本发明涉及一种替诺呋韦艾拉酚胺中基因毒性杂质的含量检测方法，属于药物分析
技术领域：
。
背景技术：
：替诺呋韦艾拉酚胺(tenofoviralafenamidefumarate，化合物i)，商品名vemlidy，2016年11月10日获得fda批准，是近10年来fda批准的首个乙肝药物，之后又于2016年12月19日在日本上市，并于2017年1月9日获得欧洲ema批准。2017年4月20日，欧洲肝脏研究学会发布了2017版最新乙型肝炎管理指南，其中对于初治慢乙肝患者的一线首选核苷(酸)类似物治疗方案，在原有的富马酸替诺福韦二吡呋酯和恩替卡韦之外，指南增加了替诺呋韦艾拉酚胺。对于患有肾脏疾病或骨骼疾病和/或有发生上述疾病风险的患者，特别是曾经有过核苷类似物暴露的人群，指南推荐应首选替诺呋韦艾拉酚胺治疗。专利wo2013052094(a1)和nucleosides,nucleotides&nucleicacids,20(4-7),621-628(2001)公开了替诺呋韦艾拉酚胺的制备方法，合成路线如下所示：基因毒性杂质(genotoxicimpurity)是指能直接或间接损害dna，导致基因突变或具有致癌倾向的物质。其特点是在浓度很低时即可造成人体遗传物质的损伤，具有致突变性和致癌性，在用药过程中严重威胁到人类的健康。经分析发现，上述方法制备的替诺呋韦艾拉酚胺中存在杂质e(异丙基-苯基((((r)-1-(6-氨基-9h-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧代)甲基)磷酸)和杂质g((r)-二异丙基(((1-(6-氨基-9h-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧代)甲基)磷酸)。依据ichm7分析，这两个杂质具有膦酸烷基酯(alkylestersofphosphonicacids)警示结构，故应按基因毒性杂质进行研究和控制。在基因毒性的控制过程中，一个重要的概念就是毒理学关注阈值(thresholdoftoxicologicalconcern，ttc)，其限度(1.5μg/d)作为基因毒性杂质的可接受限度，低于该限度，则不能观察到显著的毒理作用。具体定义是：在人的一生(70岁)中，每天摄入1.5μg的基因毒性杂质，其致癌的风险是可以接受的。依据上述原则，替诺呋韦艾拉酚胺的基因毒性杂质限度为60ppm。因此需要提供替诺呋韦艾拉酚胺中基因毒性杂质的含量检测方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种替诺呋韦艾拉酚胺(9-[(r)-2-[[(s)-[[(s)-1-(异丙氧羰基)乙基]氨基]苯氧基氧膦基]甲氧基]丙基腺嘌呤半反丁烯二酸盐)中基因毒性杂质的含量检测方法。本发明所涉及的基因毒性杂质为式ⅰ所示杂质e(异丙基-苯基((((r)-1-(6-氨基-9h-嘌呤-9基)丙烷-2-基)氧代)甲基)磷酸)和式ⅱ所示杂质g((r)-二异丙基(((1-(6-氨基-9h-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧代)甲基)磷酸)：具体地，本发明所提供的替诺呋韦艾拉酚胺中基因毒性杂质的含量检测方法，包括如下步骤：(1)将待测的替诺呋韦艾拉酚胺配制成供试品溶液，将式ⅰ所示杂质e和式ⅱ所示杂质g配制成不同浓度的对照品溶液；(2)将所述对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，分别以式ⅰ所示杂质e和式ⅱ所示杂质g的色谱峰面积作为纵坐标，分别以所述对照品溶液中式ⅰ所示杂质e和式ⅱ所示杂质g的浓度作为横坐标制作标准曲线；(3)将所述试品溶液进行所述高效液相色谱检测，得到所述供试品溶液中式ⅰ所示杂质e和式ⅱ所示杂质g的峰面积，根据所述标准曲线，即得到替诺呋韦艾拉酚胺中式ⅰ所示杂质e和式ⅱ所示杂质g的含量；上述的检测方法中，步骤(1)中，采用乙腈水溶液配制所述供试品溶液和所述对照品溶液；所述乙腈水溶液中乙腈的体积含量优选为30％；所述对照品溶液中，式ⅰ所示杂质e的浓度为0～4.0μg/ml，优选0.1～4.0μg/ml，式ⅱ所示杂质g的浓度为0～0.2μg/ml，优选0.02～0.12μg/ml。配制至少3种不同浓度的所述对照品溶液。上述的检测方法中，步骤(2)和(3)中，所述高效液相色谱检测的条件如下：固定相：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，优选ultimatexb-c184.6×150mm5μm型色谱柱；检测器：紫外检测器，检测波长为260cm；流动相a：磷酸盐缓冲溶液；流动相b：乙腈；洗脱方式：梯度洗脱；流速：1.0±0.1ml/mim；柱温箱温度：35±5℃。上述的检测方法中，所述洗脱梯度的程序为：0～10min，流动相a的体积分数为75％；10～15mim，流动相a的体积分数由75％下降至70％；15～25mim，流动相a的体积分数保持为70％；25～25.1mim，流动相a的体积分数由70％上升至75％；25.1～40mim，流动相a的体积分数保持为75％。上述的检测方法中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01～0.03mol/l，优选0.02mol/l；所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钾水溶液或磷酸二氢钠水溶液，采用磷酸调节ph值。由于式ⅰ所示杂质e为一对非对映异构体，所以在色谱图上洗脱出2个峰(图1)。经按外标法计算，杂质e和杂质g的含量均不得超过60ppm。经方法学研究表明，本发明的检测方法系统适用性良好；专属性试验表明空白溶剂对杂质的检测无影响，专属性强；本发明方法检测两杂质的灵敏度较高，准确度良好；溶液稳定性试验表明，本发明方法采用的供试品溶液在室温放置，溶液稳定性良好。使用本发明方法可以大大提高检测方法的灵敏度，设备仪器均为普通，检测成本低廉，操作极为简便，大大节约了检测成本和检测时间。附图说明图1为替诺呋韦艾拉酚胺基因毒性杂质检测的系统适应性色谱图。图2为对照品溶液中杂质e的标准曲线。图3为对照品溶液中杂质g的标准曲线。图4为空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液的色谱图。图5为对照品溶液的稳定性趋势图。图6为供试品溶液的稳定性趋势图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、取替诺呋韦艾拉酚胺适量，加稀释剂(30％乙腈水溶液，v/v)超声溶解并定量稀释制成每1ml中约含1.5mg的溶液，作为供试品溶液。精密称取杂质e和杂质g适量，用稀释剂(30％乙腈水溶液，v/v)定量稀释制成每1ml中含杂质g和杂质e分别为0.091、0.089μg的溶液，作为对照品溶液。高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：ultimatexb-c184.6×150mm，5μm色谱柱；检测器：紫外检测器，检测波长为260nm；流动相a：0.02mol/l的磷酸氢二钾溶液(用磷酸调节ph值至5.5)；流动相b：乙腈；柱温箱温度：35℃；流速：1.0ml/min；洗脱梯度，洗脱程序如表1中所示：表1梯度洗脱程序时间(min)流动相a％流动相b％0752510752515703025703025.17525407525精密量取供试品和对照品溶液各20μl注入液相色谱仪检测，得到色谱图。在上述检测条件下，如图1所示和表2所示，杂质e为一对非对映异构体，所以在色谱图上洗脱出2个吸收峰(6.402min和6.950min)，杂质g的吸收峰出现在3.737min处，由图1可以看出，在本发明提供的检测条件下，杂质e和g能与替诺呋韦艾拉酚胺有效分离，且两种杂质也能很好地分离。表2图1中色谱图的色谱峰结果保留时间面积usp理论塔板数usp分离度峰高13.7372295365130226.402246561500611.79308336.95028608156722.493308分别以对照品溶液中杂质e和杂质g的浓度为横坐标，以杂质e和杂质g的色谱峰面积作为纵坐标，制作标准曲线：杂质e标准曲线：浓度范围：0.11～4.04μg/ml，线性方程y＝26426.3793x-434.7637，r2＝0.9999；杂质g标准曲线：浓度范围：0.02～0.11μg/ml，线性方程y＝30823.5294x 114.2132，r2＝0.9985。结果表明杂质e和杂质g的线性良好，标准曲线图分别如图2和图3所示。专属性试验表明空白溶剂对杂质的检测无影响，本发明方法的专属性强：空白溶剂：乙腈-水(30:70，v/v)。称取杂质g约2mg，置10ml容量瓶中，加稀释剂(稀释剂(30％乙腈水溶液，v/v)溶解并稀释至刻度，摇匀，再移取溶液1ml，置100ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质g储备液；称取杂质e约2mg，置10ml容量瓶中，加稀释剂(30％乙腈水溶液，v/v)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质e储备液；分别移取杂质g储备液5ml、杂质e储备液1.5ml，置同一100ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品储备液。移取杂质对照品储备液5ml，置10ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。平行配制两份。取替诺呋韦艾拉酚胺约10mg，置10ml量瓶中，加稀释剂(30％乙腈水溶液，v/v)稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取上述系列样品溶液各20μl，注入液相色谱仪检测，记录色谱图，如图4所示，图中由上至下依次为对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂的吸收峰，可以看出，空白溶剂不干扰杂质的检测。本发明方法检测两种杂质的灵敏度较高，准确度良好：取杂质g、杂质e对照品适量，精密称定，加稀释剂(30％乙腈水溶液，v/v)溶解并定量稀释制成一定浓度的溶液，将此溶液用溶剂逐级稀释至适宜浓度，在上述色谱条件下，以信噪比为3：1时注入色谱仪的量确定检测限，检测结果如表3所示。表3杂质g和杂质e的检测限名称浓度(μg/ml)s/n相当于主成分百分比(％)杂质g0.0062.660.001杂质e10.012.780.001杂质e20.012.750.001由表3可以看出，杂质g、杂质e1、杂质e2的信噪比均约为3，检测限浓度分别为0.006μg/ml、0.01μg/ml、0.01μg/ml，分别相当于主成分的0.001％、0.001％、0.001％，实验结果表明本发明的色谱条件灵敏度高，适合对两种杂质的检测。溶液稳定性试验表明，本发明供试品溶液和对照品溶液在室温放置，溶液稳定性良好：称取杂质g约2mg，置10ml容量瓶中，加稀释剂(稀释剂(30％乙腈水溶液，v/v)溶解并稀释至刻度，摇匀，再移取溶液1ml，置100ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质g储备液；称取杂质e约2mg，置10ml容量瓶中，加稀释剂(30％乙腈水溶液，v/v)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质e储备液；分别移取杂质g储备液5ml、杂质e储备液1.5ml，置同一100ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品储备液。移取杂质对照品储备液5ml，置10ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。平行配制两份。取替诺呋韦艾拉酚胺约10mg，置10ml量瓶中，加稀释剂(30％乙腈水溶液，v/v)稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取室温条件下放置的供试品溶液、对照品溶液各20μl分别于0min、140min、220min、340min、500min、600min、640min、680min、720min、760min、800min、840min、880min、920min、960min、1000min注入液相色谱仪，记录色谱图，试验结果如表4和表5、图5和图6所示。表4对照品溶液的稳定性考察结果表5供试品溶液的稳定性考察结果由表4和表5以及图5和图6可以看出，在室温16.6小时内，杂质g、杂质e对照品峰面积无较大变化；在样品溶液中加入杂质g、杂质e，杂质峰面积rsd分别为1.2％、0.2％，均小于5.0％，无较大变化；供试品溶液在考察的时间16.6小时内稳定。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种替诺呋韦艾拉酚胺中基因毒性杂质的含量检测方法，包括如下步骤：
(1)将待测的替诺呋韦艾拉酚胺配制成供试品溶液，将式ⅰ所示杂质e和式ⅱ所示杂质g配制成不同浓度的对照品溶液；
(2)将所述对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，分别以式ⅰ所示杂质e和式ⅱ所示杂质g的色谱峰面积作为纵坐标，分别以所述对照品溶液中式ⅰ所示杂质e和式ⅱ所示杂质g的浓度作为横坐标制作标准曲线；
(3)将所述试品溶液进行所述高效液相色谱检测，得到所述供试品溶液中式ⅰ所示杂质e和式ⅱ所示杂质g的峰面积，根据所述标准曲线，即得到替诺呋韦艾拉酚胺中式ⅰ所示杂质e和式ⅱ所示杂质g的含量；
所述高效液相色谱检测的条件如下：
固定相：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；
检测器：紫外检测器，检测波长为260cm；
流动相a：磷酸盐缓冲溶液；
流动相b：乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱；
所述洗脱梯度的程序为：
0～10min，流动相a的体积分数为75％；
10～15mim，流动相a的体积分数由75％下降至70％；
15～25mim，流动相a的体积分数保持为70％；
25～25.1mim，流动相a的体积分数由70％上升至75％；
25.1～40mim，流动相a的体积分数保持为75％。
流速：1.0±0.1ml/mim；
柱温箱温度：35±5℃；
2.根据权利要求1所述的含量检测方法，其特征在于：步骤(1)中，采用乙腈水溶液配制所述供试品溶液和所述对照品溶液；
所述对照品溶液中，式ⅰ所示杂质e的浓度为0～4.0μg/ml，式ⅱ所示杂质g的浓度为0～0.2μg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的含量检测方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01～0.03mol/l；
所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钾水溶液或磷酸二氢钠水溶液，采用磷酸调节ph值。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的含量检测方法，其特征在于：所述固定相为ultimatexb-c18。
技术总结本发明公开了一种替诺呋韦艾拉酚胺中基因毒性杂质的含量检测方法。本发明检测方法包括如下步骤：将待测的替诺呋韦艾拉酚胺配制成供试品溶液，将杂质E和杂质G配制成不同浓度的对照品溶液；将对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，分别以杂质E和G的色谱峰面积作为纵坐标，分别以对照品溶液中杂质E和G的浓度作为横坐标制作标准曲线；将试品溶液进行所述高效液相色谱检测，得到供试品溶液中杂质E和G的峰面积，根据标准曲线，即得到替诺呋韦艾拉酚胺中杂质E和G的含量。使用本发明方法可以大大提高检测方法的灵敏度，设备仪器均为普通，检测成本低廉，操作极为简便，大大节约了检测成本和检测时间。
技术研发人员：刘宇晶;利虔;赵小君;薛燕;谌宗永
受保护的技术使用者：北京阳光诺和药物研究有限公司
技术研发日：2020.02.20
技术公布日：2020.06.05
