本发明涉及兽医技术领域，具体涉及一种解析球虫子孢子表面蛋白指纹图谱的方法及球虫子孢子表面蛋白指纹图谱的应用。
背景技术：
原虫的抗原蛋白主要包括虫体细胞表面蛋白(包括发育阶段特异性差异蛋白)、入侵相关分泌蛋白、细胞骨架蛋白和生化代谢酶等。虫体表面蛋白是与宿主细胞相互作用的关键分子，直接是最早暴露于宿主免疫系统的抗原物质，最易为宿主模式识别受体所识别。恶性疟原虫、阴道鞭毛虫和布氏锥虫等表面蛋白谱的解析，研究表明表面蛋白不仅直接参与这些寄生原虫的入侵及寄生虫-宿主相互作用网络，也是极具应用前景的保护性抗原。解析球虫表面蛋白谱是筛选基于球虫表面蛋白的高效疫苗候选抗原分子的有效途径和关键步骤。可提取子孢子表面蛋白的方法，具体如鸡球虫子孢子表面蛋白谱的分析鉴定迄今尚未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种解析球虫子孢子表面蛋白指纹图谱的方法及球虫子孢子表面蛋白指纹图谱的应用。本发明采用生物素标记、膜蛋白提取以及链霉亲和素-琼脂糖亲和纯化三个步骤集成的方式获子孢子表面蛋白，结合质谱测序和基因组数据并对子孢子表面蛋白进行鉴定。
本发明提供了一种解析球虫子孢子表面蛋白指纹图谱的方法，包括以下步骤：
1)用冰pbs缓冲液清洗并悬浮子孢子，得到子孢子悬浮液；
2)将步骤1)得到的子孢子悬浮液与sulfo-nhs-ss-biotin混合，震荡孵育，用冰pbs缓冲液清洗，得到表面蛋白生物素化的子孢子；
3)将步骤2)得到的表面蛋白生物素化的子孢子悬浮于hanks氏溶液中，加入细胞裂解液，4℃裂解45～60min，4℃下10000g离心15min，得到上清液；所述细胞裂解液含质量体积分数为1％的tritonx-114、10mmol/lph值为7.4的tris·cl、150mmol/l的nacl、1mmol/l的edta和10μl/ml的100×蛋白酶抑制剂储存液体；所述100×蛋白酶抑制剂储存液体为包括终浓度均为10μg/ml的抗痛素、抑胃肽酶和亮抑蛋白酶肽的溶液；
4)将步骤3)得到的上清液在37℃保温3min，25℃下10000g离心1min，收集下层相，得到疏水相蛋白；
5)将步骤4)得到的疏水相蛋白加入经pbs缓冲液洗脱后的链霉亲和素-琼脂糖树脂凝胶过滤柱中，使用pbs缓冲液进行洗脱至洗脱液的吸光值在280nm处达到最低，采用6m盐酸胍溶液或煮沸的含质量百分含量为2％sds的0.4m尿素溶液进行洗脱，得到生物素标记的子孢子表面蛋白；
6)将步骤5)得到的生物素标记的子孢子表面蛋白进行lc-ms质谱测序，得到子孢子表面蛋白组数据，结合基因组数据进行生物信息学分析，得到球虫子孢子表面蛋白指纹图谱。
优选的是，步骤1)、步骤2)和步骤5)所述pbs缓冲液的ph值为8.0。
优选的是，步骤1)和步骤2)所述清洗的次数为3次。
优选的是，步骤2)中，每毫升子孢子悬浮液与80μl10mm的sulfo-nhs-ss-biotin溶液混合，所述sulfo-nhs-ss-biotin溶液的溶剂为pbs。
优选的是，步骤2)所述震荡孵育为4℃震荡孵育2h。
优选的是，步骤5)所述链霉亲和素-琼脂糖树脂凝胶过滤柱经5～10倍柱体积的pbs缓冲液洗脱。
优选的是，步骤5)所述盐酸胍溶液的ph值为1.5～2.0。
优选的是，步骤5)所述链霉亲和素-琼脂糖树脂为链霉亲和素-琼脂糖树脂6ff。
本发明还提供了上述技术方案所述方法制备得到的球虫子孢子表面蛋白指纹图谱在制备疫苗中的应用。
本发明提供了一种解析球虫子孢子表面蛋白指纹图谱的方法。本发明采用生物素标记试剂(sulfo-nhs-ss-biotin)标记子孢子，后用细胞裂解液裂解子孢子，并提取子孢子细胞膜蛋白，将获得蛋白利用neutravidinagaroseresin(链霉亲和素-琼脂糖)亲和纯化，后进行质谱鉴定分析，建立一种有效分离子孢子表面蛋白方法，并阐明子孢子表面蛋白谱组成，为筛选有效表面蛋白抗原，获得具有应用潜力的疫苗候选分子组合奠定基础。本发明所述方法能够解决球虫子孢子表面蛋白难以获得的缺陷。试验结果表明，本发明首次提取了球虫子孢子表面蛋白，首次解析了球虫子孢子表面蛋白指纹图谱，阐明e.tenella子孢子表面蛋白谱组成，为表达主要表面蛋白，评价各重组蛋白免疫效果，筛选有效表面蛋白抗原，获得具有应用潜力的疫苗候选分子组合奠定基础。
附图说明
图1为本发明提供的球虫子孢子表面蛋白指纹图谱解析流程图；
图2为本发明提供的子孢子表面蛋白质电泳图。
具体实施方式
本发明提供了一种解析球虫子孢子表面蛋白指纹图谱的方法，包括以下步骤：
1)用冰pbs缓冲液清洗并悬浮子孢子，得到子孢子悬浮液；
2)将步骤1)得到的子孢子悬浮液与sulfo-nhs-ss-biotin混合，震荡孵育，用冰pbs缓冲液清洗，得到表面蛋白生物素化的子孢子；
3)将步骤2)得到的表面蛋白生物素化的子孢子悬浮于hanks氏溶液中，加入细胞裂解液，4℃裂解45～60min，4℃下10000g离心15min，得到上清液；所述细胞裂解液含质量体积分数为1％的tritonx-114、10mmol/lph值为7.4的tris·cl、150mmol/l的nacl、1mmol/l的edta和10μl/ml的100×蛋白酶抑制剂储存液体；所述100×蛋白酶抑制剂储存液体为包括终浓度均为10μg/ml的抗痛素、抑胃肽酶和亮抑蛋白酶肽的溶液；
4)将步骤3)得到的上清液在37℃保温3min，25℃下10000g离心1min，收集下层相，得到疏水相蛋白；
5)将步骤4)得到的疏水相蛋白加入经pbs缓冲液洗脱后的链霉亲和素-琼脂糖树脂凝胶过滤柱中，使用pbs缓冲液进行洗脱至洗脱液的吸光值在280nm处达到最低，采用6m盐酸胍溶液或煮沸的含质量百分含量为2％sds的0.4m尿素溶液进行洗脱，得到生物素标记的子孢子表面蛋白；
6)将步骤5)得到的生物素标记的子孢子表面蛋白进行lc-ms质谱测序，得到子孢子表面蛋白组数据，结合基因组数据进行生物信息学分析，得到球虫子孢子表面蛋白指纹图谱。
用冰pbs缓冲液清洗并悬浮子孢子，得到子孢子悬浮液。在本发明中，所述冰pbs缓冲液的ph值优选为8.0，ph值为8.0的pbs能够洗涤细胞来去除的污染杂蛋白。在本发明中，所述清洗的次数优选为3次，以去除杂蛋白。本发明对所述子孢子的来源没有特殊限定，优选包括球虫子孢子，本发明对所述球虫子孢子的来源也没有特殊限定，本发明具体实施例中选择的是鸡来源的球虫子孢子，具体的，本发明优选从鸡中获得未孢子化卵囊，进行培养孢子化，得到子孢子。本发明对所述子孢子的具体培养和纯化方法没有特殊限定，采用常规培养和纯化方法即可。
得到子孢子悬浮液后，本发明将子孢子悬浮液与sulfo-nhs-ss-biotin混合，震荡孵育，用冰pbs缓冲液清洗，得到表面蛋白生物素化的子孢子。在本发明中，每毫升子孢子悬浮液优选与80μl10mm的sulfo-nhs-ss-biotin溶液混合，所述sulfo-nhs-ss-biotin溶液的溶剂为pbs。在本发明中，所述震荡孵育优选为4℃震荡孵育2h。在本发明中，所述震荡孵育优选为轻微震荡孵育。在本发明中，所述pbs缓冲液的ph值优选为8.0，更好的溶解sulfo-nhs-ss-biotin，保持其活性。在本发明中，所述清洗的次数优选为3次，以去除未反应的生物素试剂sulfo-nhs-ss-biotin。本发明对所述sulfo-nhs-ss-biotin的来源没有特殊限定，采用常规市售sulfo-nhs-ss-biotin即可，如购自赛默飞世尔科技公司，sulfo-nhs-ss-biotin可与细胞表面的膜蛋白中含有的伯氨的分子反应，形成稳定的氨酰键而将生物素引进该蛋白。
得到表面蛋白生物素化的子孢子后，本发明将表面蛋白生物素化的子孢子悬浮于hanks氏溶液中，加入细胞裂解液，4℃裂解45～60min，4℃下10000g离心15min，得到上清液；所述细胞裂解液含质量体积分数为1％的tritonx-114、10mmol/lph值为7.4的tris·cl、150mmol/l的nacl、1mmol/l的edta和10μl/ml的100×蛋白酶抑制剂储存液体；所述100×蛋白酶抑制剂储存液体为包括终浓度均为10μg/ml的抗痛素、抑胃肽酶和亮抑蛋白酶肽的溶液。本发明对所述hanks氏溶液的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的hanks氏溶液常规市售产品即可，如购自索莱宝，中国。本发明hanks氏溶液(1l)的制备方法优选为：
分别称取kcl0.40g、nacl8.00g、na2hpo4·h2o0.06g/na2hpo4·12h2o0.134g、kh2po40.06g、nahco30.35g溶于800ml灭菌去离子水中，调节ph值为7.2～7.4，定容至1000ml，无菌条件下，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用。
得到上清液后，本发明将上清液在37℃保温3min，25℃下10000g离心1min，收集下层相(去污剂相)，得到疏水蛋白。4℃时所有的蛋白质都溶解于含tritonx-114的水溶液(细胞裂解液)，在温度超过20℃时，此溶液为水相和去污相，此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中，利用此性质提取膜蛋白。本发明所述去污剂相即下层相蛋白为疏水性蛋白。
本发明将疏水相蛋白加入经pbs缓冲液洗脱后的链霉亲和素-琼脂糖树脂凝胶过滤柱中，使用pbs缓冲液进行洗脱至洗脱液的吸光值在280nm处达到最低(用pbs洗脱未与链霉亲和素-琼脂糖树脂6ff结合的生物素标记的蛋白。当280nm处的吸光度最低时候，表示生物素标记的蛋白与链霉亲和素-琼脂糖树脂6ff已充分结合)，6m盐酸胍溶液或煮沸的含质量百分含量为2％sds的0.4m尿素溶液进行洗脱，得到生物素标记的子孢子表面蛋白。在本发明中，所述链霉亲和素-琼脂糖树脂凝胶过滤柱优选经5～10倍柱体积的pbs缓冲液洗脱。在本发明中，所述盐酸胍溶液的ph值优选为1.5～2.0。在本发明中，所述盐酸胍溶液的溶剂优选为水，优选添加na2h2po4和tris-cl起到稳定的作用。具体组分为100mmna2h2po4，10mmtris-cl,6m盐酸胍，随后用naoh调节ph值至1.5～2.0。在本发明中，所述链霉亲和素-琼脂糖树脂优选为链霉亲和素-琼脂糖树脂6ff，本发明对其来源没有特殊限定，购自赛默飞世尔科技公司即可。如有必要立即透析或者对洗脱样品进行脱盐，以减少沉淀(由于快速ph变化导致)，或可以加入碱性缓冲液如1m的tris溶液，ph为9.0，来进行中和，最终得到子孢子表面蛋白。
生物素标记的子孢子表面蛋白后，本发明将生物素标记的子孢子表面蛋白进行lc-ms质谱测序，得到子孢子表面蛋白组数据，结合基因组数据进行生物信息学分析，得到球虫子孢子表面蛋白指纹图谱。本发明对所述lc-ms质谱操作的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的蛋白质质谱测序方法即可。本发明鉴定跨膜相关蛋白和分泌性蛋白来确定表面蛋白组成，优选采用toxodb(http://toxodb.org/toxo/)数据库来获得蛋白序列，signalp3.0软件预测信号肽有无；tmhmmserverv.2.0,http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/来预测跨膜结构域情况。
本发明还提供了上述技术方案所述方法制备得到的球虫子孢子表面蛋白指纹图谱在制备疫苗中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种解析球虫子孢子表面蛋白指纹图谱的方法及球虫子孢子表面蛋白指纹图谱的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
一实验方法(流程图如图1所示)：
1子孢子纯化：
雏鸡传代获e.tenella未孢子化卵囊，将分离的新鲜卵囊加入2.5％重铬酸钾溶液于28℃恒温培养箱中进行孢子化，当95％左右的卵囊斯氏体出现，即表明完成孢子化过程，洗涤并离心3次以完全去除重铬酸钾，4℃条件下，用5％的次氯酸钠溶液作用10min，再用灭菌水洗涤离心，即可得初步纯化的孢子化卵囊。在50ml圆底离心管中加入10ml的200mm的玻璃珠，随后将hanks氏液溶解的球虫孢子化卵囊加入，随后用手腕力量进行击打5min，随后在显微镜下观察，若观察出现95％以上的孢子化卵囊出现脱囊，即停止击打。用hanks氏液(ph7.2～7.4)配制0.25％的胰蛋白酶和0.75％的脱氧胆酸盐，随后在41℃温箱中孵育，将玻璃珠击打后的脱囊的球虫进行消化，消化时间1～2小时，检测是否释放出较多子孢子。随后将消化后的产物进行离心获得沉淀，将沉淀再用hanks氏液重悬，随后3500rpm，离心10min，洗涤去除胰蛋白酶和脱氧胆酸盐，洗涤3次，随后将获得的脱囊后的子孢子重新悬浮于hanks液中，以待提纯子孢子。
将g3砂芯漏斗与橡胶塞连接，在连接前采用凡士林预先润滑，随后将g3砂芯漏斗橡胶塞联合装置通过橡胶塞与具上嘴的过滤瓶连接，组成一个整体。用塑料管连接到具上嘴的过滤瓶，另一侧连接到真空泵中，真空泵压力为10mpa左右，先采用hanks氏液对g3砂芯漏斗进行清洗，随后加入子孢子悬液，进行抽滤，随后将抽滤获得的液体进行离心，获沉淀，沉淀中添加hanks氏液进行重悬，离心，获纯化子孢子。
2子孢子表面蛋白生物素化：
(1)用冰pbs缓冲液(ph8.0)洗涤细胞3次，以去除杂蛋白。
(2)用pbs缓冲液悬浮子孢子。
(3)在每毫升pbs缓冲液中加入80μl10mm的sulfo-nhs-ss-biotin。
(4)在4℃中轻微震荡孵育，孵育时间为2小时。
(5)用冰pbs(ph8.0)清洗子孢子3次，来去除未反应的生物素试剂。
3子孢子表面膜蛋白提取：
(1)采用0.5ml的hanks氏溶液悬浮将生物素化的子孢子，再加入细胞裂解液(1％(w/v)tritonx-114，10mmol/ltris·clph7.4，150mmol/lnacl，1mmol/ledta，10μl/ml100×蛋白酶抑制剂储存液体：抗痛素、抑胃肽酶、亮抑蛋白酶肽的终浓度均为10μg/ml)，4℃放置45～60min裂解细胞，将细胞裂解液置于微离心管中，10,000g，4℃离心15min。
(2)收集上清至另一个微离心管中，37℃保温3min。
(3)10000g室温(25℃)下离心1min，将下层的疏水相转移到另一微离心管中。
(4)在上述的实验的疏水相中加入100μl细胞裂解液提取，重复步骤2和3和4，移除在疏水相中的亲水蛋白残基，获得更纯的疏水性蛋白。获得的较低处的相为疏水性蛋白。
4neutravidinagaroseresin(链霉亲和素-琼脂糖)亲和层析纯化生物素化蛋白：
(1)将链霉亲和素-琼脂糖树脂6ff加入到凝胶过滤柱中，采用5-10倍柱体积的pbs进行洗脱，将上述步骤获得的疏水相蛋白加入柱床。
(2)采用pbs进行洗脱直至在280nm处的吸光度最低(由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征吸收峰。在此波长范围内，蛋白质的a280与其浓度呈正比关系。用pbs洗脱未与链霉亲和素-琼脂糖树脂6ff结合的生物素标记的蛋白。当280nm处的吸光度最低时候，表示生物素标记的蛋白与链霉亲和素-琼脂糖树脂6ff已充分结合)。
(3)采用6m盐酸胍溶液(ph值为1.5～2.0)或采用含煮沸的2％的sds的0.4m尿素溶液洗脱生物素标记蛋白。
(4)立即透析或者对洗脱样品进行脱盐，最终得到子孢子表面蛋白。
本发明将子孢子表面蛋白稀释5-10倍，进行sds-page电泳(见图2，子孢子表面蛋白质电泳图，最左边条带为marker，右边三个为不同批次提取的子孢子表面蛋白)。
5蛋白还原烷基化及酶解：
(1)蛋白定量后每个样品的各取20μg，采用5倍体积预冷丙酮进行沉淀，-20℃放置1h，充分沉淀蛋白，随后4℃，12,000rpm离心10min，取沉淀真空冷冻干燥。
(2)采用10μl的蛋白重悬液充分溶解蛋白沉淀，加入40μl蛋白还原溶液(含10mm二硫苏糖醇的50mm的碳酸氢铵溶液水溶液)，37℃反应1h。
(3)加入40μl蛋白烷基化溶液(含有50mm吲哚-3-乙酸的50mm的碳酸氢铵水溶液)，室温避光反应10min，将还原烷基化后的蛋白溶液加入10kda的离心超滤管，12,000rpm离心20min，弃掉收集管底部溶液。
(4)加入150μl的50mm的碳酸氢铵溶液，12,000rpm离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次，更换新收集管，在超滤管中加入100μl浓度为5ng/μl的测序级胰蛋白酶溶液，37℃反应12h。
(5)12,000rpm离心10min，收集酶解后肽段，在超滤管中再加入50μl50mm的碳酸氢铵水溶液，12,000rpm离心10min，收集管底溶液并与前次溶液合并冻干。
6质谱操作及数据库检索：
(1)将冻干的多肽样品重新溶解于nano-hplc缓冲液a(0.1％甲酸-水溶液)，采用nano-hplc液相系统easy-nlc1000进行分离。液相a液为0.1％甲酸-水溶液，高效色谱流动相b：0.1％甲酸-乙腈溶液，以100％的a液平衡色谱捕获柱，样本间用空白溶剂30min流动相梯度清洗一次。
(2)酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后用轨道肼质谱仪(ltqorbitrapvelospro)进行质谱分析。分析时长：105min，检测方式：正离子，喷雾电压：1.8kv，离子传输毛细管温度：250℃，使用前经标准校正液校正，母离子扫描范围：350-1800m/z，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下(ida，informationdependentanalysis)，每次全扫描(fullscan)后采集最强的15个碎片图谱(ms2scan)，碎裂方式：碰撞诱导解离(cid，collision-induceddissociation)，正态化能量35％，q值为0.25，活化时间：30ms，动态排除时间：30s。ms1在m/z400时分辨率为60,000，ms2在离子阱中为单位质量分辨。一级质谱采用profile模式采集，二级质谱采用centroid方式采集以降低数据文件大小。
(3)采用mascot2.3软件(matrixscience)进行数据处理，数据库采用艾美耳球虫数据库，酶为胰蛋白酶，允许最大漏切位点为2，固定修饰为脲甲基化(c)；可变修饰为：乙酰化(n-末端蛋白质)、去酰胺化(nq)、双氧化(w)和氧化(m)；msms容差为±0.15kda，蛋白得分c.i.％大于95％为鉴定成功。
二实验结果：得到鉴定出多个表面蛋白，其中包括典型的离子通道蛋白abc转运通道蛋白等。蛋白具体描述如表1：
表1表面蛋白鉴定结果
结果显示子孢子存在atp-柠檬酸合成酶、预测的阳离子转运atp酶、单链dna结合蛋白相关蛋白、spx结构域的假定蛋白、abc转运蛋白、假定的过氧化物酶体膜蛋白、磷酸二酯酶、含bt1跨膜结构域蛋白、假定含有ctr铜离子转运蛋白，假定胰蛋白酶、假定核糖体蛋白l7等。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种解析球虫子孢子表面蛋白指纹图谱的方法，包括以下步骤：
1)用冰pbs缓冲液清洗并悬浮子孢子，得到子孢子悬浮液；
2)将步骤1)得到的子孢子悬浮液与sulfo-nhs-ss-biotin混合，震荡孵育，用冰pbs缓冲液清洗，得到表面蛋白生物素化的子孢子；
3)将步骤2)得到的表面蛋白生物素化的子孢子悬浮于hanks氏溶液中，加入细胞裂解液，4℃裂解45～60min，4℃下10000g离心15min，得到上清液；所述细胞裂解液含质量体积分数为1％的tritonx-114、10mmol/lph值为7.4的tris·cl、150mmol/l的nacl、1mmol/l的edta和10μl/ml的100×蛋白酶抑制剂储存液体；所述100×蛋白酶抑制剂储存液体为包括终浓度均为10μg/ml的抗痛素、抑胃肽酶和亮抑蛋白酶肽的溶液；
4)将步骤3)得到的上清液在37℃保温3min，25℃下10000g离心1min，收集下层相，得到疏水相蛋白；
5)将步骤4)得到的疏水相蛋白加入经pbs缓冲液洗脱后的链霉亲和素-琼脂糖树脂凝胶过滤柱中，使用pbs缓冲液进行洗脱至洗脱液的吸光值在280nm处达到最低，采用6m盐酸胍溶液或煮沸的含质量百分含量为2％sds的0.4m尿素溶液进行洗脱，得到生物素标记的子孢子表面蛋白；
6)将步骤5)得到的生物素标记的子孢子表面蛋白进行lc-ms质谱测序，得到子孢子表面蛋白组数据，结合基因组数据进行生物信息学分析，得到球虫子孢子表面蛋白指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)、步骤2)和步骤5)所述pbs缓冲液的ph值为8.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)所述清洗的次数为3次。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，每毫升子孢子悬浮液与80μl10mm的sulfo-nhs-ss-biotin溶液混合，所述sulfo-nhs-ss-biotin溶液的溶剂为pbs。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述震荡孵育为4℃震荡孵育2h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述链霉亲和素-琼脂糖树脂凝胶过滤柱经5～10倍柱体积的pbs缓冲液洗脱。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述盐酸胍溶液的ph值为1.5～2.0。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述链霉亲和素-琼脂糖树脂为链霉亲和素-琼脂糖树脂6ff。
9.权利要求1～8任一项所述方法制备得到的球虫子孢子表面蛋白指纹图谱在制备疫苗中的应用。
技术总结