一种检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法及应用与流程

本发明属于重组蛋白检测
技术领域：
，涉及一种检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法及应用。
背景技术：
：目前，蛋白类药物大多是采用哺乳动物细胞表达系统进行生产，在产品的生产、储存、运输等过程中，往往会发生产品的聚集、降解及各种翻译后修饰，从而导致产品的变体产生。等电点改变和空间电荷分布差异所导致的异质性为电荷异质性，主要包括c-末端赖氨酸截除、n-谷氨酰胺环化、n-糖基化、氧化、聚体、天冬氨酸脱氨基和异构化、二硫键错配等。基于对蛋白分子中已知位点的可变性计算，可能存在多达2.58亿种可能的变体，因此产生了一系列潜在的产品质量属性。ich出台的指导原则中q6b部分根据变体对产品安全性、有效性的影响程度，将其分为产品相关物质及产品相关杂质，需要关于变体影响和安全性的关键质量属性(cqa)评估。分离这些变异对于评估生物物理和生物化学特性，如体外(效力、结合)和体内(毒性、药代动力学、免疫原性)活性至关重要。ief依据重组蛋白不同电荷变异体的pi特征将其分离，只能定性判定，而且需要对样品变性增溶。icief作为重组蛋白电荷变异体测定法，在ief的基础上连接检测器，实现了定量分析，检测时间较短，并且克服了ce迁移时间和峰面积重现性差的缺点。但电荷异质性同时表现为电荷量和表面电荷分布不同。当多个变体的pi值相同，但蛋白表面电荷分布不同时，iec可根据电荷分布的不同，在非变性的条件下分离多种电荷变体，进行定量分析。公开号cn106770597a公开了一种用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的cze检测方法。该方法采用毛细管区带电泳技术，此种方案利用毛细管作为样品检测载体，易因毛细管长度造成迁移时间和峰面积重现性差；cze的分离依据蛋白的荷质比，对于分子量相近的电荷异质体分离帮助不大，且不能分离电荷分布的不同的电荷异质体；此外，cze需要用尿素作为样品的增溶试剂，该试剂可能导致样品变性。公开号cn109946410a公开了一种分析单克隆抗体电荷异质性的离子交换色谱检测方法。该方法采用离子交换色谱技术，此种方案通过高盐洗脱-离子交换色谱法对待测蛋白进行分析，基于所述色谱图，完成对单克隆抗体电荷变异体的含量检测，实现目的单克隆抗体、酸性异构体和碱性异构体等各组分的有效分离。然而，此种方法不适合重组人白介素-12等糖基化较高且结构复杂的酸性重组蛋白，重组人白介素-12的电荷异质性更为复杂，因其等电点范围较宽且各组分等电点较接近，盐离子对待测物各组分的洗脱时间无明显差别，无法用传统的高盐洗脱-离子交换色谱法实现其电荷异构体的分离。重组人白介素-12属于一种酸性糖蛋白，pi4.5-5.5，糖基化方式不同导致等电点范围较宽，电荷变异体较多且含量相近，通过盐离子浓度变化的iec不能使其众多的电荷变异体得到有效分离。技术实现要素：基于现有技术所存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法；本发明的目的还在于提供所述检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法在重组人白介素-12蛋白生产质量控制中的应用。本发明的目的通过以下技术手段得以实现：一方面，本发明提供一种检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法，其包括如下步骤：通过ph-iec离子交换色谱法对待测重组人白介素-12蛋白进行分析获得色谱图，基于所述色谱图，确定所述待测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的含量；所述ph-iec离子交换色谱法所采用的流动相包括枸橼酸和磷酸钠盐的混合溶液；通过不同混合比例构成流动相a和流动相b；其中，所述流动相a的ph值为5.5～10.0，优选为8.0；所述流动相b的ph值为2.2～4.5，优选为4.0。ph-iec离子交换色谱法的具体分离原理是：ph梯度可以改变检测物质电荷、偏离等电点的程度，从而影响带正/负电荷的分子或离子与色谱柱固定相的结合能力，洗脱时的难易程度发生改变，从而改变了分离的选择性，最终实现各组分分离。重组白介素-12蛋白为酸性蛋白，其pi为4.5～5.5，电荷变体较多，且pi相差较小，在4.5-5.5的pi范围内存在10个电荷变体，糖基化修饰程度较高，结构复杂，对盐离子洗脱较为敏感。本发明ph-iec离子交换色谱法在一定程度上解决了因多种复杂的电荷变体间pi相差较小而对盐浓度非常敏感，致使传统的高盐洗脱-离子交换色谱法和盐浓度介导的ph梯度法无法实现重组人白介素-12等糖基化较高且结构复杂的酸性重组蛋白电荷异构体的分离的技术问题，具有快速、准确、灵敏地检测效果，尤其适用于重组人白介素-12蛋白中电荷变异体的检测。上述的方法中，优选地，所述枸橼酸的浓度为5～50mmol/l，优选为20mmol/l；所述磷酸钠盐的浓度为5～50mmol/l，优选为20mmol/l。上述的方法中，优选地，所述ph-iec离子交换色谱法采用的色谱柱包括阴离子交换色谱柱。上述的方法中，优选地，所述色谱柱包括强阴离子交换色谱柱sax。上述的方法中，优选地，所述ph-iec离子交换色谱法的洗脱时间为25～70min，优选为48min。上述的方法中，优选地，所述ph-iec离子交换色谱法的上样量为10-50μl，流速0.5-1.5ml/min，柱温20-60℃，检测波长280nm；该方法所采用的洗脱程序如下：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)00.00604048.00010056.00010056.10604070.006040。洗脱程序中，开始运行后0分钟60％a：40％b，开始运行后48分钟100％b，48分钟内b相比例匀速增加。48min后改为平衡色谱柱，使ab相比例回到初始水平。另一方面，本发明还提供上述检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法在重组人白介素-12蛋白生产质量控制中的应用。上述的应用中，优选地，检测的重组人白介素-12蛋白中电荷变异体谱图与该重组人白介素-12蛋白的理化对照品谱图一致时，所得重组人白介素-12蛋白生物制品的活性不受影响或影响处于安全水平，可以生产放行；检测的重组人白介素-12蛋白中电荷变异体谱图与该重组人白介素-12蛋白的理化对照品谱图不一致时，所得重组人白介素-12蛋白生物制品的活性受到影响或影响处于不安全水平，则生产该生物制品的工艺过程需要调整和改进，直到生产出的生物制品的电荷变异体处于安全水平，才可放行。上述的“一致”是指液相谱图保留时间相同，峰数量相同；“不一致”是指液相谱图保留时间不同，峰数量不同。另一方面，本发明还提供上述检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法在检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体中的应用。本发明ph-iec离子交换色谱法能够适用于糖基化较高且结构复杂的酸性重组人白介素-12蛋白的电荷变异体分析，解决了因试剂或前处理导致样品变性和用传统的高盐洗脱-离子交换色谱法无法实现电荷异构体的分离等问题，可用于重组人白介素-12蛋白的质量控制领域，确保药物生产的批间一致性，监控临床用药的安全性与有效性。附图说明图1为本发明实施例1中ph-iec离子交换色谱法检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的色谱图；图2为本发明实施例2条件1中tris钠盐-iec离子交换色谱法检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的色谱图；图3为本发明实施例2条件2中mes钠盐-iec离子交换色谱法检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的色谱图；图4为本发明实施例3中cief法检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的色谱图；图5为本发明实施例4中ph-iec离子交换色谱法(波长214nm)检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的色谱图；图6为本发明实施例5中ph-iec离子交换色谱法(wax色谱柱)检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的色谱图；图7为本发明实施例6中ph-iec离子交换色谱法(流动相ph值范围不同)检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的色谱图；图8为本发明实施例7条件1中ph-iec离子交换色谱法(线性梯度洗脱24min)检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的色谱图；图9为本发明实施例7条件2中ph-iec离子交换色谱法(线性梯度洗脱48min)检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的色谱图；图10为本发明实施例7条件3中ph-iec离子交换色谱法(线性梯度洗脱72min)检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的色谱图；图11为本发明实施例7条件2中ph-iec离子交换色谱法(线性梯度洗脱48min)检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的积分色谱图；图12为本发明实施例7条件2中ph-iec离子交换色谱法(线性阶式梯度洗脱48min)检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的色谱图；图13为本发明实施例8中ph-iec离子交换色谱法(进样量不同)检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的色谱图；图14为本发明实施例9中相同ph-iec离子交换色谱法(不同批次)检测重组人白介素-12蛋白电荷异质性的色谱图。具体实施方式为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。相关名称术语解释：ich：国际协调会议(internationalcouncilforharmonization)，根据协调会议的内容，中文通常译为“人用药品注册技术要求国际协调会议”。pi：等电点(isoelectricpoint)，一个分子或者表面不带电荷时的ph值。ief：等电聚焦电泳(isoelectricfocusing)是一种电泳方法，即利用一种特殊的缓冲液在凝胶内制造一个ph梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点的ph处，形成一个很窄的区带。ce：毛细管电泳(capillaryelectrophoresis)，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。icief：全柱成像毛细管等电聚焦电泳(full-columnimagingcapillaryisoelectricfocusingelectrophoresis)，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的微分离技术，在蛋白分离后没有移动过程，是表征蛋白质电荷不均一性的工具。cze：毛细管区带电泳(capillaryzoneelectrophoresis)，通过离子的带电量和大小来分离物质。ice：离子交换色谱法(ionexchangechromatography)，是高效液相色谱的一种，是分析阴离子和阳离子的一种液相色谱方法。ph-iec离子交换色谱法(phgradientionexchangechromatography)，ph梯度离子交换色谱法。wax：弱阴离子交换色谱柱(weekanionexchange)。sax：强阴离子交换色谱柱(stronganionexchange)。以下实施例中，所采用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。主要仪器、待测样品及实验材料如下表1～表3所示。表1：仪器设备型号设备编码ph计ohaus3100/fgdzc-sy-yq-0059抽滤泵津腾gm-0.33agdzc-sy-sb-0192超声仪kq-700degdzc-sy-yq-0040高效液相色谱仪agilent1260gdzc-sy-yq-0003注：使用的主要仪器及设备信息为：(要求：实验用仪器应经过检定在有效期内且合格)表2：表3：名称规格批号生产厂家sax-10液相色谱柱4×250mm054997thermowax-10液相色谱柱4×250mm054999thermo枸橼酸500gf20050005尔康制药磷酸氢二钠500g145746fisherscientific实施例1：本实施提供一种利用ph-iec离子交换色谱法检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法，具体如下：色谱条件如下表4所示：表4：条件内容名称/指标液相色谱仪agilent1260检测器/波长dad/280nm色谱柱propacsax-10(4*250mm)流速1ml/min上样浓度0.5mg/ml进样量10μl柱温25℃采集时间为96min，洗脱时间为60min。洗脱程序如下表5所示：表5：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)00.00100008.00100068.00010076.00010076.10100096.001000流动相a：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph8.0流动相b：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph4.0所得色谱图如图1所示。结果显示，重组人白介素-12蛋白样品的糖基化结构非常多，采用本发明ph-iec离子交换色谱法可检测出多个峰信号。实施例2：本对比例采用高盐-iec离子交换色谱法检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法，具体如下：色谱条件同实施例1。条件1：采集时间为96min，洗脱时间为60min。洗脱程序如下表6所示：表6：流动相a：10mmtris-hcl，ph8.0；流动相b：10mmtris-hcl 1mnacl，ph8.0。所得色谱图如图2所示，采用tris钠盐作为流动相的离子交换色谱法无法分离各电荷变体。条件2：采集时间为96min，洗脱时间为60min。洗脱程序如下表7所示：表7：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)00.00100008.00100068.00010076.00010076.10100096.001000流动相a：20mmmes，ph8.0；流动相b：20mmmes 1mnacl，ph8.0。所得色谱图如图3所示，采用mes钠盐作为流动相的离子交换色谱法无法分离各电荷变体。由本对比例图2和图3结果显示，重组人白介素-12蛋白样品多种复杂的电荷变体间pi相差较小，传统的盐浓度梯度分离方法无法将其分别洗脱。实施例3：本对比例采用毛细管电泳法检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法，具体如下：采用全柱成像毛细管电泳cief电荷变异体测定法对重组人白介素-12蛋白样品进行测定。样品：10μlsample mastermix，分别使用9.5、7.0、4.1的pimarker。分离毛细管：中性涂层毛细管，总长30cm，有效长度20cm。所得图谱如图4所示，结果显示，本重组蛋白样品糖基化结构非常多，没有明显主峰且重复性较差。实施例4：本对比例通过更换色谱测量波长为214nm，对重组人白介素-12蛋白电荷变异体进行检测分析。具体如下：色谱条件除波长不同外，其它同实施例1。采集时间为96min，洗脱时间为60min。洗脱程序如下表8所示：表8：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)00.00100008.00100068.00010076.00010076.10100096.001000流动相a：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph8.0流动相b：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph4.0所得色谱图如图5所示。结果显示，波长214nm色谱图显示不能检测出目的峰信号，由此能够证明，采用本发明波长280nm能够获得最佳的信号值。实施例5：本对比例通过更换色谱柱为弱阴离子交换色谱柱wax-10，对重组人白介素-12蛋白电荷变异体进行检测分析。具体如下：色谱条件除色谱柱不同外，其它同实施例1。采集时间为96min，洗脱时间为60min。洗脱程序如下表9所示：表9：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)00.00100008.00100068.00010076.00010076.10100096.001000流动相a：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph8.0流动相b：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph4.0所得色谱图如图6所示。结果显示，弱阴离子交换色谱柱wax-10分析蛋白电荷变异体，各电荷异构体变异体峰不能与主峰实现良好分离，未达到预期效果，影响质控分析，因此不宜采用。实施例6：本对比例通过更换流动相ph值范围，对重组人白介素-12蛋白电荷变异体进行检测分析。具体如下：色谱条件同实施例1。条件1：流动相b起始比例为0％(ph梯度为8.0至4.0)。采集时间为78min，洗脱时间为60min。洗脱程序如下表10所示：表10：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)00.00100060.00010068.00010068.10100078.001000流动相a：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph8.0流动相b：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph4.0条件2：流动相b起始比例为20％(ph梯度为7.2至4.0)。采集时间为66min，洗脱时间为48min。洗脱程序如下表11所示：表11：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)00.00802048.00010056.00010056.1080066.00800流动相a：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph8.0流动相b：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph4.0条件3：流动相b起始比例为40％(ph梯度为6.4至4.0)。采集时间为54min，洗脱时间为36min。洗脱程序如下表12所示：表12：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)00.00604036.00010044.00010044.10604054.006040所得色谱图如图7所示。结果显示，分离效果保持不变，流动相b起始比例0％、20％时出峰时间晚，检测时间长；流动相b起始比例40％时保留时间最合适，符合预期，用时最短。流动相b起始比例40％时检出的电荷变体个数与0％条件相同，说明只有程序ph梯度涵盖重组蛋白的等电点范围时(本样品pi为4.5～5.5)才能将其各电荷变体从色谱柱上洗脱下来。因此本发明检测方法可分离pi介于3～9之间的蛋白样本，不受蛋白的酸碱性限制。实施例7：本对比例通过更换洗脱时间，对重组人白介素-12蛋白电荷变异体进行检测分析。具体如下：色谱条件同实施例1。条件1：采集时间为46min，洗脱时间为24min。洗脱程序如下表13所示：表13：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)00.00604024.00010032.00010032.10604046.006040流动相a：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph8.0流动相b：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph4.0条件2：采集时间为70min，洗脱时间为48min。洗脱程序如下表14所示：表14：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)00.00604048.00010056.00010056.10604070.006040流动相a：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph8.0流动相b：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph4.0条件3：采集时间为94min，洗脱时间为72min。洗脱程序如下表15所示：表15：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)00.00604072.00010080.00010080.10604094.006040条件4：采集时间为54min，洗脱时间为40min。洗脱程序如下表16所示：表16：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)00.00604019.4027.672.421.4027.672.425.5024.575.527.5024.575.540.000.0100.040.10604054.006040流动相a：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph8.0流动相b：20mm枸橼酸 20mm磷酸氢二钠，ph4.0所得色谱图如图8～12所示。结果显示，洗脱时间为24min时分离度较低(图8)；洗脱时间为72min时检测的信号峰较弱(图10)；洗脱时间为48min时分离度最高，检测的峰数量最多，获得了理想的分离效果(图9)，在此条件下可分离目标蛋白10个变异体且含量相近，没有明显主峰(图11)。发明人尝试在出峰处延长洗脱时间已得到更好的分离度，结果显示，阶式梯度洗脱方式未能得到更好的分离效果，且可分离变异体减少(图12)。因此该方法效果受洗脱时间和洗脱梯度的影响较大，阶式梯度洗脱方式不能达到更好的效果。洗脱时间可为25～70min线性梯度洗脱，超过70min信号峰较弱，不能将全部电荷变体检测出来。最优洗脱时间为48min。实施例8：本对比例通过更换进样量(10μl、20μl、40μl)，对重组人白介素-12蛋白电荷变异体进行检测分析。具体如下：色谱条件除进样量不同外，其它同实施例1。洗脱程序同实施例7条件2。所得色谱图如图13所示。结果显示，不同进样量的分离度不变，保留时间的重现性较好，方法稳定可靠，可实现。受色谱柱性能限制，避免浓度过高聚沉造成假峰，进样量不大于50μl。实施例9：批间一致性测试检测方法同实施例7条件2，分别针对chh201804002、chh201804003、chh201805004相同工艺3批重组人白介素-12原液的电荷变异体进行分析，所得色谱图如图14所示。用pbs调整3批次原液至相同浓度，进样量10μg，批间一致性良好，可检测出单克隆抗体各组分的百分含量(表17)，获得了理想的分析效果。表17：由表17实验数据可以看出：批间一致性良好，获得了理想的分析效果。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页1 2 3 
技术特征：

1.一种检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法，其包括如下步骤：

通过ph-iec离子交换色谱法对待测蛋白进行分析获得色谱图，基于所述色谱图，确定所述待测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的含量；

所述ph-iec离子交换色谱法所采用的流动相包括枸橼酸和磷酸钠盐的混合溶液；通过不同混合比例构成流动相a和流动相b；

其中，所述流动相a的ph值为5.5～10.0，优选为8.0；所述流动相b的ph值为2.2～4.5，优选为4.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述枸橼酸的浓度为5～50mmol/l，优选为20mmol/l。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述磷酸钠盐的浓度为5～50mmol/l，优选为20mmol/l。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ph-iec离子交换色谱法采用的色谱柱包括阴离子交换色谱柱；优选地，所述色谱柱包括强阴离子交换色谱柱sax。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ph-iec离子交换色谱法的洗脱时间为25～70min，优选为48min。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ph-iec离子交换色谱法的上样量为10-50μl，流速0.5-1.5ml/min，柱温20-60℃，检测波长280nm。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法所采用的洗脱程序如下：

时间(min)流动相a(％)流动相b(％)00.00604048.00010056.00010056.10604070.006040

。

8.权利要求1～7任一项所述检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法在重组人白介素-12蛋白电荷变异体生产质量控制中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，检测的重组人白介素-12蛋白电荷变异体中电荷变异体谱图与该重组人白介素-12蛋白电荷变异体的理化对照品谱图一致时，所得重组人白介素-12蛋白电荷变异体生物制品的活性不受影响或影响处于安全水平，可以生产放行；检测的重组人白介素-12蛋白电荷变异体中电荷变异体谱图与该重组人白介素-12蛋白电荷变异体的理化对照品谱图不一致时，所得重组人白介素-12蛋白电荷变异体生物制品的活性受到影响或影响处于不安全水平，则生产该生物制品的工艺过程需要调整和改进，直到生产出的生物制品的电荷变异体处于安全水平，才可放行。

10.权利要求1所述检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法在检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体中的应用。

技术总结
本发明提供了一种检测重组人白介素‑12蛋白电荷变异体的方法及应用。该方法通过pH‑IEC离子交换色谱法对待测蛋白进行分析获得色谱图，基于所述色谱图，确定待测重组人白介素‑12蛋白电荷变异体的含量；pH‑IEC离子交换色谱法所采用的流动相包括枸橼酸和磷酸钠盐的混合溶液；通过不同混合比例构成流动相A和流动相B。本发明pH‑IEC离子交换色谱法能够适用于糖基化较高且结构复杂的重组人白介素‑12蛋白的电荷变异体分析，解决了因试剂或前处理导致样品变性和用传统的高盐洗脱‑离子交换色谱法无法实现电荷异构体的分离等问题，可用于该类药物的质量控制领域，确保药物生产的批间一致性，监控临床用药的安全性与有效性。

技术研发人员：魏文;王瑞玲;刘忠凯;王彦娜
受保护的技术使用者：康立泰药业有限公司
技术研发日：2020.02.05
技术公布日：2020.06.05