本发明属于淀粉样蛋白的检测领域，具体涉及一种检测β-淀粉样蛋白的新型复合材料，从而实现对淀粉样蛋白早期检测。
背景技术：
阿尔茨海默症是一种与衰老相关的神经退行性疾病，主要见于老年人，临床上以记忆障碍、失语、定向障碍、认知障碍等为特征，并随着时间的推移而逐渐恶化。(jack,c.r.；knopman,d.s.；jagust,w.j.；shaw,l.m.；aisen,p.s.；weiner,m.w.；petersen,r.c.；trojanowski,j.q.lancetneurol.2010,9(1),119-128.)。关于阿尔兹海默症的发病机制主要有淀粉样蛋白β(aβ)假说和tau蛋白假说。前者认为淀粉样蛋白能够在患者大脑中形成淀粉样斑块，损伤神经细胞之间的沟通。aβ是神经炎斑块的主要成分，其中主要有aβ1-40和aβ1-42两种类型，它们会自发地形成寡聚体、原纤维和斑块等不同形态的聚集体(spies,p.e.；slats,d.；sjogren,j.m.c.；kremer,b.p.h.；verhey,f.r.j.；rikkert,m.；verbeek,m.m.curr.alzheimer.res.2010,7,470-476.wogulis,m.；wright,s.；cunningham,d.；chilcote,t.；powell,k.；rydel,r.e.j.neurosci.2005,25,1071-1080.)。在淀粉样斑块中，aβ1-40的含量要远高于aβ1-42，表现出更快的聚集速率，产生更多的自由基损伤，并且被认为是更具有神经毒性的物质(pellarin,r.；caflisch,a.interpretingtheaggregationkineticsofamyloidpeptides.j.mol.biol.2006,360(4),882–892.)。研究表明，在淀粉样斑块中，一些具有氧化还原活性的离子(例如铜离子、铁离子)的含量相对较高，它们可能与阿尔兹海默症的发病有关。其中铁离子主要以血红素中的配离子形式存在。血红素可以与aβ结合形成复合物，这种结合会降低血红素的生物调控能力，从而导致正常生理功能所必需的血红素缺乏(activesiteenvironmentofheme-boundamyloidpeptideassociatedwithalzheimer’sdiseasedebajyotipramanik,somdattaghoshdey,j.am.chem.soc.2011,133,81–87.)。现阶段对于aβ常用的分析方法主要是免疫分析法、质谱分析法和蛋白质印记(j.-h.kang,m.korecka,j.b.toledo,j.q.trojanowskiandl.m.shaw,clin.chem.,2013,59,903–916.g.grasso,massspectrom.rev.,2011,30,347–365.n.ida,t.hartmann,j.pantel,j.
电致化学发光(ecl)作为一种新兴的检测技术，从某种意义上来说，ecl是电化学方法和光谱方法的理想结合。因此，ecl不仅具有传统化学发光的灵敏度和较宽的动态范围，而且具有电化学方法简单、稳定、方便等优点。三联吡啶钌、鲁米诺、金属纳米团簇、无机氮化物和半导体量子点(yuan,j.,li,t.,yin,x.b.,guo,l.,jiang,x.,jin,w.,yang,x.,wang,e.,2006.anal.chem.78,2934–2938.li,x.,lu,p.,wu,b.,wang,y.,wang,h.,du,b.,pang,x.,wei,q.,2018.biosens.bioelectron.112,40–47.zhou,y.,chen,m.,zhuo,y.,chai,y.,xu,w.,yuan,r.,2017.anal.chem.89,6787–6793.sha,h.,zhang,y.,wang,y.,ke,h.,xiong,x.,jia,n.,2019.biosens.bioelectron.124–125,59–65.liu,y.,lei,j.,huang,y.,ju,h.,2014.anal.chem.86,8735–8741.)都是常用的优异发光材料。近年来，氮化碳纳米片(g-c3n4)以其良好的生物相容性和在紫外光照射下固有的蓝色荧光发射特性，可以作为一种应用前景广阔的信号标签(zhang,x.d.；xie,x.；wang,h.；zhang,j.j.；pan,b.c.；xie,y.j.am.chem.soc.2013,135,18-21.)。g-c3n4的固有蓝色荧光发射也被用于cu2 的荧光检测(tian,j.；liu,q.；asiri,a.m.；al-youbi,a.o.；sun,x.ultrathingraphiticcarbonnitridenanosheet:ahighlyefficientfluorosensorforrapid,ultrasensitivedetectionofcu2 .anal.chem.2013,85,5595-5599.)。为了拓宽g-c3n4的应用前景，将g-c3n4与氯化血红素(hemin)进行复合，成功制备了一种g-c3n4-heme复合材料，利用aβ-血红素复合物具有过氧化物酶活性从而可以催化g-c3n4电致化学发光这一特性，将g-c3n4-heme复合材料用于淀粉样蛋白肽的检测。
技术实现要素：
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于检测淀粉样蛋白肽的新型复合材料、一种检测β-淀粉样蛋白材料的生物传感器及其构建方法。
术语“aβ”是指：β-淀粉样蛋白(1-40)。术语“hemin”是指：氯化血红素。术语“heme”是指：血红素。术语“g-c3n4”是指：氮化碳纳米片。术语“g-c3n4-heme”是指：氮化碳纳米片-血红素复合物。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测β-淀粉样蛋白的生物传感器，包括金电极、末端带有巯基的dna固定链、β-淀粉样蛋白和氮化碳纳米片-血红素复合物，末端带有巯基的dna固定链负载在金电极表面，末端带有巯基的dna固定链表面捕获β-淀粉样蛋白，β-淀粉样蛋白表面捕获氮化碳纳米片-血红素复合物。
一种检测β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，具体包括以下步骤：
(1)用铝粉在抛光布上打磨金电极，将打磨好的电极依次在二次去离子水、乙醇、二次去离子水中超声三分钟，然后用氮气吹干，放到4℃备用；
(2)将末端带有巯基的dna固定链滴到步骤(1)预处理后的电极上，放到37℃的烘箱中过夜反应；
(3)将适量混合均匀的氮化碳纳米片-血红素复合物(g-c3n4-heme)悬浊液加入到不同浓度的β-淀粉样蛋白(aβ)溶液中，然后将步骤(2)处理后的电极放入该溶液中。
进一步地，所述g-c3n4-heme悬浊液，即检测淀粉样蛋白肽的新型复合材料，的制备方法，具体包括以下步骤：
(101)取适量g-c3n4悬浊液和hemin溶液加入圆底烧瓶，搅拌，使两者混合15分钟，加大转速，在高速搅拌的条件下加入400μl的氨水和60μl的水合肼，快速搅拌5分钟后放在60℃的水浴锅中保持4小时，然后置于4℃冰箱中过夜。
(102)将步骤(101)得到的悬浊液在10000转/分钟的转速下离心洗涤，去除未反应的hemin，然后重新分散在二次去离子水中，得到g-c3n4-heme悬浊液。
优选地，所述步骤(101)中，g-c3n4与hemin的质量比为(1：3)～(3：1)，最优选为1：1。
优选地，所述步骤(3)溶液中β-淀粉样蛋白与g-c3n4-heme的反应时间为2-24小时；最优选地，反应时间为12小时。
优选地，所述步骤(3)中β-淀粉样蛋白溶液的ph为：5.9-8.4；最优选地，所述ph为7.4。
优选地，步骤(3)中g-c3n4-heme悬浮液的加入量为：10-60μl；最优选地，所述材料用量为50μl。
优选地，所述g-c3n4在425nm、440nm、460nm、490nm、535nm、555nm、575nm波长下，具有电致化学发光信号，最佳电致化学发光信号波长为460nm。
优选地，所述生物传感器的检测液中过硫酸钾的浓度：0mol/l、0.5×10-1mol/l、10-1mol/l、10-2mol/l、10-3mol/l；最优选地，所述过硫酸钾浓度为10-1mol/l。
本发明制备的g-c3n4-heme还可应用于光催化、电催化等领域。
本发明的有益效果：
(1)本发明制备的生物传感器可以用于淀粉样蛋白的检测，在1.0×10-14mol/l～1.0×10-7mol/l范围内具有良好线性。
(2)g-c3n4-heme应用于淀粉样蛋白体系中，利于血红素和淀粉样蛋白多肽的结合作用，实现了对淀粉样蛋白行为的检测，该技术对淀粉样蛋白有较好的特异性，可以快速灵敏的实现对淀粉样蛋白的早期检测。
(3)本发明制备的生物传感器具有构建方法简单、成本低、生物相容性好等优点，丰富了对淀粉样蛋白检测的新方法。
附图说明
图1为验证本发明构建的生物传感器可行性的电化学发光检测图(a表示未加入β-淀粉样蛋白，b表示加入β-淀粉样蛋白，c表示加入β-淀粉样蛋白和亚甲基蓝)；
图2为本发明中hemin、g-c3n4和g-c3n4-heme的红外吸收光谱图(a为hemin，b为g-c3n4-heme，c为g-c3n4)；
图3为本发明中hemin、g-c3n4和g-c3n4-heme的紫外吸收光谱图(a为g-c3n4，b为g-c3n4-heme,c为hemin)；
图4表明本发明中制备的g-c3n4-heme的xps光谱图；
图5为本发明构建的生物传感器对不同浓度的β-淀粉样蛋白的电化学发光检测图(a)及相应的标准曲线(b)。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是公知的，但是本发明仍然在此作尽可能的详细描述。
除非特别指明，以下实施例中所用的β-淀粉样蛋白购自上海生工生物股份有限公司。β-淀粉样蛋白序列为：daefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgailglmvggvv。
除非特别指明，以下实施例中所用的dna购自上海生工生物股份有限公司，dna序列为gcctgtggtgttggggcgggtgcg。
除非特别指明，以下实施例中所用的水溶液的溶剂均为二次去离子水。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
尿素、氯化血红素(hemin)、氨水、水合肼、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、过硫酸钾和六氟异丙醇(hfip)均购自阿拉丁试剂有限公司。
仪器：
红外吸收光谱仪，型号ft-irnicoletis10。
紫外吸收光谱仪，购自株式会社日立制作所，型号uh5300。
x光电子能谱仪，购自美国赛默飞世尔科技，型号thermoescalab250xi。
电致化学发光分析仪，购自西安瑞迈公司，型号mpi-e。
实施例1
本实施例涉及的g-c3n4-heme的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)10g尿素放入坩埚中，放入烘箱中，以20℃/分钟的速度升温，升温到550℃维持两小时，自然冷却到室温即可得块状c3n4。
(2)取100mg块状c3n4溶于100ml二次去离子水中，用细胞粉碎仪超声粉碎俩小时，超声处理好的g-c3n4悬浊液在4℃存储备用。
(3)取5mlg-c3n4悬浊液和5ml1mg/mlhemin溶液加入圆底烧瓶，搅拌，使两者混合15分钟，加大转速，在高速搅拌的条件下加入400μl的氨水和60μl的水合肼，快速搅拌5分钟后放在60℃的水浴锅中保持4小时，然后置于4℃冰箱中过夜。
(4)将步骤(3)得到的悬浊液在10000转/分钟的转速下离心10分钟，离心洗涤3次，去除未反应的hemin，洗涤好的材料重新分散在二次去离子水中，得到g-c3n4-heme悬浊液，置于4℃冰箱备用。
对原料hemin、以及制备的g-c3n4和g-c3n4-heme均进行红外光谱表征，通过红外吸收光谱各个吸收峰的位置的变化表征材料制备成功，如图2所示。对原料hemin、以及制备的g-c3n4和g-c3n4-heme均进行紫外吸收光谱表征，在紫外吸收中，g-c3n4-heme由于heme的掺入吸收峰的位置发生了明显的红移，如图3所示。对g-c3n4-heme进行x光电子能谱分析(xps)，在xps能谱分析中，通过c、n、fe元素的检测，表明制备材料的成功。
实施例2
aβ溶液的配置：
(1)将aβ粉末溶于六氟异丙醇(hfip)中，配制成1.0mg/ml的六氟异丙醇(hfip)溶液，配置好的溶液用冷冻干燥器进行冷冻干燥，在试管底部形成aβ层状薄膜。
(2)冷冻干燥完的aβ层状薄膜溶于pbs缓冲溶液(ph＝7.4)中，配制成1.0×10-6mol/l的aβ溶液，-20℃备用。
aβ的检测：
(1)在实验测试前，用0.05μm的铝粉在抛光布上打磨金电极，将打磨好的电极依次在二次去离子水、乙醇、二次去离子水中各自超声三分钟，超声完的电极用氮气吹干，放到4℃备用；
(2)将dna试剂放在常温下静置2分钟，在10000转/分钟的条件下离心10分钟，加入pbs缓冲溶液(ph＝7.4)配制成一定浓度的溶液。将配置好的dna溶液与tcep溶液混合以切断dna溶液中的二硫键，得到末端带有巯基的dna固定链。
(3)将末端带有巯基的dna固定链滴到预处理后的电极上，放到37℃的烘箱中过夜反应。
(4)把制备g-c3n4-heme悬浊液超声5分钟使其分散均匀，取一定量的g-c3n4-heme悬浊液加入试管中，然后加入不同量的aβ溶液，配置成aβ标准溶液，将处理好的电极用pbs缓冲溶液(ph＝7.4)冲洗，接着放入试管中，放入恒温烘箱中37℃保持12小时。孵育完后将电极放入装有过硫酸钾检测液的检测池中进行电致化学发光信号检测，得到aβ浓度与电致化学发光强度的标准曲线。其中，过硫酸钾检测液的浓度为10-1mol/l。
另外，取一定量的制备g-c3n4-heme悬浊液超声5分钟使其分散均匀，取一定量的g-c3n4-heme悬浊液加入试管中，然后分别加入aβ溶液和加入aβ溶液和亚甲基蓝，将处理好的电极用pbs缓冲溶液(ph＝7.4)冲洗，接着放入试管中，放入恒温烘箱中37℃保持12小时。孵育完后将电极放入装有过硫酸钾检测液的检测池中进行电致化学发光信号检测，过程中设置未加入aβ溶液的空白样，如图1所示。
1.一种检测β-淀粉样蛋白的新型复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(101)取适量g-c3n4悬浊液和hemin溶液混合均匀，在高速搅拌的条件下加入氨水和水合肼，放在60℃的水浴锅中保持4小时，然后置于4℃冰箱中过夜。
(102)将步骤(101)最终得到的悬浊液在10000转/分钟的转速下离心洗涤，去除未反应的hemin，然后重新分散在二次去离子水中。
2.一种权利要求1所述制备方法制备的检测β-淀粉样蛋白的新型复合材料。
3.权利要求2所述的检测β-淀粉样蛋白的新型复合材料用于构建检测β-淀粉样蛋白的生物传感器。
4.根据权利要求1所述的检测β-淀粉样蛋白的生物传感器，其特征在于，构建方法包括以下步骤：
(1)用铝粉在抛光布上打磨金电极，将打磨好的电极依次在二次去离子水、乙醇、二次去离子水中超声三分钟，然后用氮气吹干，放到4℃备用；
(2)将末端带有巯基的dna固定链滴到步骤(1)预处理后的电极上，放到37℃的烘箱中过夜反应；
(3)将适量混合均匀的氮化碳纳米片-血红素复合物(g-c3n4-heme)悬浊液加入到不同浓度的β-淀粉样蛋白(aβ)溶液中，然后将步骤(2)处理后的电极放入该溶液中。
5.根据权利要求4所述的检测β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，其特征在于，所述步骤(101)中，g-c3n4与hemin的质量比为(1：3)～(3：1)；步骤(3)溶液中β-淀粉样蛋白与g-c3n4-heme的反应时间为2-24小时；步骤(3)中β-淀粉样蛋白溶液的ph为：5.9-8.4；步骤(3)中g-c3n4-heme悬浮液的加入量为：10-60μl；所述g-c3n4-heme在425nm、440nm、460nm、490nm、535nm、555nm、575nm波长下具有电致化学发光信号。
6.根据权利要求5所述的检测β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，其特征在于，所述步骤(101)中，g-c3n4与hemin的质量比为1：1；步骤(3)溶液中β-淀粉样蛋白与g-c3n4-heme的反应时间为12小时；步骤(3)中β-淀粉样蛋白溶液的ph为：7.4；步骤(3)中g-c3n4-heme悬浮液的加入量为50μl；所述g-c3n4-heme在460nm波长下具有最强电致化学发光信号。
7.根据权利要求6所述的检测β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，其特征在于，生物传感器的检测液中过硫酸钾的浓度：0mol/l、0.5×10-1mol/l、10-1mol/l、10-2mol/l、10-3mol/l。
技术总结