本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种检测含维生素d3的制剂中有关杂质的方法。
背景技术：
维生素d3是一类脂溶性维生素，能促进机体对钙的吸收。由于维生素d3对光、热不稳定，在空气中易氧化和光解成反式维生素d3、速甾醇等杂质，同时维生素d3制剂还可能含有工艺杂质前维生素d3，以及其他可能降解杂质光甾醇、异速甾醇等。现常将维生素d3纯品制备成维生素d3包合物，以避免维生素d3与空气接触而发生降解。因此，在实际样品杂质检测中，存在维生素d3包合物中的维生素d3及各杂质不容易被破坏，难以对其进行有效提取的问题，并且如碳酸钙维生素d3复方制剂等制剂中维生素d3含量较低，采用常规液相色谱难以检出其更微量的杂质。
在目前药品杂质分析中，一般采用外标法进行杂质研究及计算，因维生素d3的各杂质稳定性差，难获得，外标法操作可行性低。虽然目前关于碳酸钙维生素d3的复方制剂杂质检测有文献报告，但都限于杂质a、杂质e的研究，如现有专利cn109490435a公开的一种检测复方碳酸钙咀嚼片中维生素d3杂质的方法中，采用的系统适用性溶液的制备方法，无法获得杂质c，杂质b、杂质d，且现有技术都是使用面积归一法进行计算，无法经济、快速有效的测定含维生素d3的制剂中的各杂质。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种检测含维生素d3的制剂中有关杂质的方法，通过该方法能有效定位含维生素d3的制剂中杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e等已知杂质，能够经济、快速有效的测定含维生素d3的制剂中的各杂质。
本发明中的杂质a的化学结构如式(i)所示：
本发明中的杂质b的化学结构如式(ii)所示：
本发明中的杂质c的化学结构如式(iii)所示：
本发明中的杂质d的化学结构如式(ⅳ)所示：
本发明中的杂质e的化学结构如式(ⅴ)所示：
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种检测含维生素d3的制剂中有关杂质的方法，采用高效液相色谱法对含维生素d3的制剂中有关杂质进行分析检测，具体包括以下步骤：
(1)溶液配制：
(1.1)系统适用性溶液制备：称取维生素d3对照品并加入棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为维生素d3对照品贮备液；在维生素d3对照品贮备液加入酸性溶液，摇匀，通氮密塞，水浴加热，取出，迅速冷却，并补充挥发的正己烷，静置分层后取上清液，采用碱性溶液洗涤除去残留的酸后，取正己烷层置于1cm具塞石英吸收池中，置于主波长为254nm的紫外灯下，石英吸收池与水平面呈45°放置，距灯管5～6cm，照射，使溶液中维生素d3降解产生杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e；
(1.2)样品溶液制备：取含维生素d3的制剂配制成样品溶液；
(1.3)对照品溶液制备：取维生素d3对照品配制成对照品溶液；
(2)分别将系统适用性溶液、对照品溶液和样品溶液注入液相色谱仪，得到色谱图，并根据系统适用性溶液、对照品溶液和样品溶液的色谱图，经过计算得到样品溶液中有关杂质的含量，所述杂质包括杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e。
本发明所述杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e的紫外扫描图分别如图1-5所示。
目前杂质研究中，一般采用已知杂质外标法进行杂质研究及控制。维生素d3对光、热不稳定，在空气中易氧化和光解成反式维生素d3等杂质，因此，维生素d3杂质对照品需超低温保存，且价格昂贵，如在每次的杂质检测中均采用已知杂质外标法进行，其成本较高，且每次使用前需解冻，用完后需继续超低温保存，操作难度较大。
本发明通过验证获取各已知杂质相对于维生素d3的相对保留时间(杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e对维生素d3峰的相对保留时间分别约为0.58、1.59、0.69、0.87、1.11)，每次检测时，配制含有杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e的系统适用性溶液进行适用性测试和杂质的定位，样品溶液中各已知杂质根据同一系统采集得到的系统适用性溶液的相对保留时间进行杂质定位，并与对照品溶液进行比较，计算杂质含量。
本发明系统适用性溶液的制备过程中，采用维生素d3依次进行酸降解和热降解，再使用碱溶液洗涤后，在紫外灯下进行光照降解，使该系统性溶液含有少量由维生素d3降解产生的杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e，用于维生素d3样品溶液杂质定位，能更有效定位样品中各已知杂质。
与现有检测方法相比，本发明所采用的系统适用性溶液配制方法，可以获得杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e，本发明采用由维生素d3降解配制的系统适用性溶液替代杂质对照品进行杂质定位，只采用254nm进行光照降解，照射时间优选60min，能使各个降解杂质的量更均衡，能有效定位杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e。本方法专属性、重现性良好，能经济、快速有效的测定含维生素d3的制剂中的各杂质。
优选地，所述步骤(1.1)中，酸性溶液含有盐酸或磷酸。
优选地，所述步骤(1.1)中，紫外灯的照射波长为254nm。
优选地，所述步骤(1.1)中，碱性溶液含有碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化钠。
优选地，所述步骤(1.1)中，维生素d3降解顺序为先进行酸降解和热降解，再进行光照降解，使制备得到的系统性溶液含有适量杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e。
优选地，所述步骤(1.2)中，称取含维生素d3的制剂，加入乙醇、水和正己烷的混合溶液，机械振摇，提取，正己烷层杂质溶液采用氮气进行吹干后，再加入正己烷复溶，浓缩至5-50倍量，得到样品溶液。
优选地，所述步骤(1.3)中，取维生素d3对照品，精密称定，置棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，获得维生素d3浓度为1wt％的溶液，作为对照品溶液
优选地，液相色谱的色谱条件如下：
流动相：由正己烷和正戊醇组成的混合液，调节流动相比例使主峰保留时间为40min；
色谱柱：硅胶柱，型号250mm×4.6mm，5μm；
检测器：uv检测器；
检测波长：双波长模式，265nm和281nm；
柱温：30℃；
进样体积：100μl；
流速：2.0ml/min。
本发明样品溶液的如检出杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e及其他杂质峰，与维生素d3对照品溶液在峰面积对比，计算各杂质的限度。杂质a、c峰面积与维生素d3对照品溶液在265nm峰面积对比，杂质b、杂质d、杂质e峰面积与维生素d3对照品溶液在281nm峰面积对比。
杂质含量计算方法为：杂质％＝杂质峰面积/对照品峰面积*校正因子。校正因子可通过a、b、c、d、e杂质标准曲线的斜率与维生素d3的标准曲线斜率比值获得。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明采用维生素d3降解配制的系统适用性溶液替代杂质对照品进行杂质定位，能有效定位各已知杂质。本方法专属性、重现性良好，能经济、快速有效的测定含维生素d3的制剂中的各杂质。
附图说明
图1为杂质a紫外扫描图；
图2为杂质b紫外扫描图；
图3为杂质c紫外扫描图；
图4为杂质d紫外扫描图；
图5为杂质e紫外扫描图；
图6为混合对照品贮备液的液相色谱图；
图7为维生素d3溶液降解配制的系统适用性溶液的液相色谱图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
液相色谱的色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪；
流动相：由正己烷和正戊醇组成的混合液，且正己烷和正戊醇体积比为997:3，使主峰保留时间为40min；
色谱柱：硅胶柱，型号250mm×4.6mm，5μm；
检测器：uv检测器；
检测波长：双波长模式，265nm和281nm；
柱温：30℃；
进样体积：100μl；
流速：2.0ml/min；
运行时间：样品溶液记录色谱图至维生素d3峰保留时间的3倍。
系统适用性溶液制备
取维生素d3对照品10mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为维生素d3对照品贮备液；量取维生素d3对照品贮备液5ml，置于10ml棕色量瓶中，加入0.5mol/l的盐酸溶液2ml，摇匀，通氮后密塞，水浴加热，取出，迅速冷却，并补充挥发的正己烷；静置分层后取上清液适量，用0.5mol/l的碳酸钠溶液2ml洗涤除去残留的盐酸后，取正己烷层置于1cm具塞石英吸收池中，置于2只8w主波长为254nm的紫外灯下，石英吸收池斜放45°，距灯管5～6cm，照射使溶液中含有少量的由维生素d3降解产生的杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e，作为系统适用性溶液。
对照品溶液制备
取维生素d3对照品10mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，密量取该溶液5.0ml，置50ml棕色量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为维生素d3对照品贮备液；精密量取维生素d3对照品贮备液5.0ml置于100ml棕色量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
样品溶液制备
取碳酸钙维生素d3复方制剂样品20片，研细，全部转移至200ml棕色量瓶中，加3a乙醇(由95ml乙醇与5ml甲醇混合而成)25ml，再加水25ml，精密加入正己烷25.0ml，密塞，机械振摇20min后，将溶液置具塞离心管中，以3000rpm转速离心10min，取上清液15.0ml用氮气流吹干后，再加0.75ml的正己烷复溶作为样品溶液，置于微体积进样瓶内。
空白辅料溶液制备
取空白辅料(除去维生素d3粉外的其他原料与辅料处方比例混合物)约35g，置于一个200ml的棕色量瓶中，加3a乙醇(由95ml乙醇与5ml甲醇混合而成)25ml，再加水25ml，精密加正己烷25.0ml，密塞，机械振摇20min后，将溶液置具塞离心管中，以3000rpm转速离心10min，取上清液15.0ml用氮气流吹干后，再加0.75ml的正己烷复溶作为空白试剂溶液，置于微体积进样瓶内。
混合对照品贮备液制备
分别精密量取杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、维生素d3的对照品贮备液各10ml，置于同一个100ml量瓶，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液，该混合对照品贮备液杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e的含量均为2μg/ml。
结果分析：
将混合对照品贮备液注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积，如图6所示，杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e对维生素d3峰的相对保留时间分别约为0.58、1.59、0.69、0.87、1.11。
将系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积，如图7所示。杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e对维生素d3峰的相对保留时间分别约为0.58、1.59、0.69、0.87、1.11。可见，本发明由维生素d3降解配制的系统适用性溶液能有效定位各杂质，方法能有效检测复方碳酸钙d3制剂各杂质。
实施例2
取碳酸钙维生素d3复方制剂按以下方法进行高温、光照、酸、碱和氧化破坏性实验，用实施例1的色谱条件检查降解产物。
高温样品溶液配制
取碳酸钙维生素d3复方制剂样品20片，在60℃加热15h，研细，全部转移至200ml棕色量瓶中，加3a乙醇(由95ml乙醇与5ml甲醇混合而成)25ml，再加水25ml，精密加正己烷25.0ml，密塞，机械振摇20min后，将溶液置具塞离心管中，以3000rpm转速离心10min。取上清液15.0ml用氮气流吹干后，再加0.75ml的正己烷复溶作为样品溶液，置于微体积进样瓶内进样。
光降解样品溶液的配制
取碳酸钙维生素d3复方制剂样品20片，研细，全部转移至200ml棕色量瓶中，加3a乙醇(由95ml乙醇与5ml甲醇混合而成)25ml，再加水25ml，精密加正己烷25.0ml，密塞，机械振摇20min后，将溶液置具塞离心管中，以3000rpm转速离心10min。取上清液15.0ml的白炽灯下照射24h后，用氮气流吹干后，再加0.75ml的正己烷复溶作为样品溶液，置于微体积进样瓶内进样。
碱降解样品溶液的配制
取碳酸钙维生素d3复方制剂样品20片，研细，全部转移至200ml棕色量瓶中，加入0.5mol/l的氢氧化钠溶液5ml，再加水15ml，加3a乙醇(由95ml乙醇与5ml甲醇混合而成)25ml，60度水浴加热2h后取出放冷，加0.5mol/l盐酸溶液5ml中和，精密加正己烷25.0ml，密塞，机械振摇20min后，将溶液置具塞离心管中，以3000rpm转速离心10min，取上清液15.0m用氮气流吹干后，再加0.75ml的正己烷复溶作为样品溶液，置于微体积进样瓶内进样。
酸降解样品溶液的配制
取碳酸钙维生素d3复方制剂样品20片，研细，全部转移至200ml棕色量瓶中，加3a乙醇(由95ml乙醇与5ml甲醇混合而成)25ml，再加水25ml，加3a乙醇25ml，精密加正己烷25.0ml，密塞，机械振摇20min后，将溶液置具塞离心管中，以3000rpm转速离心10min。取上清液，加入0.5mol/l的盐酸溶液5ml，密塞，60度水浴加热2h后取出放冷，以3000rpm转速离心10min，取上清液用0.5mol/l碳酸钠溶液2ml洗涤除去残留的酸后，取上清液15.0ml，用氮气流吹干后，再加0.75ml的正己烷复溶作为样品溶液，置于微体积进样瓶内进样。
氧化样品溶液的配制
取碳酸钙维生素d3复方制剂样品20片，研细，全部转移至200ml棕色量瓶中，加入5％双氧水10ml，室温放置15h，再加水15ml，加3a乙醇(由95ml乙醇与5ml甲醇混合而成)25ml，精密加正己烷25.0ml，密塞，机械振摇20min后，将溶液置具塞离心管中，以3000rpm转速离心10min。取上清液15.0ml，用氮气流吹干后，再加0.75ml的正己烷复溶作为样品溶液，置于微体积进样瓶内进样。
结果分析
空白辅料溶液在各杂质对照品的出峰位置处没有干扰，进行酸、碱、氧化、高温、光照降解试验，各个条件下的杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、与相邻峰的分离度大于1.0，主峰(维生素d3)的峰纯度角大于纯度阈值，表明本发明方法能够使碳酸钙维生素d3复方制剂在酸、碱、氧化、高温、光照条件下降解的各杂质峰均可有效分离。
实施例3重复性试验
取碳酸钙维生素d3复方制剂6份，按照实施例1的方法分别配制系统适用性溶液、对照品溶液和样品溶液，分别将系统适用性溶液、对照品溶液和样品溶液注入液相色谱仪，按照实施例1提供的色谱条件进行测定，结果表明，6份样品的杂质a杂质结果的rsd％为3.2％，杂质b杂质结果的rsd％为3.7％，杂质c杂质结果的rsd％为0％，杂质d杂质结果的rsd％为5.7％，杂质e杂质结果的rsd％为0％，可见，本发明检测方法重复性好。
本发明的方法均可用于不含油性基质的维生素d3的大部分制剂产品的杂质检测，并不仅限用于碳酸钙维生素d3复方制剂中的杂质检测。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
1.一种检测含维生素d3的制剂中有关杂质的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法对含维生素d3的制剂中有关杂质进行分析检测，具体包括以下步骤：
(1)溶液配制：
(1.1)系统适用性溶液制备：称取维生素d3对照品并加入棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为维生素d3对照品贮备液；在维生素d3对照品贮备液加入酸性溶液，摇匀，通氮密塞，水浴加热，取出，迅速冷却，并补充挥发的正己烷，静置分层后取上清液，采用碱性溶液洗涤除去残留的酸后，取正己烷层置于1cm具塞石英吸收池中，置于主波长为254nm的紫外灯下，石英吸收池与水平面呈45°放置，距灯管5～6cm，照射，使溶液中维生素d3降解产生杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e；
(1.2)样品溶液制备：取含维生素d3的制剂配制成样品溶液；
(1.3)对照品溶液制备：取维生素d3对照品配制成对照品溶液；
(2)分别将系统适用性溶液、对照品溶液和样品溶液注入液相色谱仪，得到色谱图，并根据系统适用性溶液、对照品溶液和样品溶液的色谱图，经过计算得到样品溶液中有关杂质的含量，所述杂质包括杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和杂质e。
2.根据权利要求1所述的检测含维生素d3的制剂中有关杂质的方法，其特征在于，所述步骤(1.1)中，酸性溶液含有盐酸或磷酸。
3.根据权利要求1所述的检测含维生素d3的制剂中有关杂质的方法，其特征在于，所述步骤(1.1)中，碱性溶液含有碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化钠。
4.根据权利要求1所述的检测含维生素d3的制剂中有关杂质的方法，其特征在于，所述步骤(1.2)中，称取含维生素d3的制剂，加入乙醇、水和正己烷的混合溶液，机械振摇，提取，正己烷层杂质溶液采用氮气进行吹干后，再加入正己烷复溶，浓缩至5-50倍量，得到样品溶液。
5.根据权利要求1所述的检测含维生素d3的制剂中有关杂质的方法，其特征在于，所述步骤(1.3)中，取维生素d3对照品，精密称定，置棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，获得维生素d3浓度为1wt％的溶液，作为对照品溶液。
6.根据权利要求1所述的检测含维生素d3的制剂中有关杂质的方法，其特征在于，液相色谱的色谱条件如下：
流动相：由正己烷和正戊醇组成的混合液，调节流动相比例使主峰保留时间为40min；
色谱柱：硅胶柱，型号250mm×4.6mm，5μm；
检测器：uv检测器；
检测波长：双波长模式，265nm和281nm；
柱温：30℃；
进样体积：100μl；
流速：2.0ml/min。
技术总结