本发明属于医药化学领域，具体涉及一种一种板蓝根或其制品的质量分析方法，更具体地，涉及以单体成分caulilexinc作为质控指标，通过各种色谱方法对板蓝根药材、饮片、提取物及其单方或复方制剂进行定性定量分析的方法。
背景技术：
板蓝根为十字花科植物菘蓝isatisindigoticafort.的干燥根，是一种历史悠久的传统中药，具有清热解毒、凉血、利咽等功效。自1977年以来，板蓝根在历版《中国药典》中均有收载，不仅以饮片形式在中医方剂中入药，也是多种中成药的工业原料。板蓝根作为清热解毒的代表性中药在临床上应用非常广泛，常用于温病发热、发斑、喉痹、丹毒、痈肿、腮腺炎、乙型脑炎、急慢性肝炎，特别是病毒性呼吸道疾病如感冒、流感的治疗；在抗击sars和禽流感疫情中，板蓝根制剂也发挥了重要作用，成为居家常备药物。
板蓝根化学成分极其复杂。过去数十年来，许多学者致力于板蓝根活性成分研究，从中分离出化合物多达约200个，涉及生物碱、有机酸、蒽醌、黄酮、木脂素、三萜、甾醇、芥子苷、核苷、脂肪酸、氨基酸、碳水化合物等结构类型[中国野生植物资源，2005，24(5)：4～7]，并发现其中一些化合物有抗流感活性，如精氨酸、告依春[中国中药杂志，2014，39(5)：812～816；中国天然药物，2005，3(6)：359～360]、靛玉红、异牡荆苷、靛蓝[中国中医急症，2011，20(11)：1772～1774]、capparilosidea[cn201510202747.x]、3-吲哚醛[cn201810515027.2]、直铁线莲宁b[internationaljournalofmolecularmedicine，2013，31(4)：867-873]、落叶松脂醇-4-o-β-d-葡萄糖苷[cn201510187645.5]、β-谷甾醇[cn201610135752.8]、甲基-2-[2-(1-甲氧基-1h-吲哚-3-基)乙酰胺]苯甲酸酯[cn201610136353.3]、告依春二聚体[cn201810033331.3]、4′-羟基-7-甲氧基异黄酮[中国中药杂志，2013，38(8)：1172～1182]、芥酸[cn201810045581.9]等，但由于含量低、活性弱、缺乏体内药效等原因，这些化合物尚未被医药界公认为板蓝根的代表性有效成分。正因为药效物质不明确，迄今最大中成药“板蓝根颗粒”的质量标准一直缺乏定量指标。目前板蓝根药材和饮片的质量标准采用告依春(goitrin)作为定量指标[2010版《中国药典》(一部)]，学术界对此颇有争议。有公开资料显示：①告依春体外抗流感活性很弱，甚至不如板蓝根中已知的一些其它成分[中国中医急症，2011，20(11)：1772～1774]，且含量很低，根本不能代表板蓝根真实药效；②告依春是次生成分，由芥子油苷降解产生，提取过程中因温度变化其得率大幅波动，有时在制剂中检测不出(cn201410250141.9)；③告依春又称致甲状腺肿素，是十字花科植物常见有害物，可抑制人体对碘的吸收，导致甲状腺功能减低，甲状腺肿大[humtoxicol.1986,5(1):15-19]；④板蓝根中的告依春并不是单一化合物，而是r-和s-告依春的对映体混合物(cn201710975562.1)。这些资料充分表明，告依春是一种低效、有毒、微量、不纯的次生成分，不是板蓝根固有的特征性有效单体；目前把告依春当作板蓝根质控指标只有象征意义，是一种过渡性质控手段，控制告依春含量并不能切实保障板蓝根的药效，这也是告依春定量未能从板蓝根饮片延伸到板蓝根制剂的原因。现行板蓝根颗粒质量标准仅以普遍存在的非特征成分亮氨酸、精氨酸作为tlc定性指标，而没有含量测定项[2010版《中国药典》(一部)，p800]。可见，板蓝根药材标准和制剂标准在最关键的定量指标上是不一致的，二者没有因果关系，这种落后状况对保障板蓝根颗粒的品质是极为不利的。另有文献尝试用精氨酸、靛蓝、靛玉红、鸟苷、尿苷、腺苷等成分作为指标对板蓝根进行含量测定[中国兽药杂志.2019,53(7):36～43；西北农林科技大学学报(自然科学版)，2007，35(2)：215～219；时珍国医国药，2007，18(10)：2578～2580]，但这些成分作为质控指标的合理性也不足，尚未见列入正式标准。因此，有必要继续寻找板蓝根抗病毒有效成分，并将真正有代表性的有效成分作为质控指标，建立分析方法，提升现行板蓝根标准，以利改进生产工艺，提高产品质量。
caulilexinc是一种植物抗毒素，化学名为1-甲氧基-3-吲哚乙腈，存在于十字花科植物如花椰菜、卷心菜中，具有抗真菌活性[phytochemistry,2006,67:1503～1509]，也存在于板蓝根中[中草药，2006,37(9):1306～1309]。以往文献中未见该化合物有抗流感或抗病毒活性的记载，也未见应用于板蓝根及其制剂的质量分析。
技术实现要素：
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够准确评价板蓝根或其制品药效(特别是抗流感药效)的技术方案。
为了实现以上发明目的，本发明提供了一种板蓝根或其制品的质量分析方法，其采用caulilexinc作为指标成分进行定性定量分析。
以上所称制品是指含有板蓝根成分的药物(包括各种中药制剂，如饮片)、食品或板蓝根提取物。
本发明通过对板蓝根开展了深入的化学研究，分离鉴定了近百个单体成分，并针对板蓝根抗流感这一优势功效，在常规的mdck细胞模型上进行了抗h1n1甲型流感病毒活性筛选，首次发现caulilexinc具有显著的抗流感病毒活性，且含量突出，活性也强于以往报道的其它板蓝根成分，可以作为板蓝根抗流感药效的重要质量分析指标。
本发明所述的caulilexinc具有如下结构式：
caulilexinc是一种小分子吲哚化合物，分子量186，有紫外吸收，易溶于各种常见有机溶剂，可方便地使用高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱进行分析。基于该药效物质的发现，本发明旨在提供一种新的板蓝根质量分析方法，其主要技术特征在于使用caulilexinc作为指标成分，对板蓝根的药材、饮片、提取物及其单方和复方制剂进行定性定量分析。
作为本发明的方法的优选技术方案，采用色谱法，包括高效液相色谱(含hplc和uplc)、气相色谱和薄层色谱法，对板蓝根中的caulilexinc进行定性定量分析，最优选高效液相色谱法。本领域技术人员也可以视情况选择气相色谱或薄层色谱进行分析，均能取得基本一致的分析结果。
上述高效液相色谱法包括如下操作步骤：
a.供试品溶液的制备：取待测样品粉末或浸膏适量，精密称定，置容量瓶中，加入甲醇适量，加热，超声，放冷，甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液备用；
b.对照品溶液的制备：取caulilexinc适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇溶解并稀释定容，摇匀，制成每1ml含0.02mg的溶液，即得。
c.色谱条件：色谱柱为十八烷基键合相硅胶柱；流动相由a相和b相组成，a相为甲醇或乙腈，b相为水或含甲酸的水溶液，使用梯度或恒流方式洗脱，优选甲醇-0.1％甲酸(体积比为55：45)恒流洗脱；检测波长为200～300nm，优选λmax272nm；理论板数按caulilexinc峰计算应不低于2000。
d.测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
方法学考察表明，在所述液相色谱条件下[色谱柱为ods,4.6×150mm,5μm；流动相为甲醇-0.1％甲酸(55：45)；检测波长为272nm；流速1ml/min，板蓝根醇提物色谱图中caulilexinc的出峰保留时间为10.3min，实现了基线分离，峰形尖锐对称，峰纯度达到99.999％(图2a)；caulilexinc进样量在0.02～2.0μg范围时线性关系良好，以对照品量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y＝366645x 1091，r＝0.9999；精密度和重现性试验显示，二者相对偏差均小于1％；稳定性试验显示，对照品溶液在室温下放置6小时基本稳定，含量无明显下降；加样回收率试验显示，平均回收率大于98.5％。
在本发明的另一方面，还提供了caulilexinc在检测板蓝根或其制品的药效质量中的应用。
本发明的分析方法以板蓝根抗流感活性成分caulilexinc作指标，应用色谱技术对板蓝根样品进行定性定量，具有专属性强、操作简便、精确、灵敏、快捷等突出优势，易于推广普及。本发明系首次将板蓝根的内在质量与其特征性有效成分caulilexinc相关联，建立的色谱分析方法可应用于板蓝根药材、饮片、提取物及其制剂的质量标准制定，为工艺上全程跟踪监测caulilexinc从药材到制剂的迁移情况提供科学手段，对切实保障和提高板蓝根产品的质量与药效具有重大实用意义。
附图说明
图1是caulilexinc的紫外光谱图。
图2是板蓝根醇浸膏和caulilexinc的液相色谱图，其中a是板蓝根醇浸膏的液相色谱图，b是caulilexinc的液相色谱图。
图3是caulilexinc的esi-tof-ms质谱图。
图4是caulilexinc的核磁共振氢谱图(cd3od,400mhz)。
图5是caulilexinc的核磁共振碳谱图(cd3od,100mhz)。
图6示出了caulilexinc的细胞病变抑制法抗流感病毒h1n1试验结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。若未特别说明，实施例中所用仪器或试剂均为本领域常规试剂或仪器，是可通过市场购买获得的常规产品。若未特别说明，文中涉及的具体实验操作均为本领域普通技术人员根据其掌握的公知常识或常规技术手段所能理解或知晓的，对此不再一一赘述。
实施例1：caulilexinc的分离纯化和结构鉴定
取板蓝根50kg,切段，用10倍量85％乙醇回流提取(3×1.5h)，回收溶剂，得浸膏6.1kg，再加3倍量水混悬,用醋酸乙酯萃取三次，回收溶剂后得到醋酸乙酯部分(525g)。取醋酸乙酯部分用硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇(100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、60∶40、0∶100)梯度洗脱，得11个组分，其中fr.2(86g)继续用硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮(100∶0、90∶10、80∶20、60∶40、0∶100)梯度洗脱后得10个组分，取其中的fr.2-3再上硅胶柱分离，用氯仿洗脱，得单体化合物(1.6g)，外观呈黄色油状。
如图1、图3至图5所示，该化合物经波谱鉴定，结果如下：
esi-tof-msm/z:187.0891[m h] (计算值c11h11n2o,187.0866)(图3)。1h-nmr(cd3od,400mhz)δppm:7.60(1h,d,j＝8.0hz,h-8),7.44(2h,m,h-2,5),7.27(1h,t,j＝7.6hz,h-7),7.14(1h,t,j＝7.6hz,h-6),4.07(3h,s,2-och3),3.93(2h,s,h-10)(图4)。13c-nmr(cd3od,100mhz)δppm:133.79(c-9),1124.08(c-7),123.94(c-4),123.15(c-5),121.27(c-6),119.58(c-11),119.50(c-2),109.46(c-8),102.10(c-3),66.47(och3),14.03(c-10)(图5)。以上数据与文献报道一致[中国中药杂志.2018,43(10)∶2091-2096]，鉴定为caulilexinc。
实施例2：caulilexinc的细胞病变抑制法抗流感病毒试验
1、材料：细胞和病毒
mdck细胞购自中国科学院上海细胞库；流感病毒a/pr/8/34(h1n1)购自atcc，以reed-muench法测定其半数感染量(tcid50/100μl)作为病毒滴度。
2、试剂：
dmso购自sigma公司；dmem/df12(1：1)培养基购自gibco公司；pbs购自gibco公司；羧酸奥司他韦购自medchemexpressllc；mtt购自genebase；病毒培养液(含终浓度1.5μg/ml的tpck胰酶)：100mldmem/df12(1：1)培养液 150μl的1mg/mltpck胰酶，即配即用；caulilexinc从板蓝根中分离得到，hplc纯度为98％，用dmso溶解配成母液，置4℃冰箱保存。
3、药物毒性实验(mtt法)
按每孔约2.5×104mdck细胞接种到96孔板，24h后待细胞长成单层，弃去培养液，加入倍比稀释的药物(1200μg/ml-9.4μg/ml)100μl/孔，空白对照和正常细胞对照孔加入100μl/孔dmem/f12，37℃，5％co2继续培养36-48小时，每孔加mtt溶液(0.5mg/ml)，置37℃、5％co2温箱中继续孵育4小时。吸弃培养上清液，每孔加100μl二甲基亚砜(dmso)，低速振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，计算细胞存活率，并用reed-muench法计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(tc50)。
4、caulilexinc对流感病毒的抑制作用
将96孔板单层mdck细胞用pbs洗1次，加入100个tcid50病毒液，100μl/孔，37℃孵育2小时；弃去病毒孵育液，药物干预组加入用含终浓度1.5μg/ml的tpck胰酶的病毒培养液倍比梯度稀释的caulilexinc(128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml)，37℃培养48小时后观察结果；同时设立羧酸奥司他韦(0.0625μg/ml)对照组、病毒对照组和正常细胞对照组。
细胞出现病变程度按以下6级标准记录：-为细胞生长正常，无病变出现；±为细胞病变少于整个单层细胞的10％； 为细胞病变约占整个单层细胞的25％； 为细胞病变约占整个单层细胞的50％； 为细胞病变约占整个单层细胞的75％： 为细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。reed-muench法计算半数有效抑制浓度(ic50)，并以选择指数si表示(si＝tc50/ic50)，si>2表示低毒高效；si：1～2表示高毒低效；si<1表示无效。
5、试验结果
利用mtt法测得caulilexinc的tc50为208.9μg/ml。体外抗病毒活性如图6所示，受试药物能有效抑制流感病毒a/pr/8/34(h1n1)引起的细胞病变，并有明显剂量依赖性，ic50为18.2μg/ml；si＝11.47。如图6所示，随着caulilexinc的浓度逐渐增加，流感病毒受到抑制，细胞出现病变的程度逐渐减轻。
实施例3：板蓝根药材中caulilexinc的含量测定
供试品溶液的制备：取板蓝根药材，切段，粉碎，取细粉约1.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入甲醇约20ml，放60℃水浴中加热20min，再超声15min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液备用。
对照品溶液的制备：取caulilexinc适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇溶解并稀释定容，摇匀，制成每1ml含0.02mg的溶液，即得。
色谱条件：色谱柱为岛津ods，4.6×150mm，5μm；流动相为甲醇-0.1％(质量浓度)甲酸(体积比55：45)；检测波长272nm；流速1ml/min。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：读取对照品色谱峰和供试品图谱中相应峰的峰面积，按外标法计算，测得板蓝根药材caulilexinc含量为0.022％。
实施例4：板蓝根药材中caulilexinc的tlc(薄层色谱法)鉴别
供试品溶液的制备：取板蓝根药材，切段，粉碎，取细粉约2g，加入甲醇水浴加热提取(3×10ml)，滤过，合并提取液，浓缩至2ml，备用。
对照品溶液的制备：取caulilexinc适量，加甲醇溶解，制成每1ml含1.0mg的溶液，即得。
展开：分别吸取对照品和供试品溶液10μl，点于同一块硅胶g薄层板上，置层析缸中，用石油醚-氯仿(1：1)展开，取出，晾干，碘熏显色。
结果：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上县相同颜色的斑点，rf＝0.6。
实施例5：板蓝根醇浸膏中caulilexinc的含量测定
供试品溶液的制备：取板蓝根酒精提取浸膏约100mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加入甲醇约20ml，放60℃水浴中加热10min，再超声10min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液备用。
对照品溶液的制备：取caulilexinc适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇溶解并稀释定容，摇匀，制成每1ml含0.02mg的溶液，即得。
色谱条件：色谱柱为岛津ods，4.6×150mm，5μm；流动相为甲醇-0.1％甲酸(55：45)；检测波长272nm；流速1ml/min。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：读取对照品色谱峰和供试品图谱中相应峰的峰面积，按外标法计算，测得板蓝根醇浸膏caulilexinc含量为0.19％(图2)。
上述实施例表明，caulilexinc可以方便地从板蓝根药材中分离得到，在mdck细胞模型上对h1n1甲型流感病毒具有明显的抑制活性，可减少mdck细胞的凋亡，并呈剂量依赖性，提示caulilexinc作为一种新型的抗流感小分子结构，具高效低毒特征，可以作为药效指标应用于对板蓝根或其制品的药效(特别是抗流感药效)质量评价分析中。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
1.一种板蓝根或其制品的质量分析方法，其特征在于，采用caulilexinc作为指标成分进行定性定量分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述caulilexinc具有如下结构式：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制品是含有板蓝根成分的药物、食品或板蓝根提取物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用色谱法进行定性定量分析。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述色谱法包括高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法中的任意一种或多种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
a.供试品溶液的制备：取待测的板蓝根或其制品的样品粉末或浸膏，精密称定，置容量瓶中，加入甲醇，加热，超声，放冷，甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液备用；
b.对照品溶液的制备：取caulilexinc，精密称定，置容量瓶中，加甲醇溶解并稀释定容，摇匀，制成每1ml含0.02mg的溶液，即得；
c.色谱条件：色谱柱为十八烷基键合相硅胶柱；流动相为体积比55:45的甲醇-0.1％甲酸；检测波长为200～300nm；
d.测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
7.caulilexinc在检测板蓝根或其制品的药效质量中的应用。
技术总结