本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种基于maldi-tof-ms的注胶肉快速筛查装置与方法。
背景技术：
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
瓜尔胶和卡拉胶是常用的食品增稠胶。作为食品工业中用来提高粘度或形成凝胶的一类重要食品添加剂，它们常同时起着稳定食品体系的乳化或悬浊状态、保持水分、改善食品口味和外观等其他各种重要作用。卡拉胶是目前肉类食品中最常用的一种食用胶，由于卡拉胶能与蛋白质结合，形成巨大的网络结构，所以可保持肉制品中的大量水分，减少肉汁的流失，主要应用于肉糜类、火腿类制品的生产。瓜尔胶在肉制品中主要用作增稠剂、粘合剂和持水剂，因其价格低廉，是目前世界上最应用广泛的亲水性胶体之一。最近，由于肉价的不断攀升，有些不法分子向生鲜肉中注入卡拉胶或瓜尔胶，制售“注胶肉”(含有卡拉胶或瓜尔胶的畜鲜肉或者冻肉)，严重侵犯了广大消费者的食品安全权益。更严峻的是，注胶肉的胶水还可能带来其他致病微生物和外源性有害物质污染的风险，因此快速鉴别肉中是否注入瓜尔胶或卡拉胶，检测注胶肉的瓜尔胶或卡拉胶含量对保障人民的食品安全具有极其重要的意义。
目前国内外尚无注胶肉相关的检测装置或者标准。虽然低场核磁共振技术和近红外光谱技术可以通过大量样本实验、统计学模型建立等手段实现注胶肉的判别，但过程繁琐，模型参数难以统一，且无法提供定量信息，难以在实际的执法检测中实现大规模的应用。因此迫切需要开发一种新的筛查装置和方法对注胶肉进行快速鉴定与定量分析。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种基于maldi-tof-ms的注胶肉快速筛查装置与方法。首次将maldi-ms分析方法用于含胶生鲜畜肉的直接快速检测，不需要复杂的前处理，且样品用量少、分析速度快，可实现高通量进样分析，具有良好的实际应用价值。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种基于maldi-tof-ms的快速检测肉中瓜尔胶和卡拉胶的分析方法，包括以下步骤：
1)将待测肉样放入刀式研磨仪均质，充分混匀，将配置好的1.5mol/l的三氟乙酸溶液注入装有待测肉糜的样品管中，对样品管进行加热，加热温度80摄氏度，加热时间30分钟；
2)待加热结束后，取样品管中的水解液1ul于靶板位点之上，在40℃下烘干2分钟；
3)将2,5-二羟基苯甲酸(dhb)和乙腈/水二元混合液配置成浓度为15-40mg/ml的基质溶液，用基质点样枪向靶板位点加入1ul基质溶液；
4)取靶板进行maldi实验。
进一步地，所述步骤4)中maldi-tof-ms的质谱条件为：激光能量80-100％、采集区间200-1500、采集模式为反射模式、扫描频次为累积2000次。
进一步地，在所述步骤4)中，m/z＝527、689、852及1013为检出的瓜尔胶水解产物特征峰。
进一步地，在所述步骤4)中，m/z＝527等为检出的卡拉胶水解产物特征峰。
进一步地，在所述步骤3)中，所述基质溶液的浓度为15-40mg/ml。
另一方面，本申请的另一技术方案为：
根据前述之一所述方法的检测装置，包括：
装载酸液的tfa注射枪(2)；
第一运动导轨(1)，可以实现tfa注射枪(2)的定向等距离移动；
样品管(3)，所述样品管(3)放置在样品架(4)中；
加热套(5)，可以实现对样品管(3)的恒温定时加热；
进样摇臂(6)，可将水解后的上清液直接从样品管(3)转移至质谱靶版(9)上；
装载基质溶液的基质点样枪(8)，第二运动导轨(7)，可以实现基质点样枪(8)的定向等距离移动；
用于快速烘干质谱靶版(9)上样品的加热烘干器(10)。
又一方面，本申请的又一技术方案为：
根据前述装置的分析方法，包括：
待装有肉糜的样品管(3)置于样品架(4)后，开启所述装置开关，tfa注射枪(2)将三氟乙酸酸液注入样品管(3)中；
用于水解肉糜的样品架(4)、加热套(5)及取样的进样摇臂(6)均固定在操作台上，以确保装载酸液的tfa注射枪(2)可以沿着运动导轨，准确的将酸液按序列顺序注入至样品管中；
酸液注射结束后，样品架(4)外围的加热套(5)开始加热。
进一步地，该装置的检测步骤还包括：加热结束后，进样摇臂(6)启动，按照序列顺序依次将样品管(3)中的水解液取特定体积于靶板之上，完成取样后，摇臂恢复至侧位。
进一步地，靶板下方的烘干器(10)启动，达到特定温度后亮起红色指示灯，指示可以取靶板进行上机实验。
进一步地，所述方法的检测时间为1小时以内。
发明人经过试验发现，当采用maldi-tof-ms方法分析注胶肉水解物时，由于无需复杂的前处理过程，大大缩短了分析检测时间。
本发明的有益效果为：
本发明方法采用maldi-tof-ms技术，首次成功一种基于maldi-tof-ms的注胶肉快速筛查装置，建立了快速检测肉中瓜尔胶和卡拉胶的分析方法。该方法在几分钟内就可以迅速完成注胶肉中含胶量的准确检测分析，快速、简便，可以实现高通量的注胶肉鉴定。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定
图1为本发明中基于maldi-tof-ms的注胶肉快速筛查装置示意图。其中，1、第一运动导轨，2、tfa注射枪，3、样品管，4、样品架，5、加热套，6、进样摇臂，7、第二运动导轨，8、基质点样枪，9、质谱靶板，10、烘干器。
图2为本发明中纯瓜尔胶水解液的maldi-tof-ms图。
图3为本发明中纯肉糜水解液的maldi-tof-ms图。
图4为本发明中注胶肉(瓜尔胶)的水解液的maldi-tof-ms图。
图5为为本发明中纯卡拉胶水解液的maldi-tof-ms图。。
图6为本发明中注胶肉(卡拉胶)的水解液的maldi-tof-ms图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明旨在提供一种基于maldi-tof-ms的注胶肉快速筛查装置，建立生鲜畜肉中瓜尔胶或卡拉胶的检测方法。拟采用自动装置对添加瓜尔胶或卡拉胶的畜肉进行水解、点样等前处理；然后通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)对自动点样后的靶板进行分析。通过鉴定注入胶后的特征标志性离子，建立基于maldi-tof-ms的注入胶的快速分析方法。maldi-tof-ms是一种简单但功能强大的质谱技术，可用于对各种类型的水解物进行快速ms分析，而无需事先进行色谱分离。maldi-ms分析技术对杂质具有耐受性，这使其成为分析生鲜畜肉复杂样品水解物的合适方法。发明人发现，目前，maldi-tof-ms还未被应用到生鲜畜肉中食品增稠胶鉴定的应用中。下面结合图1-6对本申请实施例进行详细介绍：
实施例1
基于maldi-tof-ms的注胶肉快速筛查装置，包括：
1可以实现定向等距离移动的运动导轨，2、装载酸液的tfa注射枪，3、样品管，4、样品架，5、可以实现恒温定时加热的加热套，6、进样摇臂，可将水解后的上清液直接从样品管转移至质谱靶版上，7、可以实现定向等距离移动的运动导轨，8、装载基质溶液的基质点样枪，9、质谱靶板，10、用于快速烘干样品的加热烘干器。
待肉糜置于样品架后，开启自动装置开关，tfa注射枪将特定体积及浓度的酸液注入样品管中。
用于水解肉糜的样品架、加热套及取样的进样摇臂均固定在操作台上，以确保装载酸液的tfa注射枪可以沿着运动导轨，准确的将酸液按序列顺序注入至样品管中。
酸液注射结束后，样品架外围的加热套开始加热，直至设定温度，保持设定时间。
待加热时间结束后，进样摇臂启动。按照序列顺序依次将样品管中的水解液取特定体积于靶板之上，完成取样后，摇臂恢复至侧位。
靶板下方的烘干器启动，达到特定温度后亮起红色指示灯，指示可以取靶板进行上机实验。
maldi-tof-ms的注胶肉快速筛查装置的工作程序如图2所示。
实施例2
注胶肉(瓜尔胶)的maldi-tof-ms分析方法，包括如下步骤：
(1)仪器与试剂
本发明实施例所用的质谱仪是brukerrapiflexmalditissuetypersystem；所用的天平是mettlertoledoxs105电子天平。
所用的试剂为德国默克公司色谱纯乙腈和甲醇；所用的三氟乙酸为上海麦克林生化科技有限公司的分析纯试剂；所用的基质为西格玛公司的2,5-二羟基苯甲酸(dhb)和α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)基质。
(2)样品配制
将配置0.5-2mol/l的三氟乙酸溶液。
将dhb和chca分别用甲醇/水二元混合液，丙酮/水二元混合液和乙腈/水二元混合液配置成浓度为20-100mg/ml的基质溶液。
(3)质谱条件
brukerrapiflexmalditissuetypersystem质谱仪：正离子扫描模式；扫描范围：m/z200-1500；激光波长：355nm；激光能量:50％-100％；采用反射模式；采样率：1.25gss-1；加速电位：±20kv，真空压力：3-5x10-7mbar；脉冲离子提取延迟：100ns。
(4)结果
4.1酸解液浓度的选择
考察了tfa浓度为0.5mol/l、1mol/l、1.5mol/l和2mol/l时对特征标志物离子检测的影响。实验发现，1.5mol/l的tfa浓度足以水解瓜尔胶，产生特征标志物离子m/z＝527、689、852及1013等离子。综合考虑，本发明选择了1.5mol/l的酸解液浓度。
4.2酸解时间的选择
考察了tfa酸解时间为10分钟、20分钟、30分钟和60分钟时对特征标志物离子检测的影响。实验发现，30分钟的酸解时间足以水解瓜尔胶，产生特征标志物离子m/z＝527、689、852及1013等离子。综合考虑，本发明选择了30分钟的酸解时间。
4.3基质的选择
考察了chca和dhb两种溶剂对特征标志物离子检测的影响。实验发现，以乙腈/水二元混合液作为溶剂，15mg/ml的dhb溶液作为基质时对特征标志物离子出峰效果较好。因此，本发明选择了15mg/mldhb乙腈/水二元混合溶液作为质谱基质。
4.4maldi-tof-ms质谱扫描频次的优化
考察了maldi-tof-ms质谱扫描频次为200、500、1000和2000时对特征标志物离子检测的影响。实验发现，特征标志物离子的信号强度随着质谱扫描频次的增加而增强，综合考虑，本发明选择了2000的质谱扫描频次。
4.5纯瓜尔胶水解的maldi-tof-ms图
利用优化的条件，采用maldi-tof-ms方法对纯瓜尔胶水解液进行检测。由图3所示，当酸解液浓度为1.5mol/l，酸解30分钟后，激光能量为90％，扫描频次为2000时，纯瓜尔胶水解液maldi-tof-ms图中出现m/z＝527、689、852及1013等寡糖离子峰，而在同样条件下对纯肉糜的水解液进行质谱分析时，未出现一致的寡糖特征峰，如图4所示，因此可判定m/z＝527、689、852及1013为检出的瓜尔胶水解产物特征峰。
4.6注胶肉(瓜尔胶)的水解液的maldi-tof-ms图
利用优化的条件，采用maldi-tof-ms方法对不同含胶量的注胶肉，分别为1g/kg,5g/kg,10g/kg,50g/kg,100g/kg的水解液进行检测,根据上述maldi-tof-ms优化参数调整仪器为最优工作状态，进行质谱分析检测，发现含量为1g/kg的注胶肉的maldi-tof-ms图中出现m/z＝527等特征离子峰，且随着含胶量的增加，m/z＝527等特征离子峰的强度也增加，呈现良好的线性关系，成功的实现了对注胶肉含胶量的检测，如图5所示。
一些不法商贩为了牟利，每100公斤肉通过3次注胶，一般可以注入20-40公斤的胶水。而用于水性增稠胶体的高分子量瓜尔胶添加量一般为5％固含量。以每100公斤注入胶水20kg为例，其中，纯胶的含量大概为1kg，注胶肉中含胶量为10g/kg。而本实验成果实现了对含量为1g/kg的注胶肉检测，完全可以满足实际市场的检测需要。
实施例3
注胶肉(卡拉胶)的maldi-tof-ms分析方法，包括如下步骤：
(1)仪器与试剂
本发明实施例所用的质谱仪是brukerrapiflexmalditissuetypersystem；所用的天平是mettlertoledoxs105电子天平。
所用的试剂为德国默克公司色谱纯乙腈和甲醇；所用的三氟乙酸为上海麦克林生化科技有限公司的分析纯试剂；所用的基质为西格玛公司的2,5-二羟基苯甲酸(dhb)和α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)基质。
(2)样品配制
将配置0.5-2mol/l的三氟乙酸溶液。
将dhb和chca分别用甲醇/水二元混合液，丙酮/水二元混合液和乙腈/水二元混合液配置成浓度为20-100mg/ml的基质溶液。
(3)质谱条件
brukerrapiflexmalditissuetypersystem质谱仪：正离子扫描模式；扫描范围：m/z200-1500；激光波长：355nm；激光能量:50％-100％；采用反射模式；采样率：1.25gss-1；加速电位：±20kv，真空压力：3-5x10-7mbar；脉冲离子提取延迟：100ns。
(4)结果
4.1酸解液浓度的选择
考察了tfa浓度为0.5mol/l、1mol/l、1.5mol/l和2mol/l时对特征标志物离子检测的影响。实验发现，1.5mol/l的tfa浓度足以水解卡拉胶，产生特征标志物离子m/z＝527等离子。综合考虑，本发明选择了1.5mol/l的酸解液浓度。
4.2酸解时间的选择
考察了tfa酸解时间为10分钟、20分钟、30分钟和60分钟时对特征标志物离子检测的影响。实验发现，30分钟的酸解时间足以水解卡拉胶，产生特征标志物离子m/z＝527等离子。综合考虑，本发明选择了30分钟的酸解时间。
4.3基质的选择
考察了chca和dhb两种溶剂对特征标志物离子检测的影响。实验发现，以乙腈/水二元混合液作为溶剂，15mg/ml的dhb溶液作为基质时对特征标志物离子出峰效果较好。因此，本发明选择了15mg/mldhb乙腈/水二元混合溶液作为质谱基质。
4.4maldi-tof-ms质谱扫描频次的优化
考察了maldi-tof-ms质谱扫描频次为200、500、1000和2000时对特征标志物离子检测的影响。实验发现，特征标志物离子的信号强度随着质谱扫描频次的增加而增强，综合考虑，本发明选择了2000的质谱扫描频次。
4.5纯卡拉胶水解的maldi-tof-ms图
利用优化的条件，采用maldi-tof-ms方法对纯卡拉胶水解液进行检测。由图6所示，当酸解液浓度为1.5mol/l，酸解30分钟后，激光能量为90％，扫描频次为2000时，纯卡拉胶水解液maldi-tof-ms图中出现m/z＝527等寡糖离子峰，而在同样条件下对纯肉糜的水解液进行质谱分析时，未出现一致的寡糖特征峰，如图4所示，因此可判定m/z＝527等为检出的卡拉胶水解产物特征峰。
4.6注胶肉(卡拉胶)的水解液的maldi-tof-ms图
利用优化的条件，采用maldi-tof-ms方法对不同含胶量的注胶肉，分别为1g/kg,5g/kg,10g/kg,50g/kg,100g/kg的水解液进行检测,根据上述maldi-tof-ms优化参数调整仪器为最优工作状态，进行质谱分析检测，发现含量为5g/kg的注胶肉的maldi-tof-ms图中出现m/z＝527等特征离子峰，且随着含胶量的增加，m/z＝527等特征离子峰的强度也增加，呈现良好的线性关系，成功的实现了对注胶肉含胶量的检测，如图6所示，因此完全可以满足实际市场的检测需要。
5、结论
本发明方法采用maldi-tof-ms技术，首次成功提供了一种基于maldi-tof-ms的注胶肉快速筛查装置，并建立生鲜畜肉中瓜尔胶或卡拉胶的检测方法。整个过程操作简单方便，从样品准备到得出结果，在1小时内就可以迅速完成上百种生鲜畜肉含胶量的准确检测分析，可快速、简便、准确并且高通量地鉴别生鲜畜肉是否掺胶，并实现对含胶量的定量检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种基于maldi-tof-ms的快速检测肉中瓜尔胶和卡拉胶的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将待测肉样放入刀式研磨仪均质，充分混匀，将配置好的1.5mol/l的三氟乙酸溶液注入装有待测肉糜的样品管中，对样品管进行加热，加热温度80摄氏度，加热时间30分钟；
2)待加热结束后，取样品管中的水解液1ul于靶板位点之上，在40℃下烘干2分钟；
3)将2,5-二羟基苯甲酸(dhb)和乙腈/水二元混合液配置成浓度为15-40mg/ml的基质溶液，用基质点样枪向靶板位点加入1ul基质溶液；
4)取靶板进行maldi实验。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤4)中maldi-tof-ms的质谱条件为：激光能量80-100％、采集区间200-1500、采集模式为反射模式、扫描频次为累积2000次。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，在所述步骤4)中，m/z＝527、689、852及1013为检出的瓜尔胶水解产物特征峰。
4.根据权利要求1-3之一所述方法，其特征在于，在所述步骤4)中，m/z＝527等为检出的卡拉胶水解产物特征峰。
5.根据权利要求1-3之一所述方法，其特征在于，在所述步骤3)中，所述基质溶液的浓度为15-40mg/ml。
6.根据权利要求1-5之一所述方法的检测装置，其特征在于，包括：
装载酸液的tfa注射枪(2)；
第一运动导轨(1)，可以实现tfa注射枪(2)的定向等距离移动；
样品管(3)，所述样品管(3)放置在样品架(4)中；
加热套(5)，可以实现对样品管(3)的恒温定时加热；
进样摇臂(6)，可将水解后的上清液直接从样品管(3)转移至质谱靶版(9)上；
装载基质溶液的基质点样枪(8)，第二运动导轨(7)，可以实现基质点样枪(8)的定向等距离移动；
用于快速烘干质谱靶版(9)上样品的加热烘干器(10)。
7.根据权利要求6所述装置的分析方法，其特征在于，包括：
待装有肉糜的样品管(3)置于样品架(4)后，开启所述装置开关，tfa注射枪(2)将三氟乙酸酸液注入样品管(3)中；
用于水解肉糜的样品架(4)、加热套(5)及取样的进样摇臂(6)均固定在操作台上，以确保装载酸液的tfa注射枪(2)可以沿着运动导轨，准确的将酸液按序列顺序注入至样品管中；
酸液注射结束后，样品架(4)外围的加热套(5)开始加热。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，该装置的检测步骤还包括：加热结束后，进样摇臂(6)启动，按照序列顺序依次将样品管(3)中的水解液取特定体积于靶板之上，完成取样后，摇臂恢复至侧位。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，靶板下方的烘干器(10)启动，达到特定温度后亮起红色指示灯，指示可以取靶板进行上机实验。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述方法的检测时间为1小时以内。
技术总结