本发明涉及分析检测方法，尤其是液相色谱-串联质谱的检测方法，具体是一种测定水中n-二甲基亚硝胺的方法、试剂盒及应用。
背景技术：
：n-二甲基亚硝胺(n-nitrosodimethylamine，ndma)是一种小分子量(74.08g/mol)的强极性(logkow＝-0.57)化合物，易溶于水、醇类和二氯甲烷等极性溶剂。生活饮用水中的ndma主要来源于氯化(自由氯或氯胺)消毒。ndma具有极强的基因毒性，诱导产生肿瘤的部位主要在食管和肝脏，在膀胱、脑部和肺部也能产生肿瘤。国际癌症研究中心将的致癌性定为2a级别，因其致癌风险(95.71×10-6)要显著大于三卤甲烷(5.32×10-6)和卤乙酸(67.55×10-6)。目前我国现行生活饮用水卫生标准gb5749-2006中并未规定ndma的限量值，但在一些发达国家和地区已对其作出严格限制。世界卫生组织2008年在日本学者研究结果和加拿大饮用水指南基础上将ndma限量设置为100ng/l；澳大利亚政府在同年水循环指南中将ndma含量限制在10ng/l以下；加拿大在2010年饮用水质量指南中将ndma限量设置为40ng/l，而安大略省环境部则将最大容许浓度限制9ng/l以下。要实现对水样中ng/l浓度级别的ndma检测，则对分析体系有极高的要求。目前，ndma的检测主要包括gc法、hplc法、gc-ms/ms法和lc-ms/ms法等。虽然较多采用gc-ms/ms，而lc-ms/ms在分析强极性、热稳定性差物质时表现出独特的优越性，且仪器灵敏度更高、抗基质干扰能力更强。针对饮用水中ndma检测的预处理方法主要有：液液萃取、固相萃取、固相微萃取等。液液萃取主要使用二氯甲烷进行萃取，由于ndma极性较强、水中分配比高，导致该方法萃取效率低、有机试剂用量大，限制了其推广和应用。另一方面，固相萃取是目前富集水样中痕量ndma最常用的方法，常用固相吸附材料包括椰壳活性炭、中性活性炭等，方法稳定性好、富集倍数高，但针对大体积水样所需时间较长、吸附效率低。固相微萃取技术操作便捷、无需萃取溶剂，但同时受到萃取头材料类型、目标物性质等因素限制，导致结果稳定性较差，适用范围有限。本发明基于分散固相萃取原理，将椰壳活性炭粉末与水样混合，后以超声辅助分散萃取，结束后以负压快速抽滤、洗脱。相比于传统固相萃取法，可在保证检测灵敏度、结果可靠性的前提下大大缩短分析所需时间。技术实现要素：本发明采用超声辅助分散固相萃取，结束后以负压快速抽滤、洗脱，并且加入酸性离子液体，减少旋蒸过程中ndma的挥发损失。相比于传统固相萃取法，可在保证检测灵敏度、结果可靠性的前提下大大缩短分析所需时间。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种测定水中n-二甲基亚硝胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)固相萃取填料的预活化处理；(2)待检测水样加入硫代硫酸钠和同位素内标工作溶液，获得检测溶液；(3)将步骤(2)得到的待检测溶液与步骤(1)中的固相萃取填料混合进行超声分散萃取；(4)将步骤(3)中得到的悬浮混合溶液抽滤获得滤饼；(5)将步骤(4)得到的滤饼抽干后置入固相萃取柱中并进行洗脱，收集洗脱溶剂；(6)将上述步骤(5)中得到的洗脱液加入酸性离子液体并去除低沸点洗脱溶剂；(7)将步骤(6)得到的溶液定容后，采用超高效液相色谱-串联质谱法测定，得到水样中n-二甲基亚硝胺的含量。进一步，所述步骤(4)中抽滤的速度为25-100ml/min、抽滤的时间为5-20min。进一步，所述步骤(5)中采用的洗脱剂为低沸点极性非质子溶剂。进一步，所述步骤(5)中采用的洗脱剂为所述步骤(1)中固相萃取填料活化溶剂中的一种或多种组合。进一步，所述酸性离子液体为n-甲基咪唑硫酸氢盐、n-甲基咪唑盐酸盐、1-乙基-n-甲基咪唑硫酸氢盐和1-丁基-n-甲基咪唑硫酸氢盐。进一步，所述固相萃取填料为椰壳活性炭。进一步，所述椰壳活性炭与待测水样中n-二甲基亚硝胺的比例为1：10-9～10-3。液相条件为：采用waterst3色谱柱(柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm)，或相当者进行液相分离，柱温设置40℃，流速0.4ml/min，进样体积20μl，流动相a：0.1％甲酸水溶液(v/v)，流动相b：0.1％甲酸-乙腈(v/v)。液相梯度条件：2％-10％b(0.00min-5.00min)，10％-100％b(5.00min-5.10min)，100％-100％b(5.10min-6.10min)，100％-2％b(6.10min-6.15min)，2％-2％b(6.15min-8.50min)；质谱条件为：大气压化学电离源(atmosphericpressurechemicalionization，apci)，正离子多反应监测模式，毛细管电压3.0kv，离子源电压5500v，离子源温度400℃，脱溶剂气(高纯氮，>99％)流速750l/h，碰撞气(高纯氩，>99％)流速0.15ml/min。一种测定水中n-二甲基亚硝胺的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括2.0g/包的椰壳活性炭粉末；浓度0.5～200ng/ml、共7个浓度水平的n-二甲基亚硝胺标准系列溶液，每个浓度水平内含n-二甲基亚硝胺-d6浓度均为10.0ng/ml；1.0μg/ml的n-二甲基亚硝胺-d6标准工作溶液；二氯甲烷洗脱液；酸性离子液体；固相萃取空管及筛板。一种n-二甲基亚硝胺监测方法，用于水源水、出厂水、生活饮用水的检测。本发明的优点：一是大大缩短了样品预处理时间，文献方法采用固相萃取小柱(2g/6ml)，一般情况下只能以重力自然流速或真空泵以小于10ml/min的流速过柱，500ml水样需1小时左右才能完成富集处理，而采用本方法，富集处理可控制在15min以内。二是大大提高了吸附效率，本方法采用活性炭超声辅助分散，使活性炭与水中n-二甲基亚硝胺充分散开，增加接触面积与时间，避免了使用萃取小柱因快速通过而导致的接触时间短和吸附效率低的问题，文献报道的方法以小于10ml/min流速上柱的吸附效率约为80％，本方法在更短时间内可同样达到相当的回收率。三是减少了n-二甲基亚硝胺在样品处理过程中的损失，同时也大大提高了检测结果的准确度，降低了定量检出限，三个不同浓度添加水平的平均回收率在97.0％～100.8％，方法的精密度在0.6％～3.0％范围，检出限可达2.0ng/l。现有文献技术对于饮用水中n-二甲基亚硝胺的测定，主要采用gc-ms法测定，但lc-ms/ms在分析强极性、热稳定性差物质时表现出独特的优越性，且仪器灵敏度更高、抗基质干扰能力更强。由于gc-ms和lc-ms/ms进样溶液体系的差异，gc-ms的样品处理程序无法完全照搬用于lc-ms/ms法测定。gc-ms法在收集二氯甲烷洗脱液后可直接进样分析，但lc-ms/ms法需挥干二氯甲烷成分并用初始流动相复溶后方可进样分析。二氯甲烷洗脱液通常使用旋转蒸发进行浓缩，同时由于n-二甲基亚硝胺的沸点较低，减压蒸馏过程中不可避免地造成n-二甲基亚硝胺的损失，致使在实际的分析中造成回收率偏低，本发明采用加入水溶性的酸性离子液体n-甲基咪唑盐酸盐、1-乙基-n-甲基咪唑硫酸氢盐和1-丁基-n-甲基咪唑硫酸氢盐，使n-二甲基亚硝胺在溶液中与离子体结合，避免了减压蒸馏过程中n-二甲基亚硝胺的挥发损失，并用采用的是水溶性的离子液体，完全与液相色谱的流动相兼容，无需除去，可以直接用流动相溶解后进样分析，方便、简捷，容易操作。同时也避免了使用甲酸、乙酸等有机酸易挥发所造成的环境污染以及固定效果差的问题。四是研发了适合现场采样的快速试剂盒，用以针对n-二甲基亚硝胺低沸点、不易保存的特性。试剂盒内包括标准系列工作溶液，各类采样器具、耗材及硫代硫酸钠、活性炭粉末等，配合抽滤器、小型超声仪即可实现水样的现场采样、处理与保存，后续只需将预处理样液带回实验室浓缩即可检测，大大减少n-二甲基亚硝胺在采样及运输过程中的损失，提高结果的准确度。附图说明图1为预处理操作流程。图2为不同离子源对ndma离子化效率的影响。图3为不同预处理方法对ndma回收率的影响。图4为不同抽滤速度对ndma回收率的影响。图5为不同旋蒸温度对ndma回收率的影响。图6为方法空白(a)及6.0ng/l加标(b)多反应监测图谱。图7为本发明试剂盒的使用示意图。具体实施方式为了阐述本发明的技术方案和技术目的，下面具体实施方式对本发明做进一步介绍。试验条件的筛选液相色谱条件：主要针对分离柱填料种类进行优化，分别比较了behc18和hhst3等两种常用填料色谱柱。结果显示二者在ndma峰面积、保留效果、峰形等方面均无显著差异，但是在相同0.4ml/min流速条件下，t3柱柱压远远小于c18柱，考虑到仪器运行的稳定性和耐受程度，选择t3柱作为色谱柱。质谱检测条件：ndma本身分子量小，极性强，其离子化效率受离子源种类影响显著。本实验使用相同浓度(100.0ng/ml)的ndma标准溶液对apci源和esi源进行比较，主要通过响应强度(峰高)和定量离子信噪比对离子源适用性进行评估，结果如图2所示。从图中可以发现，ndma在esi源电离条件下响应强度(104级别)和噪声表现(信噪比仅为10.9)均远远不如apci源(分别为106级别、信噪比超过700)，因此apci源都比esi源更适合ndma的测定。对两种常用固相萃取柱进行比较，包括oasishlb柱(200mg，6ml)和椰壳活性炭柱(2g，6ml)。测试条件为以50ng/l加标水样通过固相萃取柱进行测试，两款固相萃取柱均采用说明书推荐淋洗洗脱条件。结果(如图3)显示hlb柱对ndma几乎没有吸附作用，这主要由于ndma本身极性太强导致；而椰壳活性炭柱回收率大于90％，证明椰壳活性炭比表面积大、孔隙结构发达、吸附性能强的特点非常适用于富集ndma。对超声辅助分散固相萃取方法进行优化，其中对结果最为关键的是悬浮液的抽滤速度，速度过快会导致水样中ndma与椰壳活性炭接触不充分；速度过慢又会增加实验所需时间，结果如图4所示。可以发现，当抽滤速度小于50ml/min时，回收率可维持在80％左右，但当抽滤速度达到100ml/min时，回收率下降至约为50％左右。而当速度超过250ml/min时，滤膜极易被穿孔且回收率几乎为零。最终，将抽滤速度设为50ml/min以兼顾实验速度和回收率。本实验对比了四种有机试剂对椰壳活性炭柱上ndma的洗脱效果，分别为二氯甲烷、氯仿、乙腈和甲醇。各溶剂洗脱条件均为5.0ml/次，共3次。结果显示，二氯甲烷洗脱后回收率达到100.8％±4.2％，氯仿为76.4％±1.0％，乙腈和甲醇均小于60％。同时，洗脱溶剂后续旋蒸所需时间也是衡量指标之一，其中二氯甲烷浓缩所需时间为5min左右，氯仿约为25min，而甲醇、乙腈均需30min以上。综上考虑，最终选择二氯甲烷作为洗脱溶液。旋蒸温度对于整个浓缩步骤回收率也具有重要影响，温度较高时可加快二氯甲烷蒸发速度，虽然可缩短浓缩时间但同时容易导致二氯甲烷沸腾并造成ndma挥发损失；温度较低虽然可减少ndma损失，但会延长旋蒸所需时间。本实验对比了20℃-45℃等六个不同温度(n＝3)，结果如图5所示。尽管45℃可以将旋蒸时间缩短至2min内，但ndma挥发损失较多，建议将旋蒸温度控制在20℃-25℃内(单个样品所需时间约为5-6min)。需要注意的是，在lc-apci-ms/ms体系中，对于洗脱时共存的水分无需去除，这部分水分在酸性离子液体作用下呈酸性条件，在旋蒸过程中对ndma可起到保护作用，减少其因挥发而引起的损失，此步骤同样对整个预处理操作回收率影响显著，与水相溶液兼容也是液质优于常规gc-ms/ms方法之处。根据上述筛选的条件，按如下进行样品前处理准确移取ndma及ndma-d6标准工作溶液，用纯水配制成0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、10.0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml、150.0ng/ml的标准系列(内含ndma-d6浓度均为10.0ng/ml)，随后称取2.0g椰壳活性炭粉末，依次使用二氯甲烷3ml×5次、甲醇3ml×3次、超纯水3ml×3次活化平衡。随后加入至待测水样中搅拌均匀，超声辅助分散萃取10min，期间5min时搅拌一次。待萃取结束后将悬浮液通过1.2μm水相微孔滤膜进行抽滤处理，速度控制在50ml/min(即抽滤总时间控制在10min左右)。抽滤结束后，继续抽取空气3min，随后回收填料至固相萃取柱中，以二氯甲烷3ml×4次进行洗脱，收集全部洗脱液后在20℃条件下进行旋转蒸发，期间注意控制旋蒸负压，避免有机相剧烈沸腾。至二氯甲烷全部蒸干后再继续旋蒸10s停止，振荡梨形烧瓶使其中水相充分润洗瓶壁，最后转移水溶液并使用超纯水定容至1.0ml，使用0.22μm水相微孔滤膜过滤于进样瓶中，待测定。采用waterst3色谱柱(柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm)，或相当者进行液相分离，柱温设置40℃，流速0.4ml/min，进样体积20μl，流动相a：0.1％甲酸水溶液(v/v)，流动相b：0.1％甲酸-乙腈(v/v)。液相梯度条件：2％-10％b(0.00min-5.00min)，10％-100％b(5.00min-5.10min)，100％-100％b(5.10min-6.10min)，100％-2％b(6.10min-6.15min)，2％-2％b(6.15min-8.50min)。质谱条件：大气压化学电离源(atmosphericpressurechemicalionization，apci)，正离子多反应监测模式，毛细管电压3.0kv，离子源电压5500v，离子源温度400℃，脱溶剂气(高纯氮，>99％)流速750l/h，碰撞气(高纯氩，>99％)流速0.15ml/min。ndma及其同位素内标ndma-d6质谱条件参考表1。表1ndma及ndma-d6多反应监测条件最终线性相关系数(r)大于0.9999。方法灵敏度试验结果如图6所示，其中方法空白信号信噪比控制在6.3左右，而6.0ng/l加标水样中ndma信噪比可达20左右。其中需要注意的是，方法空白中ndma主要怀疑来源于椰壳活性炭填料，另一方面，ndma后面的小峰为二氯甲烷中外源性干扰成分，目前实验条件下可实现基线分离，对定量结果不足以产生明显影响。方法准确度和精密度结果则是在在实际水样基质(生活饮用水和水源水)中进行，其中水样本底值和低、中、高三水平加标试验分别进行6次平行实验，精密度、准确度具体结果如表2-表3所示。可以发现，本方法在高低三水平加标试验中表现出来的准确度及精密度结果令人满意。表2生活饮用水中方法准确度和精密度试验结果表3水源水中方法准确度和精密度试验结果按照优化后的方法对实际水样进行检测，检测结果均减去方法空白本底值。本实验共采集水源水16份、出厂水样14份及末梢水18份(结果见表4)，其中仅三份水样检测值与方法本底值接近，其余所有水样均高于空白本底值。从中可以发现，仅有三份阴性样品均为水源水，说明原水在未经处理前可能不含ndma，这与自来水消毒流程也相符合。表4实际样品测定结果样品类型样品数量(份)检出个数(份)结果范围(ng/l)水源水1613 a-14.4出厂水1414 a-13.8末梢水1818 a-11.2a结果介于2.0ng/l与6.0ng/l之间，呈阳性。本方法检出限：当取样量为500ml时，亚硝基二甲胺的检出限为2.0ng/l，定量限为6.0ng/l。本方法使用椰壳活性炭粉末，采用超声辅助分散固相萃取对生活饮用水中ndma进行富集浓缩，后续经快速抽滤使用二氯甲烷洗脱。整个预处理过程操作简单，影响因素少，方法稳定性、灵敏度及结果准确度均令人满意。方法缺点：由于ndma在饮用水中含量极低，通常为ng/l级别，对浓缩倍数和仪器灵敏度均有较高要求。根据本方法研制单位方法学验证结果，最终确定本方法的相关技术指标。本方法适用于生活饮用水及水源水基质，当取样量为500ml时，n-二甲基亚硝胺的检出限为2.0ng/l，定量限为6.0ng/l。本方法工作线性范围通常为0.5-200.0ng/ml，方法准确度及精密度结果令人满意，在三个不同浓度水平条件下平均加标回收率为97.0％-98.8％(生活饮用水)、99.5％-100.8％(水源水)，rsd为0.6％-2.3％(生活饮用水)、0.6％-3.0％(水源水)。共采集样品48份(包括水源水16份、出厂水14份、末梢水18份)，检出浓度在6.0ng/l-14.4ng/l范围。后续，经多家检验机构开展相关实验验证结果表明，该分析方法适用性强、稳定可靠，灵敏度指标能够满足相关标准10ng/l以下限量要求，符合生活饮用水及其水源水中n-二甲基亚硝胺化合物的检测要求。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种测定水中n-二甲基亚硝胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)固相萃取填料的预活化处理；
(2)待检测水样加入硫代硫酸钠和同位素内标工作溶液，获得检测溶液；
(3)将步骤(2)得到的待检测溶液与步骤(1)中的固相萃取填料混合进行超声分散萃取；
(4)将步骤(3)中得到的混合悬浮溶液抽滤获得滤饼；
(5)将步骤(4)得到的滤饼抽干后置入固相萃取柱中并进行洗脱，收集洗脱溶剂；
(6)将上述步骤(5)中得到的洗脱液加入酸性离子液体并去除低沸点洗脱溶剂；
(7)将步骤(6)得到的溶液定容后，采用超高效液相色谱-串联质谱法测定，计算得到水样中n-二甲基亚硝胺的含量。
2.根据权利要求1所述的一种测定水中n-二甲基亚硝胺的方法，其特征在于，所述步骤(4)中抽滤的速度为25-100ml/min、抽滤的时间为5-20min。
3.根据权利要求1所述的一种测定水中n-二甲基亚硝胺的方法，其特征在于，所述步骤(5)中采用的洗脱剂为低沸点极性非质子溶剂。
4.根据权利要求1所述的一种测定水中n-二甲基亚硝胺的方法，其特征在于，所述步骤(5)中采用的洗脱剂为所述步骤(1)中固相萃取填料活化溶剂中的一种或多种组合。
5.根据权利要求1所述的一种测定水中n-二甲基亚硝胺的方法，其特征在于，所述酸性离子液体为n-甲基咪唑硫酸氢盐、n-甲基咪唑盐酸盐、1-乙基-n-甲基咪唑硫酸氢盐和1-丁基-n-甲基咪唑硫酸氢盐。
6.根据权利要求1所述的一种测定水中n-二甲基亚硝胺的方法，其特征在于，所述固相萃取填料为椰壳活性炭。
7.根据权利要求6所述的一种测定水中n-二甲基亚硝胺的方法，其特征在于，所述椰壳活性炭与待测水样中n-二甲基亚硝胺的比例为1：10-9～10-3。
8.根据权利要求1所述的一种测定水中n-二甲基亚硝胺的方法，其特征在于，液相条件为：采用waterst3色谱柱(柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm)，或相当者进行液相分离，柱温设置40℃，流速0.4ml/min，进样体积20μl，流动相a：0.1％甲酸水溶液(v/v)，流动相b：0.1％甲酸-乙腈(v/v)。液相梯度条件：2％-10％b(0.00min-5.00min)，10％-100％b(5.00min-5.10min)，100％-100％b(5.10min-6.10min)，100％-2％b(6.10min-6.15min)，2％-2％b(6.15min-8.50min)；
质谱条件为：大气压化学电离源(atmosphericpressurechemicalionization，apci)，正离子多反应监测模式，毛细管电压3.0kv，离子源电压5500v，离子源温度400℃，脱溶剂气(高纯氮，>99％)流速750l/h，碰撞气(高纯氮，>99％)流速0.15ml/min。
9.一种测定水中n-二甲基亚硝胺的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括2.0g/包的椰壳活性炭粉末；浓度0.5～200ng/ml、若干的n-二甲基亚硝胺标准系列溶液，每个浓度水平内含n-二甲基亚硝胺-d6浓度均为10.0ng/ml；1.0μg/ml的n-二甲基亚硝胺-d6标准工作溶液；若干固定体积二氯甲烷洗脱液；酸性离子液体；固相萃取空管及筛板。
10.一种如权利要求1-8所述的n-二甲基亚硝胺监测方法，其特征在于：适用于水源水、出厂水和生活饮用水的检测。
技术总结本发明公开一种测定水中N‑二甲基亚硝胺的方法，本发明基于分散固相萃取原理，将椰壳活性炭粉末与水样混合，后以超声辅助进行分散完成萃取，结束后以负压快速抽滤、洗脱。随后在旋蒸时加入酸性离子液体，可减少旋蒸过程中N‑二甲基亚硝胺的挥发和损失。相比于传统固相萃取法，在保证检测灵敏度和结果可靠性的前提下大大缩短分析所需时间。同时本发明还提供了相应的现场采样试剂盒，配合抽滤器、小型超声仪即可实现水样的现场采样、处理与保存，后续只需将预处理样液带回实验室浓缩即可检测。
技术研发人员：金米聪;周健;陈晓红
受保护的技术使用者：宁波市疾病预防控制中心
技术研发日：2020.02.03
技术公布日：2020.06.05
