测电极的阻抗值。
采用上述技术方案，技术原理如下：将聚丙烯酰胺复合物p1、p2以及蛋白质分子孵育到电极表面，在电极表面形成三维网状的且包裹有蛋白质分子的dna水凝胶层。可使用现有技术中的电化学工作站检测待测电极的阻抗值，dna水凝胶中的聚丙烯酰胺和蛋白质分子对检测底液中离子的扩散具有阻碍作用，从而产生一个大的阻抗值。当有pb2 存在时，pb2 诱导酶链的活性中心形成，特异性剪切底物链，破坏电极表面形成的dna水凝胶的同时释放出蛋白质分子，使得电极的阻抗值变小。在pb2 存在的情况下，在底物链被剪切之后，dna水凝胶发生局部瓦解并逐渐脱落，在瓦解的过程中蛋白质分子逐步释放，直至剪切底物链的反应充分。pb2 的浓度与dna水凝胶的瓦解程度以及蛋白质分子的释放程度相对应，使得电化学阻抗值的减小值与相对应的pb2 浓度成正比，可以通过检测阻抗值的变化来实现对pb2 的高灵敏检测。在本技术方案中，底物链和酶链起到了感知和探测溶液环境中pb2 浓度情况的作用，在pb2 存在的情况下，可根据其浓度情况，酶链切割底物链(pb2 促进酶链正确折叠形成催化中心)，使得聚丙烯酰胺形成的三维网状凝胶局部瓦解，并同时释放网状结构中包裹的蛋白质分子，实现了pb2 浓度信号的级联放大。
有益效果：
(1)本技术方案构建的修饰电极是一种电化学生物传感器，可将生物分子识别过程的特异性与电化学分析的强大功能相结合，具有灵敏度高、易微型化、设备简单、操作简便、能在复杂体系样品中进行检测等优势。虽然已有现有技术利用脱氧核酶和pb2 的相互作用来检测pb2 ，但是现有技术的检测方法对痕量的pb2 还具有一定局限。脱氧核酶切割底物链并不会有电信号变化的发生，将dna断裂信号转化为稳定可靠的电信号是一个较难解决的问题。发明人巧妙地将脱氧核酶和pb2 的相互作用和电化学检测相结合，通过聚丙烯酰胺和蛋白质分子两种物质将dna断裂的信号转换成可量化的电信号，实现了对痕量pb2 的检测。
(2)脱氧核酶(dnazyme)制备的dna水凝胶中包裹蛋白质分子，可实现信号放大，从而实现对pb2 的高灵敏的测定。本方案的检测方法以及检测系统的pb2 检出限可达0.24pmol/l，远低于现有技术的pb2 检出限，可实现对痕量污染物的准确检测。破坏的水凝胶(即破坏聚丙烯酰胺形成的三维网状结构)和释放的蛋白质都可以使得电极表面的阻抗值减小，相当于将pb2 的浓度信号进行的扩增放大，增加了本方案的检测灵敏度。
(3)本检测方法具有较广的线性范围，在0.0005-500nmol/l范围内，电化学阻抗值随着pb2 浓度增加而减小，可满足多种实际应用场景的检测需求。本检测方法的特异性好，实验证明本方法对非目标离子产生的信号值与空白对照的电信号值相近，对pb2 具有较强的选择性。
(4)使用本法进行pb2 的检测，不用对样品进行特殊前处理，无需特殊设备，样品制作方法简单。
进一步，在步骤(1)中，dna水凝胶中包裹的蛋白质分子为牛血清蛋白。
采用上述技术方案，牛血清蛋白为常用的蛋白质分子，已经商业化生产，性质稳定易于获取。
进一步，在步骤(1)中，制备修饰电极的方法为：在玻碳电极表面覆盖纳米金颗粒层，将捕获链固定在纳米金颗粒层上，再通过捕获链将dna水凝胶固定在纳米金颗粒层上；所述捕获链为单链dna，捕获链的5’端通过间隔物连接有氨基，所述捕获链用于与所述底物链形成互补配对。
采用上述技术方案，通过捕获链的5’端的氨基可将捕获链固定在纳米金颗粒层表面，再通过捕获链和底物链的互补配对，可将dna水凝胶固定在纳米金颗粒层上，制备获得修饰电极。
进一步，在步骤(1)中，底物链上的酶链的识别序列为ra。
采用上述技术方案，ra为腺嘌呤核糖核酸(腺嘌呤rna)，酶链可以识别该核酸并在此位置剪切底物链。
进一步，在步骤(1)中，所述dna水凝胶的制备方法为：将底物链加入丙烯酰胺溶液中，在过硫酸铵的氧化作用和n,n,n',n'-四甲基乙二胺的催化作用下，通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物p1；将酶链加入丙烯酰胺溶液中，在过硫酸铵的氧化作用和n,n,n',n'-四甲基乙二胺的催化作用下，通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物p2；将聚丙烯酰胺复合物p1、聚丙烯酰胺复合物p2和牛血清蛋白溶液混合，获得dna水凝胶。
采用上述技术方案，丙烯酰胺在氧化剂和催化剂的作用下可形成聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺为具有三维网状结构的凝胶，凝胶中的空腔可以将牛血清蛋白包裹在其中。聚丙烯酰胺通过底物链与捕获链的结合固定在修饰电极上。
进一步，在步骤(2)中，将待测样品加入所述修饰电极上的dna水凝胶中，在35-40℃的条件下，使酶链切割底物链的时长大于或等于1h。
采用上述技术方案，随着pb2 剪切时间的延长，阻抗值逐渐地减小，这是因为滴加到电极表面的pb2 的时间越长，pb2 可特异性剪切更多底物链，从而破坏电极表面形成的水凝胶，释放更多的bsa，使电极表面对铁氰根离子的阻碍作用明显降低，从而产生较小的阻抗值。在60min之后其阻抗值就基本保持不变，说明60min时pb2 已经充分剪切底物链。孵育超过60min，都可以让pb2 充分剪切底物链。
进一步，所述酶链的序列为：acrydite-5'-atctctgaagtagcgccgccgtatagt-3'；
所述底物链的序列为：acrydite-5'-actcactatraggaagagatgatccacattttca-3'；
所述捕获链的序列为：nh2-(ch2)6-5'-gagaaaatgtgg-3'；
acrydite表示丙烯酰胺基，ra表示腺嘌呤核糖核苷酸，nh2表示氨基；(ch2)6表示连接捕获链5’端和氨基的间隔物。
采用上述技术方案，捕获链、酶链和底物链均为单链dna，酶链和底物链的5'端均通过共价键连接修饰有丙烯酰胺基(acrydite)，捕获链的5'端均通过(ch2)6间隔物共价键连接修饰有氨基(氨基用于与纳米金颗粒形成au-n键)。底物链的序列中包括一个腺嘌呤核糖核苷酸(ra)，是酶链切割底物链的识别位点，酶链是一种脱氧核酶(dnazyme)。酶链由一个碱基环和两条单链侧臂构成，酶链的靠近5'端的序列(5'-atctct-3')与底物链的靠近3'端的序列(5'-agagat-3')互补配对，酶链靠近3’端的序列(5'-atagt-3')与底物链靠近5'端的序列(5'-actat-3')互补配对。两处的互补配对使得酶链和底物链可以互补结合，并且将ra暴露在碱基环对面，当pb2 存在时，促进酶链正确折叠形成催化中心，进而在ra处切割底物链。底物链靠近3'端的序列(5'-ccacattttc-3')与捕获链上的序列(5'-aaaatgtgg-3')形成互补配对，捕获链可将底物链固定在纳米金颗粒表面。
进一步，还包括步骤(3)定量检测：配制标准溶液系列，所述标准溶液系列包括若干标准溶液，所述标准溶液中的铅离子的浓度为已知，且铅离子在若干标准溶液中的浓度相异；将标准溶液分别加入所述修饰电极上的dna水凝胶中，使酶链切割底物链，获得若干标准电极，再分别测定标准电极的阻抗值；建立阻抗值和标准溶液中的铅离子浓度的标准曲线；再通过标准曲线和步骤(2)中获得的待测电极的阻抗值，获取待测样品中的铅离子浓度数值。
采用上述技术方案，利用标准溶液系列中pb2 浓度的差异，找到pb2 浓度和电化学信号之间的关系，绘制和建立反应电化学响应信号和标准溶液中pb2 浓度之间关系的标准曲线，通过标准曲线可以获知待测样品中的pb2 的具体浓度数值，实现定量检测。
进一步，一种基于dna水凝胶的铅离子检测设备，其特征在于，包括修饰电极，所述修饰电极包括玻碳电极、覆盖在玻碳电极外的纳米金颗粒层和固定在纳米金颗粒层上的dna水凝胶；所述dna水凝胶包括由底物链和丙烯酰胺聚合形成的聚丙烯酰胺复合物p1、由酶链和丙烯酰胺聚合形成的聚丙烯酰胺复合物p2和牛血清蛋白；酶链为脱氧核酶，底物链上有酶链的识别序列，酶链用于在铅离子激活后在所述识别序列切割底物链，且在酶链和底物链的5'端均修饰有丙烯酰胺基；所述dna水凝胶通过捕获链固定在纳米金颗粒层上；所述捕获链为单链dna，捕获链的5'端通过氨基固定在纳米金颗粒层上，所述捕获链用于与所述底物链形成互补配对。
采用上述技术方案，pb2 依赖的脱氧核酶辅助形成的dna水凝胶包裹蛋白质形成的电化学生物传感器(修饰电极)，可实现信号放大，提高对pb2 的高灵敏检测。
进一步，一种基于dna水凝胶的铅离子检测设备的制备方法，其特征在于，包括修饰电极的制备：
步骤(a)dna水凝胶的制备：将底物链加入丙烯酰胺溶液中，在过硫酸铵的氧化作用和n,n,n',n'-四甲基乙二胺的催化作用下，通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物p1；将酶链加入丙烯酰胺溶液中，在过硫酸铵的氧化作用和n,n,n',n'-四甲基乙二胺的催化作用下，通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物p2；将聚丙烯酰胺复合物p1、聚丙烯酰胺复合物p2和牛血清蛋白溶液混合，获得混合溶液；
步骤(b)修饰电极的组装：在玻碳电极表面电沉积纳米金颗粒层，再将捕获链通过氨基固载在纳米金颗粒层上，并使用巯基己醇封闭表面非特异性位点；再通过捕获链和底物链的互补配对使得dna水凝胶固定在纳米金颗粒层上，获得修饰电极；将dna水凝胶固定在纳米金颗粒层上的方法为：将混合溶液滴加在纳米金颗粒层表面，然后在35-40℃的条件下孵育2h或2h以上。
采用上述技术方案，可制备获得线性范围好、检测限低、准确度高和特异性好的电化学生物传感器(修饰电极)。
附图说明
图1为实施例1的电极逐步修饰过程的cv表征。
图2为实施例1的电极逐步修饰过程的eis表征(带randle等效电路图)。
图3为实施例1的修饰电极对不同浓度pb2 检测的电化学阻抗图。
图4为实施例1的修饰电极对不同浓度pb2 检测的标准曲线。
图5为对比例1的传感器对目标离子的选择性分析结果。
图6为实验例1的电极的阻抗值与dna水凝胶孵育时间的关系曲线。
图7为实验例2的电极的阻抗值与pb2 剪切时间的关系曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1：
1.复合物的制备：
取浓度为100μm的捕获链溶液5μl，加入tirs-hcl(ph＝8)缓冲溶液195μl进行稀释后摇匀，配置成浓度为2.5μm的捕获链溶液后于-20℃的冰箱保存待用。然后准确称取0.05g的丙烯酰胺，加入0.95ml的tirs-hcl缓冲溶液配置成质量分数5％的丙烯酰胺溶液。接着准确移取4μl(100μm)的底物链溶液和16μl的5％丙烯酰胺溶液混合后摇匀(混合溶液a)，同时移取4μl(100μm)的酶链溶液和16μl的5％丙烯酰胺溶液混合后摇匀(混合溶液b)。再将混合后的溶液(混合溶液a和b)放置在37℃的真空干燥箱内10min。将新鲜配置的0.28μlaps(过硫酸铵)(10％,w/waps)和0.56μltemed(n,n,n',n'-四甲基乙二胺)(5％,v/v)溶液立即分别添加到混合溶液a和b中(aps和temed溶液均需要现配现用)，摇匀。然后放置在37℃真空干燥箱内15min进行聚合反应分别生成聚丙烯酰胺复合物p1和聚丙烯酰胺复合物p2，然后放置在4℃冰箱待用，p1和p2均用于后续的dna水凝胶的制备。
捕获链、酶链和底物链均为单链dna，它们的dna序列见表1(所有的寡核苷酸由生工生物工程(上海)股份有限公司(中国，上海)合成并纯化)。在表1中，酶链(seqidno:1)和底物链(seqidno:2)的5'端均通过共价键连接修饰有丙烯酰胺基(acrydite)，捕获链(seqidno:3)的5'端均通过(ch2)6间隔物共价键连接修饰有氨基(氨基用于与纳米金颗粒形成au-n键)。酶链、底物链和捕获链均为单链dna，底物链的序列中(第10位核酸)为一个腺嘌呤核糖核苷酸(ra，为rna、非dna)，是酶链切割底物链的识别位点，底物链除了第10位是核糖核酸(rna)外，其他均为脱氧核糖核酸(dna)。酶链是一种脱氧核酶(dnazyme)，酶链由一个碱基环和两条单链侧臂构成，酶链的靠近5'端的序列(5'-atctct-3')与底物链的靠近3'端的序列(5'-agagat-3')互补配对，酶链靠近3'端的序列(5'-atagt-3')与底物链靠近5'端的序列(5'-actat-3')互补配对。两处的互补配对使得酶链和底物链可以互补结合，并且将ra暴露在碱基环对面，当pb2 存在时，促进酶链正确折叠形成催化中心，进而在ra处切割底物链。底物链靠近3'端的序列(5'-ccacattttc-3')与捕获链上的序列(5'-aaaatgtgg-3')形成互补配对，捕获链可将底物链固定在纳米金颗粒表面。
表1：dna序列表
2.修饰电极的制备
使用前，将玻碳电极在麂皮上用0.3μm或0.05μm的三氧化二铝(al2o3)粉末打磨干净，用超纯水将其清洗干净后在室温下晾干备用。将抛光处理至光滑镜面的玻碳电极浸入到1％的haucl4溶液中，在-0.2v电位下沉积金30s后，在电极表面沉积一层均匀的纳米金颗粒(aunps)，将电极用超纯水清洗干净待用。修饰电极的构建步骤如下：首先在沉积金后的电极表面滴加8μl的捕获链溶液(2.5μm)于室温下孵育12h。孵育好后用超纯水清洗干净，再在电极表面滴加8μl的巯基己醇(mch，1mmol/l)封闭电极表面的非特异性位点，在室温下孵育20min后用超纯水清洗干净后静置。将配置好的聚丙烯酰胺复合物p1、p2(上一个步骤中制备的p1和p2全部加入)及10μl的bsa(5μmol/l)(本实施例具体使用的蛋白质分子为牛血清蛋白)溶液混合后摇匀，获得混合溶液，取8μl的上述混合溶液滴加到电极表面，放入37℃(37℃为最适温度，35-40℃均可达到上述目的)的烘箱中孵育2h，在纳米金颗粒层表面孵育得到一层dna凝胶(按照上述操作，可保证凝胶中酶链和底物链的用量比为1:1)。孵育之后用超纯水清洗干净，再在电极上滴加8μl不同浓度超纯水配制的pb2 ，(即不同浓度的标准溶液，其中pb2 浓度分别为：0.0005nm,0.001nm，0.01nm，0.1nm，1nm，10nm，100nm，500nm，均由标准母液配置而成，标准母液由国家有色金属及电子材料分析测试中心(北京，中国)提供)放入37℃(37℃为最适温度，35-40℃均可达到上述目的)的烘箱中孵育1h。用超纯水轻轻清洗后，将上述修饰好的玻碳电极(即为标准电极)浸入到检测底液中，连接电化学工作站，即可用于电化学测定。
本实施例采用传统的三电极来检测电极的电流，其中滴加有pb2 的修饰电极作为工作电极，铂丝电极为辅助电极，饱和的甘汞电极(sce)为参比电极。采用5mmol/l[fe(cn)6]3-/4-(且含有0.1mol/lkcl)的缓冲液作为循环伏安法(cv)的测试底液对电极修饰过程中界面电化学性质的变化进行表征，扫描电位范围为-0.2-0.6v，电位扫描速度为50mv/s；选择电化学阻抗法(eis)在5mmol/l[fe(cn)6]3-/4-(含有0.1mol/lkcl)的测试底液中对电极修饰过程进行表征以及实验条件的优化，生物传感器(修饰电极)性能的考察。eis的参数为：振幅为0.005v，扫描频率范围为0.1hz-100khz。
3.修饰电极的表征
在浓度为5mmol/l的[fe(cn)6]3-/4-溶液中，通过测试cv响应信号表征修饰电极的制备过程。如图1所示，裸电极(未加任何修饰的玻碳电极，gce)的cv曲线表现出对准可逆的[fe(cn)6]3-/4-的氧化还原峰(曲线a:gce)，当沉积金后，由于纳米金可促进电子传递，cv响应信号有所增强(曲线b:gce/au)。当捕获链修饰到电极表面上时，因为带有负电荷的捕获链对同样带有负电荷的[fe(cn)6]3-/4-具有排斥作用，导致其逐渐远离电极表面，响应信号有所降低(曲线c:gce/au/捕获链)。用电惰性的mch封闭非特异性位点后响应信号进一步降低(曲线d:gce/au/捕获链/mch)，最后将聚丙烯酰胺复合物p1、p2及bsa孵育到电极表面形成dna水凝胶后，利用dna水凝胶的三维网状结构，将bsa包裹在水凝胶内，由于水凝胶和bsa对铁氰根离子的扩散具有阻碍作用，使铁氰化物难以扩散到电极表面发生氧化还原反应，使cv响应信号大大降低(曲线e:gce/au/捕获链/mch/dna水凝胶)。当加入pb2 之后，pb2 活化酶链特异性剪切底物链，从而破坏电极表面形成的dna水凝胶，并释放bsa，电极表面阻碍电子传递的物质减少，cv响应信号增强(曲线f:gce/au/捕获链/mch/dna水凝胶/pb2 )。通过以上的cv表征结果，证明传感器(修饰电极)的构建是成功的。
此外，使用eis进一步表征了修饰电极的制备过程。如图2所示，裸电极的eis曲线具有较小的阻抗值(曲线a:gce)，当纳米金沉积上去之后，由于其能促进电子的传递，阻抗值明显减小，阻抗图谱几乎是一条直线(曲线b:gce/au)。然后将捕获链修饰到电极表面上时，阻抗值进一步增大(曲线c:gce/au/捕获链)。接着用mch封闭电极表面的非特异性位点后，阻抗值进一步增大(曲线d:gce/au/捕获链/mch)，最后将聚丙烯酰胺复合物p1、p2及牛血清蛋白(bsa)孵育到电极表面形成dna水凝胶，利用dna水凝胶的三维网状结构，将bsa包裹在水凝胶内，由于水凝胶和bsa对铁氰根离子的扩散具有较强的阻碍作用，使铁氰化物难以扩散到电极表面发生氧化还原反应，从而产生一个较大的阻抗值(曲线e:gce/au/捕获链/mch/dna水凝胶)。将pb2 加到水凝胶包裹bsa的电极表面，pb2 活化酶链特异性剪切底物链，从而破坏电极表面形成的dna水凝胶，同时释放出bsa，使电极表面对铁氰根离子的阻碍作用明显降低，阻抗值降低(曲线f:gce/au/捕获链/mch/dna水凝胶/pb2 )。cv和eis表征结果具有一致性，证明传感器(修饰电极)是成功构建的。
4.标准曲线的建立
为了验证所构建的生物传感器(修饰电极)是否对pb2 具有高灵敏度和定量检测的潜能，在5mmol/l[fe(cn)6]3-/4-的底液中对不同pb2 浓度处理后的修饰电极进行eis检测。如图3所示，在0.0005-500nmol/l范围内，电化学阻抗值随着pb2 浓度增加而减小。图4给出了其对应的阻抗值与pb2 浓度对数的标准曲线，线性方程为：r＝-704.37lgc-3608.15(c为pb2 的浓度)，相关系数r＝0.9971，计算得出检出限为0.24pmol/l。:实验数据表明，所构建的生物传感器可以应用于pb2 的定量检测，且检出限值低，可适应于低pb2 浓度样品的检测。
实施例2
本实施例使用实施例1建立的检测体系对样品进行检测。为了验证此本方案的pb2 检测方法在实际样品分析中是否具有实用性，我们在不同样品(包括自来水和湖水)中加入不同浓度的pb2 溶液获得待测样品(待测样品情况如表1所示，“加入的pb2 浓度”表示样品中的实际的pb2 浓度)，并使用实施例1构建的检测系统(包括标准曲线在内)，对于待测样品和待测电极进行eis的测定。具体操作如下：按照实施例1的方法在覆盖有纳米金颗粒的玻碳电极上覆盖dna水凝胶，然后在修饰电极上滴加8μl待测样品，放入37℃的烘箱中孵育1h。用超纯水轻轻清洗后，将上述修饰好的玻碳电极(即为待测电极)浸入到检测底液中，连接电化学工作站，即可用于电化学测定，且电化学检测条件同实施例1。根据实施例1中的标准曲线进行实验结果的分析，分析后的数据列于表2中(“测量得到的pb2 浓度”表示pb2 浓度的检测值)。实际样品的回收率在91％至107.6％之间，由表2结果可知，具有较好的回收率。因此，所构建的检测方法和修饰电极对检测环境中水溶液中的pb2 具有实用性和检测准确性。
表2：环境样品溶液中pb2 浓度检测结果
对比例1：
为了验证所构建的生物传感器是否对pb2 具有选择性，在最优实验条件下，我们用浓度均为50nmol/l的十种干扰离子cu2 、mn2 、ni2 、co2 、ca2 、cd2 、ag2 、ba2 、cr2 、al3 、fe2 和浓度为1nmol/l的目标离子pb2 进行干扰实验。检测方法图实施例2，只是使用纯水配置上述金属离子浓度的溶液，来代替待测样品。如图5所示，十一种离子中只有pb2 的电信号较小，其他十种离子信号值都比较高与空白值相近，说明所构建的生物传感器是对pb2 具有选择性。
实验例1：dna水凝胶的孵育时间的优化
dna水凝胶孵育时间的优化是基于pb2 孵育时间的长短导致电化学阻抗值变化来确定，使用不同的孵育时间来检测阻抗值(将包裹有蛋白质分子的dna水凝胶溶液滴加到电极表面，再进行孵育的步骤)，实验结果如图6所示，从图6中可以看到，随着孵育时间的延长，阻抗值在逐渐地增加。这是因为孵育时间越长，在电极表面形成的dna水凝胶越多，利用dna水凝胶的三维网状结构，将bsa包裹在水凝胶内，水凝胶和bsa对铁氰根离子的扩散的阻碍作用越大，产生更大的阻抗值。在120min之后其阻抗值就基本保持不变，说明在120min时，dna水凝胶在电极表面已经完全形成。因此选择120min作为电极表面dna水凝胶的最佳孵育时间(实施例1中采用了37℃的烘箱中孵育2h的孵育条件)。孵育超过120min，都可以让dna水凝胶在电极表面完全形成。
实验例2：pb2 的剪切时间的优化
本实验例探究了pb2 的剪切时间与电化学阻抗值之间的关系。使用不同的剪切时间来检测阻抗值(即将pb2 溶液滴加到修饰电极上，再进行孵育的步骤，在孵育当中pb2 作用于酶链对底物链进行剪切)，结果如图7所示。从图7中，随着pb2 剪切时间的延长，阻抗值逐渐地减小，这是因为滴加到电极表面的pb2 的时间越长，pb2 可特异性剪切更多底物链，从而破坏电极表面形成的水凝胶和释放出的bsa越多，使电极表面对铁氰根离子的阻碍作用明显降低，产生的阻抗值就越小。在60min之后其阻抗值就基本保持不变，说明60min时pb2 已经充分剪切底物链。因此选择60min作为pb2 的最佳剪切时间(实施例1中采用了37℃的烘箱中孵育1h)。孵育时间超过60min，都可以让pb2 充分剪切底物链。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
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<211>12
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
gagaaaatgtgg12
1.一种基于dna水凝胶的铅离子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)制备修饰电极：所述修饰电极包括固定在外层的dna水凝胶，所述dna水凝胶包括由底物链和丙烯酰胺聚合形成的聚丙烯酰胺复合物p1、由酶链和丙烯酰胺聚合形成的聚丙烯酰胺复合物p2和蛋白质分子；酶链为脱氧核酶，底物链上有酶链的识别序列，酶链用于在铅离子激活后在所述识别序列切割底物链，且在酶链和底物链的5’端均修饰有丙烯酰胺基；
步骤(2)电化学检测：将待测样品加入所述修饰电极上的dna水凝胶中，使酶链切割底物链，获得待测电极，再测定待测电极的阻抗值。
2.根据权利要求1所述的一种基于dna水凝胶的铅离子检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，dna水凝胶中包裹的蛋白质分子为牛血清蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种基于dna水凝胶的铅离子检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，制备修饰电极的方法为：在玻碳电极表面覆盖纳米金颗粒层，将捕获链固定在纳米金颗粒层上，再通过捕获链将dna水凝胶固定在纳米金颗粒层上；所述捕获链为单链dna，捕获链的5'端通过间隔物连接有氨基，所述捕获链用于与所述底物链形成互补配对。
4.根据权利要求3所述的一种基于dna水凝胶的铅离子检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，底物链上的酶链的识别序列为ra。
5.根据权利要求4所述的一种基于dna水凝胶的铅离子检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述dna水凝胶的制备方法为：将底物链加入丙烯酰胺溶液中，在过硫酸铵的氧化作用和n,n,n',n'-四甲基乙二胺的催化作用下，通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物p1；将酶链加入丙烯酰胺溶液中，在过硫酸铵的氧化作用和n,n,n',n'-四甲基乙二胺的催化作用下，通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物p2；将聚丙烯酰胺复合物p1、聚丙烯酰胺复合物p2和牛血清蛋白溶液混合，获得混合溶液；将混合溶液滴加在所述纳米金颗粒层上，经孵育后获得一层覆盖在纳米金颗粒层上的dna水凝胶。
6.根据权利要求5所述的一种基于dna水凝胶的铅离子检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，将待测样品加入所述修饰电极上的dna水凝胶中，在35-40℃的条件下，使酶链切割底物链的时长大于或等于1h。
7.根据权利要求6所述的一种基于dna水凝胶的铅离子检测方法，其特征在于，
所述酶链的序列为：acrydite-5'-atctctgaagtagcgccgccgtatagt-3'；
所述底物链的序列为：acrydite-5'-actcactatraggaagagatgatccacattttca-3'；
所述捕获链的序列为：nh2-(ch2)6-5'-gagaaaatgtgg-3'；
acrydite表示丙烯酰胺基，ra表示腺嘌呤核糖核苷酸，nh2表示氨基；(ch2)6表示连接捕获链5'端和氨基的间隔物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的一种基于dna水凝胶的铅离子检测方法，其特征在于，还包括步骤(3)定量检测：配制标准溶液系列，所述标准溶液系列包括若干标准溶液，所述标准溶液中的铅离子的浓度为已知，且铅离子在若干标准溶液中的浓度相异；将标准溶液分别加入所述修饰电极上的dna水凝胶中，使酶链切割底物链，获得若干标准电极，再分别测定标准电极的阻抗值；建立阻抗值和标准溶液中的铅离子浓度的标准曲线；再通过标准曲线和步骤(2)中获得的待测电极的阻抗值，获取待测样品中的铅离子浓度数值。
9.一种基于dna水凝胶的铅离子检测设备，其特征在于，包括修饰电极，所述修饰电极包括玻碳电极，覆盖在玻碳电极外的纳米金颗粒层和固定在纳米金颗粒层上的dna水凝胶；所述dna水凝胶包括由底物链和丙烯酰胺聚合形成的聚丙烯酰胺复合物p1、由酶链和丙烯酰胺聚合形成的聚丙烯酰胺复合物p2和牛血清蛋白；酶链为脱氧核酶，底物链上有酶链的识别序列，酶链用于在铅离子激活后在所述识别序列切割底物链，且在酶链和底物链的5’端均修饰有丙烯酰胺基；所述dna水凝胶通过捕获链固定在纳米金颗粒层上；所述捕获链为单链dna，捕获链的5'端通过氨基固定在纳米金颗粒层上，所述捕获链用于与所述底物链形成互补配对。
10.根据权利要求9所述的一种基于dna水凝胶的铅离子检测设备的制备方法，其特征在于，包括修饰电极的制备：
步骤(a)dna水凝胶的制备：将底物链加入丙烯酰胺溶液中，在过硫酸铵的氧化作用和n,n,n',n'-四甲基乙二胺的催化作用下，通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物p1；将酶链加入丙烯酰胺溶液中，在过硫酸铵的氧化作用和n,n,n',n'-四甲基乙二胺的催化作用下，通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物p2；将聚丙烯酰胺复合物p1、聚丙烯酰胺复合物p2和牛血清蛋白溶液混合，获得混合溶液；
步骤(b)修饰电极的组装：在玻碳电极表面电沉积纳米金颗粒层，再将捕获链通过氨基固载在纳米金颗粒层上，并使用巯基己醇封闭表面非特异性位点；再通过捕获链和底物链的互补配对使得dna水凝胶固定在纳米金颗粒层上，获得修饰电极；将dna水凝胶固定在纳米金颗粒层上的方法为：将混合溶液滴加在纳米金颗粒层表面，然后在35-40℃的条件下孵育2h或2h以上。
技术总结