本发明涉及分析化学技术领域，具体而言，涉及一种基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法。
背景技术：
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
短链脂肪酸(shortchainfattyacids)，也称为挥发性脂肪酸，根据碳原子数目的多少，将碳原子数目为1-6的有机脂肪酸称为短链脂肪酸，其中乙酸、丙酸和丁酸因其潜在的生物学效应而备受关注。肠道内高浓度的短链脂肪酸能够调节宿主肠道的免疫力，有效缓解肠道炎症反应，还可以抑制结肠肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化和凋亡，影响原癌基因表达。此外，肠道中的短链脂肪酸能够调节肠道中的ph值，从而影响肠道菌群的平衡，而肠道菌群又与许多疾病密切相关。
发明人发现，目前对于淋巴组织中短链脂肪酸的定量检测方法还未见报道，血清中短链脂肪酸的定量方法虽有报道，但由于其操作步骤繁琐、时间成本高、回收率结果偏低等特点未得到广泛应用。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，该检测方法可以快速、灵敏地检测血清、淋巴组织中的三种短链脂肪酸。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，包括如下步骤：
将淋巴组织进行预处理，得到淋巴提取液；
向血清或淋巴提取液中加入内标物，并加入五氟溴卞进行衍生化反应；
衍生后溶液经过萃取后，利用gc-ms对萃取液中的乙酸、丙酸和丁酸进行检测。
五氟溴苄烷化试剂与其他传统衍生化试剂相比，五氟溴苄的反应快速，用时短(最快约20min)即可，且衍生物在gc上灵敏度高，非常适用于脂肪酸含量低的样品分析。
在一些实施例中，所述血清的制备方法，包括如下步骤：将采集的全血静置设定时间后，低温离心，取上清液，即得血清。
静置是为了降低血清和红细胞的粘连，从而使血清更容易与红细胞分离，不易产生溶血现象。若不静置直接离心，会导致红细胞破裂，发生溶血现象，影响测定结果。
在一些实施例中，淋巴组织预处理的方法是向淋巴组织中加入预冷的超纯水，在低温下研磨均匀，然后涡旋、超声提取、离心，取上清液，即为淋巴提取液。
进一步的，研磨的温度为3-5℃，优选为4℃。
在一些实施例中，所述内标物为2-乙基丁酸。
发明人经过试验发现，衍生化反应时，2-乙基丁酸与乙酸、丙酸和丁酸灰发生相同的衍生化反应；在用有机溶剂萃取时，2-乙基丁酸在有机相中的分配情况、挥发性、对萃取容器的吸附性等与乙酸、丙酸和丁酸相似，所以2-乙基丁酸作为内标物，可以准确反应待测物质在衍生化反应、萃取过程中的损失，进而提高待测物质检测的准确性。
在一些实施例中，所述衍生化反应的方法，包括如下步骤：
向加入内标物的提取液中加入中性缓冲液，然后加入五氟溴卞，混合均匀后，55-65℃水浴加热1-2h，即可。
进一步的，所述中性缓冲液为磷酸盐缓冲液。
进一步的，所述衍生化反应还包括将反应结束后的反应体系置于冰上降温的步骤。
自然降温过程较长，为防止操作过程中目标分析物的损失，选择在冰上降温。
在一些实施例中，所述萃取过程中使用的有机溶剂为正己烷。
进一步的，萃取的时间为1-3min。
在一些实施例中，气相色谱条件为：hp-5毛细管柱，30m×0.25mm×0.25um；进样口温度：250℃；进样量1μl，分流比30:1；载气：氦气；程序升温：70℃保持3min，以10℃/min的速率升温至130℃，以30℃/min的速率升温至280℃，保持2min。
在一些实施例中，质谱条件为：离子源温度：230℃；传输线温度：290℃；电离方式：电子轰击源(ei)；电离能量：70ev；溶剂延迟：7min；采用选择离子模式(sim)扫描。
本发明的有益效果为：
(1)本发明通过衍生化方法，建立了一种血清、淋巴组织中3种短链脂肪酸的检测气相色谱质谱快速测定方法。针对不同的生物样本进行预处理，并进行衍生化处理，加入内标进行校正，实现准确定量。
(2)本发明首次实现了淋巴结组织样本中的短链脂肪酸的测定。
(3)本发明重复性好、回收率高、适用于血清、淋巴组织中短链脂肪酸的检测。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中标准工作溶液的色谱图；
图2为本发明实施例中空白样品中短链脂肪酸的色谱图(a.血清，b.淋巴)；
图3为本发明实施例中40μm添加水平的短链脂肪酸色谱图(a.血清，b.淋巴)；
图4为本发明实施例中400μm添加水平的短链脂肪酸色谱图(a.血清，b.淋巴)；
图5为本发明实施例中1000μm添加水平的短链脂肪酸色谱图(a.血清，b.淋巴)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
实施例1
(1)仪器与试剂
agilent7890a气相色谱仪(美国agilenttechnology公司)；ikavortex3涡旋混匀器(德国ika公司)；hh-s恒温水浴锅(中国金坛市医疗仪器厂)；冷冻离心机(美国thermofisher公司)；milli-q超纯水系统(美国millipore公司)。
乙酸、丙酸、丁酸、2-乙基丁酸、五氟溴卞(美国sigma-aldrich公司)；丙酮、正己烷(中国科密欧试剂公司)；磷酸盐缓冲液(中国鼎国生物试剂公司)；
(2)样品预处理
血清：将采集的全血室温下静置30min,4℃2000rpm条件下，离心20min，取上清液；
淋巴组织：准确称量50mg淋巴组织，加入1ml预冷的超纯水，采用组织研磨仪在4℃条件下研磨均匀，剧烈涡旋1min，超声提取15min，4℃10000rpm条件下离心10min，取上清液；
(3)样品前处理
取待测样品(血清、淋巴组织提取液)100μl，置于2ml玻璃带帽管中，加入10μl内标(2-乙基丁酸)，加入44μlph＝7的磷酸盐缓冲液，加入280μl100mm五氟溴卞，激烈涡旋1min，使之充分混匀，60℃水浴加热1.5h，结束后，取出置于冰上降温，加入200μl正己烷，涡旋提取2min，4℃，10000rpm条件下离心10min，取上层正己烷层作为样品待测液，进行gc-ms分析，分析得到的色谱图如图2所示。
(4)标准工作溶液的配制
包括3种短链脂肪酸和1种内标的单标储备液的配制、3种短链脂肪酸和1种内标的混标储备液的配制及系列标准工作溶液的配制，内标为2-乙基丁酸，标准工作溶液配制的具体过程如下：
单标储备液：以超纯水作为溶剂配制质量浓度分别为175mm、134mm及109mm的3种短链脂肪酸的单标储备液，以丙酮作为溶剂配制质量浓度为2mm的内标(2-乙基丁酸)的单标储备液；
混标储备液：分别移取228μl乙酸、298μl丙酸及366μl丁酸，以水定容至1ml，得到3种短链脂肪酸的混合储备液；
系列标准工作溶液：系列标准工作溶液：分别准确移取适量体积的3种短链脂肪酸的混标贮备液，分别加入100μl内标(2-乙基丁酸)的单标储备液，以超纯水稀释定容至1ml，加入40μlph＝7的磷酸盐缓冲液和280μl100mm五氟溴卞进行衍生90min，用正己烷提取后得到系列标准工作溶液。
(5)gc-ms分析结果
吸取配制好的系列标准工作液注入gc-ms，检测得到的色谱图，如图1所示，以标准系列峰面积与内标峰面积之比对其质量建立线性回归方程。采用加标方法对3种短链脂肪酸进行回收率实验，按照信噪比s/n≥3计算得到分析方法的检出限，低中高三个加标水平重复测定5次。
气相色谱条件为：hp-5毛细管柱，30m×0.25mm×0.25um；进样口温度：250℃；进样量1μl，分流比30:1；载气：氦气；程序升温：70℃保持3min，以10℃/min的速率升温至130℃，以30℃/min的速率升温至280℃，保持2min。
质谱条件为：离子源温度：230℃；传输线温度：290℃；电离方式：电子轰击源(ei)；电离能量：70ev；溶剂延迟：7min；采用选择离子模式(sim)扫描。详细参数如表1所示。
表13种短链脂肪酸和1种内标(2-氨基丁酸)的gc-ms参数
方法学评价的结果(如表2所示)表明，3种短链脂肪酸的线性关系良好(r2>0.99)，血清中5个加标水平的回收率在80.6％～104.8％之间，相对标准偏差(rsd)为0.9％～6.9％，淋巴组织中5个加标水平的回收率在82.0％～106.4％之间，相对标准偏差(rsd)为0.5％～5.3％，检出限为0.004μm～0.5μm。其中，添加水平为40μm、400μm和1000μm的短链脂肪酸色谱图分别为图3、图4和图5。
表23种短链脂肪酸的线性相关方程、相关系数、检出限、回收率
考察了外标法与内标法的回收率差异，其中内标法的步骤就是以上步骤，外标法的区别在于前处理过程中不加入2-乙基丁酸，其他过程和参数与内标法一致。外标法定量的结果为：对于添加浓度为40μm的平行样品之间rsd超过10％，且对于高浓度添加(1000μm)的回收率，外标法定量结果低于内标法定量结果，以淋巴组织的丙酸测定结果为例，外标法定量结果为72.29％-86.67％，而内标定量法结果为92.38％-94.36％。而其他物质采用外标法进行定量时，对于低浓度添加水平(40μm)无法进行准确定量，对于高浓度添加水平(1000μm)，得到的回收率远小于100％。
对于低浓度添加水平(40μm和400μm)的，内标的加入可以校正目标的损失，从而提高回收率。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
将淋巴组织进行预处理，得到淋巴提取液；
向血清或淋巴提取液中加入内标物，并加入五氟溴卞进行衍生化反应；
衍生后溶液经过萃取后，利用gc-ms对萃取液中的乙酸、丙酸和丁酸进行检测。
2.根据权利要求1所述的基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，其特征在于：所述血清的制备方法，包括如下步骤：将采集的全血静置设定时间后，低温离心，取上清液，即得血清。
3.根据权利要求1所述的基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，其特征在于：淋巴组织预处理的方法是向淋巴组织中加入预冷的超纯水，在低温下研磨均匀，然后涡旋、超声提取、离心，取上清液，即为淋巴提取液；
进一步的，研磨的温度为3-5℃，优选为4℃。
4.根据权利要求1所述的基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，其特征在于：所述内标物为2-乙基丁酸。
5.根据权利要求1所述的基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，其特征在于：所述衍生化反应的方法，包括如下步骤：
向加入内标物的提取液中加入中性缓冲液，然后加入五氟溴卞，混合均匀后，55-65℃水浴加热1-2h，即可；
进一步的，所述中性缓冲液为磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，其特征在于：所述衍生化反应还包括将反应结束后的反应体系置于冰上降温的步骤。
7.根据权利要求1所述的基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，其特征在于：所述萃取过程中使用的有机溶剂为正己烷。
8.根据权利要求1所述的基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，其特征在于：萃取的时间为1-3min。
9.根据权利要求1所述的基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，其特征在于：气相色谱条件为：hp-5毛细管柱，30m×0.25mm×0.25um；进样口温度：250℃；进样量1μl，分流比30:1；载气：氦气；程序升温：70℃保持3min，以10℃/min的速率升温至130℃，以30℃/min的速率升温至280℃，保持2min。
10.根据权利要求1所述的基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，其特征在于：质谱条件为：离子源温度：230℃；传输线温度：290℃；电离方式：电子轰击源；
电离能量：70ev；溶剂延迟：7min；采用选择离子模式扫描。
技术总结