本发明专利涉及高效液相色谱领域，更具体地说，涉及一种细内径毛细管液相色谱柱填充方法及所用匀浆罐，尤其适用于装填25μm至250μm的细内径毛细管高效液相色谱柱。
背景技术：
色谱柱是高效液相色谱分析的核心部分。毛细管液相色谱柱是色谱柱的一个重要分支，内径为几十微米至几百微米之间。近年来，由于毛细管色谱柱的柱体积小(0.01～30μl)，所消耗流动相体积较小(0.1～10l/年)，所需样品量小，在生物生化分析中得到了快速发展。
近年来，毛细管液相色谱在分析微量或痕量生物样品等方面发挥着越来越重要的作用。但是填料在装填过程中有部分破碎，其表面丰富的硅羟基会对碱性药物、蛋白质类生物分子、激素类等产生吸附作用，因此，在毛细管液相色谱柱的装填过程中越来越重视填料的完整性，即需要降低装填过程中填料的破碎率。目前主流的填充方式有上行法和下行法两种。采用上行法填充需要附加磁力搅拌装置，在填充的过程中由于填料与磁子间的摩擦、碰撞，会增加填料的破碎率。而下行法则不需要磁力搅拌装置，避免了填料与磁子间的摩擦、碰撞而导致的破损。但采用下行法填充时，为了避免填料由于重力作用而聚沉，多采用快速装填的方式进行，填料在装填的过程中下行速度很快，与匀浆罐出料通道的变径处碰撞，造成填料破碎，导致色谱柱的惰性下降、峰拖尾、柱效降低和柱前压上升。
技术实现要素：
针对上述技术问题，本发明提出一种细内径毛细管液相色谱柱的填充方法及填充柱匀浆罐的改进方案，采用高密度的匀浆溶剂进行缓慢填充，保证填料规则排布，提高柱效。提出的匀浆罐的圆锥形出料端由高分子材料制成，使填料装填过程中填料颗粒只与高分子材料摩擦碰撞，减缓填料装填过程中与变径通道的冲击力，降低填柱过程中填料的破碎率。
本发明的技术方案是：
一种细内径毛细管液相色谱柱的填充方法，包括以下步骤：
a、将带有筛板的细内径毛细管连接固定至匀浆罐出料端；
b、将填料与高密度的匀浆溶剂相混合配制成匀浆液，所述匀浆溶剂的密度与填料密度接近，超声混匀后备用；
c、向匀浆罐中添加适量的上述匀浆液，空余区用溶剂填满，确保匀浆罐中不存在气泡；
d、将匀浆罐进料端与高压液相泵连接，泵内预先充满给定的溶剂。启动高压液相泵，将流动相压入匀浆罐当中，采用控压模式低流速填充；
e、初始填充压力为0.3～0.5mpa，随着填充的进行，以1.5～2mpa/min的速度升压，直至30～40mpa，恒压10～30min后关闭高压液相泵；
f、待高压液相泵的压力降至零后，卸下装填完成的细内径毛细管液相色谱柱。
所述步骤a中的毛细管色谱柱筛板为整体柱筛板，由含有填料键合相或载体的聚合物制备而成，长度是2～3mm；所述毛细管内径是25μm～250μm，外径是365μm。
所述步骤b中的填料可以是硅胶基质，匀浆溶剂可以是四氯化碳/甲醇混合液或四溴乙烷/甲醇混合液，其中四氯化碳或四溴乙烷的体积分数是90％～95％；所述填料的浓度范围是25～30mg/ml；所述超声时间范围是1～2min。
所述步骤d中流动相为甲醇或乙醇，流动相的流速为15～20μl/min。
一种用于权利要求1所述填充方法的匀浆罐，由罐体(1)、高压管连接件(2)、peek套管(3)和圆锥形出料件(4)组成，其特征在于：匀浆罐的圆锥形出料件(4)为圆锥形且由高分子材料制作而成。
所述匀浆罐罐体(1)为密闭中空的桶状结构，内部为圆柱形空腔，空腔内放置有圆锥形出料件(4)，圆锥形出料件(4)锥形下端为出口端；
罐体(1)上端连接有高压管连接件(2)，该高压管连接件(2)下端口伸入至罐体(1)内；
罐体(1)下端连接有高压管连接件(2)，该高压管连接件(2)下端口伸入至罐体(1)内，，peek套管(3)一端伸入此高压管连接件(2)内，待填充的毛细管通过peek套管(3)经由此高压管连接件(2)伸入罐体(1)内部与圆锥形出料件(4)的下端口相连；
所述匀浆罐罐体(1)和圆锥形出料件(4)为分立结构，罐体(1)材质为不锈钢，圆锥形出料件(4)的上端口外径与罐体(1)的内径相匹配，圆锥形出料件(4)直接嵌入罐体内部，使圆锥形出料件(4)圆锥外表面与罐体内表面形成密闭空间。
所述高分子材料为尼龙或聚芳醚酮(paek)。
与现有技术相比，本发明的细内径毛细管高效液相色谱柱填充方法及所用匀浆罐具有如下优点：
1、传统的下行法毛细管柱填充方式，由于填充速度较快，填料与匀浆罐内金属变径口摩擦冲击，造成填料破碎，导致色谱柱的惰性下降、峰拖尾、柱效降低和柱前压上升。而本发明提出低速填充毛细管柱的方案，采用密度与填料密度接近的匀浆溶剂，控制填充压强来减缓填料聚沉速度，使得填充层的排列更有序，提高柱效。加之采用高分子材料的匀浆罐内，避免填料破碎，
2、匀浆罐的罐体材质为不锈钢，可以耐高压，适用于细内径毛细管柱的填充。为了避免填料在填充过程中撞击到不锈钢变径口上而导致的破损，匀浆罐的出料口嵌入高分子材料的圆锥形通道出料口，减缓填充过程中对填料的冲击，可有效降低填料的破碎率。因此显著改善色谱柱的整体惰性，在用于碱性药物、蛋白质、激素类组分的分析时，可以减小色谱峰的拖尾因子，有利于蛋白质的色谱分离。
附图说明
图1是本发明的匀浆罐的一种示意性实施方式的结构示意图；图中：1-罐体，2-高压管连接件，3-peek套管，4-圆锥形出料件，5-毛细管液相色谱柱。
图2为应用例1中内径为50μm毛细管液相色谱柱分离igg蛋白质的色谱图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，通过实施例对本发明进行说明。本发明所列的这些具体实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1：
一种匀浆罐：由罐体、高压管连接件、peek套管和圆锥形出料件组成，罐体的材质为不锈钢，罐体内部为圆柱形空腔，内径为2.1mm，外径为3.17mm；空腔内放置有圆锥形出料件，圆锥形出料件锥形下端为出口端，圆锥形出料件由尼龙材料制成，匀浆罐罐体和圆锥形出料件为分立结构。圆锥形出料件的顶端直径为2.1mm，底端内径为0.4mm，直接嵌入罐体内部，其底端与连接件紧密接触。罐体上端连接有高压管连接件(实施例中的高压管连接件均由1/16英寸不锈钢卡套和1/16英寸不锈钢螺帽组成)，该高压管连接件下端口伸入至罐体内，罐体下端连接有高压管连接件和内径为0.4mm的peek套管，peek套管一端伸入高压管连接件内，高压管件伸入至罐体内，如附图1所示，待填充的毛细管通过peek套管和高压连接件伸入罐体内部与圆锥形出料件的下端口相连。使用外径365μm的石英毛细管作为色谱柱管，将石英毛细管预先插入2cm长、内径为0.4mm的peek套管内，再连接到匀浆罐的圆锥形出料件的下端口。
采用上述匀浆罐填充细内径毛细管液相色谱柱，步骤如下：
a、将带有长3mm、c4整体柱筛板石英毛细管通过peek套管和高压连接件与匀浆罐圆锥形出料件下端口相连接固定，石英毛细管的内径为50μm，外径为365μm，长度为20cm；
b、采用粒径5μm的c4键合硅胶色谱填料进行装填，将填料与体积分数为95％四氯化碳/甲醇匀浆溶剂相混合配制成匀浆液，填料的浓度为28.5mg/ml。超声混匀1min后备用；
c、向匀浆罐中添加200μl上述匀浆液，空余区用溶剂填满，确保匀浆罐中不存在气泡；
d、将匀浆罐高压管连接件上端口连接至高压液相泵，泵内预先充满甲醇，启动高压液相泵，将甲醇压至匀浆罐当中；
e、初始填充压力为0.3mpa，随着填充的进行，以1.5mpa/min的速度升压，终止压力为30mpa，恒压30min后关闭高压液相泵；
f、待高压液相泵的压力降至初零后，卸下装填完成的细内径毛细管液相色谱柱。
应用例1：
将实施例1所填充毛细管液相色谱柱与高效液相色谱系统相连接，并采用激光诱导荧光荧光检测器对其柱效进行评价。液相色谱条件为：流动相a乙腈：流动相b体积分数为0.1％三氟乙酸水溶液＝8：2；流动相流速：200nl/min；样品：5μl3×10-10mdylight488标记的igg单标。sepu3010色谱工作站(浙江大学)用于信号采集。实验结果见图2，由计算得到此毛细管色谱柱的柱效为61,500，色谱峰的拖尾因子为1.17。说明此填充方法所填毛细管色谱柱可以用于蛋白质的高效分离。
实施例2：
采用实施例1所述的匀浆罐填充细内径毛细管液相色谱柱，步骤如下：
a、将带有长3mm、硅胶整体柱筛板的石英毛细管通过peek套管和高压连接件与匀浆罐圆锥形出料件下端口相连接固定，石英毛细管的内径为250μm，外径为365μm,长度为25cm；
b、采用粒径5μm的c18键合硅胶色谱填料进行装填，将填料与体积分数为90％四氯化碳/甲醇匀浆溶剂相混合配制成匀浆液，填料的浓度为30mg/ml。超声混匀1min后备用；
c、向匀浆罐中添加200μl上述匀浆液，空余区用溶剂填满，确保匀浆罐中不存在气泡；
d、将匀浆罐高压管连接件上端口连接至高压液相泵，泵内预先充满甲醇，启动高压液相泵，将甲醇压至匀浆罐当中；
e、初始填充压力为0.5mpa，随着填充的进行，以1.5～2mpa/min的速度升压，终止压力为27mpa，恒压10min后关闭高压液相泵；
f、待高压液相泵的压力降至零后，卸下装填完成的细内径毛细管液相色谱柱。
实施例3：
如实施例1所述的匀浆罐，其中，出料端为内孔为圆锥形的聚芳醚酮(paek)材质。采用该匀浆罐填充细内径毛细管液相色谱柱，步骤如下：
a、将带有长3mm、硅胶整体柱筛板的石英毛细管通过peek套管和高压连接件与匀浆罐圆锥形出料件下端口相连接固定，石英毛细管的内径为75μm，外径为365μm，长度为25cm；
b、采用粒径5μm的c18键合硅胶色谱填料进行装填，将填料与体积分数为95％四溴乙烷/甲醇匀浆溶剂相混合配制成匀浆液，填料的浓度为25mg/ml。超声混匀1min后备用；
c、向匀浆罐中添加230μl上述匀浆液，空余区用溶剂填满，确保匀浆罐中不存在气泡；
d、将匀浆罐高压管连接件上端口连接至高压液相泵，泵内预先充满甲醇，启动高压液相泵，将甲醇压至匀浆罐当中；
e、初始填充压力为0.3mpa，随着填充的进行，以1.5～2mpa/min的速度升压，终止压力为35mpa，恒压30min后关闭高压液相泵；
f、待高压液相泵的压力降至零后，卸下装填完成的细内径毛细管液相色谱柱。
1.一种细内径毛细管液相色谱柱的填充方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、将带有筛板的细内径毛细管通过peek套管(3)与匀浆罐圆锥形出料件(4)下端口相连接固定；
b、将填料与高密度的匀浆溶剂相混合配制成匀浆液，所述匀浆溶剂的密度与填料密度接近，超声混匀后备用；
c、向匀浆罐及圆锥形出料件(4)中添加适量上述匀浆液，空余区用溶剂填满，确保匀浆罐中不存在气泡；
d、将匀浆罐高压管连接件(2)上端口与高压液相泵连接，泵内预先充满给定溶剂，启动高压液相泵，将流动相压至匀浆罐当中，采用控压模式低流速填充；
e、初始填充压力为0.3～0.5mpa，随着填充的进行，以1.5～2mpa/min的速度升压，直至30～40mpa，恒压10～30min后关闭高压液相泵；
f、待高压液相泵的压力降至零后，卸下装填完成的细内径毛细管液相色谱柱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤a中的毛细管色谱柱筛板为整体柱筛板，由含有填料键合相或载体的聚合物制备而成，长度是2～3mm；所述毛细管内径是25μm～250μm，外径为365μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤b中的填料为硅胶基质，匀浆溶剂为四氯化碳/甲醇混合液或四溴乙烷/甲醇混合液，其中四氯化碳或四溴乙烷的体积分数是90％-95％；所述填料的浓度范围是25～30mg/ml；所述超声时间范围是1～2min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤d中流动相为甲醇或乙醇，流动相的流速为15～20μl/min。
5.一种用于权利要求1所述填充方法的匀浆罐，由罐体(1)、高压管连接件(2)、peek套管(3)和圆锥形出料件(4)组成，其特征在于：匀浆罐的圆锥形出料件(4)为圆锥形且由高分子材料制作而成。
6.根据权利要求5所述的匀浆罐，其特征在于：所述匀浆罐罐体(1)为密闭中空的桶状结构，内部为圆柱形空腔，空腔内放置有圆锥形出料件(4)，圆锥形出料件(4)锥形下端为出口端；
罐体(1)上端连接有高压管连接件(2)，该高压管连接件(2)下端口伸入至罐体(1)内；
罐体(1)下端连接有高压管连接件(2)，该高压管连接件(2)下端口伸入至罐体(1)内，peek套管(3)一端伸入此高压管连接件(2)内，待填充的毛细管通过peek套管(3)经由此高压管连接件(2)伸入罐体(1)内部与圆锥形出料件(4)的下端口相连；
所述匀浆罐罐体(1)和圆锥形出料件(4)为分立结构，罐体(1)材质为不锈钢，圆锥形出料件(4)的上端口外径与罐体(1)的内径相匹配，圆锥形出料件(4)直接嵌入罐体内部，使圆锥形出料件(4)圆锥外表面与罐体内表面形成密闭空间。
7.根据权利要求5所述的匀浆罐，其特征在于：所述高分子材料为尼龙或聚芳醚酮。
技术总结