本发明涉及分析检测
技术领域：
，尤其涉及一种同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法。
背景技术：
：公开该
背景技术：
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。维生素a是一种脂溶性维生素，可以分成两种：维生素a醇和胡萝卜素。维生素a醇只存在于动物性的食物中；而胡萝卜素可从植物性及动物性食物中摄取。维生素a具有多种生理功能，对视力、生长、上皮组织及骨骼的发育和胎儿的生长发育都是必需的。其作用包括以下几个方面：1.维持正常的视觉功能，防止夜盲症和视力减退，有助于对多种眼疾的治疗；2.有助于免疫系统功能正常，有抗呼吸系统感染的作用；3.维持骨骼正常生长发育，维护皮肤、头发、牙齿、牙床的健康；孕妇如果缺乏维生素a时会直接影响胎儿发育，甚至发生死胎。维生素d又称抗佝偻病维生素，其中最重要的是d2和d3。维生素是一种固醇类衍生物，属于脂溶性维生素。维生素d是有维生素d原经紫外照射后的衍生物，动植物体内都有维生素d原。人的皮肤里含有一种叫7-脱氢胆固醇的物质，这种物质在紫外线的照射下，会转化成维生素d。维生素d可以帮助钙、磷的吸收，预防儿童的佝偻病和成人的软骨症。另外维生素d还对免疫系统有增强作用。维生素e亦称维他命e，又名生育酚或产妊酚，是一种脂溶性维生素，是最主要的抗氧化剂之一。在食油、水果、蔬菜及粮食中均存在，是一种有8种形式的脂溶性维生素，溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中，不溶于水，对热、酸稳定，对碱不稳定，对氧敏感，对热不敏感。维生素e的功效与作用为：1.延缓衰老，有效减少皱纹的产生，保持清楚的容貌；2.减少细胞耗氧量，使人更有耐久力，有助减轻腿抽筋和手足僵硬的状况；3.抗氧化保护机体细胞免受自由基的毒害；4.改善脂质代谢，预防冠心病、动脉粥样硬化；5.预防癌症、预防多处慢性疾病；预防炎症性皮肤病、脱发症；预防溶血性贫血、保护红血球使之不容易破裂；预防治疗甲状腺疾病；改善血液循环、保护组织、降低胆固醇、预防高血压；6.维生素e是一种很重要的血管扩张剂和抗凝血剂；预防与治疗静脉曲张；防止血液的凝固，减少斑纹组织的产生；7.强化肝细胞膜、保护肺泡细胞，降低肺部及呼吸系统遭受感染的几率；8.保护皮肤免受紫外线和污染的伤害，减少疤痕与色素的沉积；加速伤口的愈合；9.促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加；使女子雌性激素浓度增高，提高生育能力，预防流产。10.近来还发现维生素e可抑制眼睛晶状体内的过氧化脂反应，使末稍血管扩张，改善血液循环，预防近视发生和发展。维生素k(vitamink)是凝血维生素，具有叶绿醌生物活性，溶于线粒体膜的类脂中，起着电子转移作用，维生素k可增加肠道蠕动和分泌功能，缺乏维生素k时平滑肌张力及收缩减弱，它还可影响一些激素的代谢。如延缓糖皮质激素在肝中的分解，同时具有类似氢化可的松作用，长期注射维生素k可增加甲状腺的内分泌活性等。维生素k的功效与作用：1、能促进血液正常凝固。尽管人体需要量少，但新生儿却极易缺乏。缺少它，可能导致凝血功能减弱，严重时会流血不止，甚至死亡。2、能促进骨骼代谢、有效降低骨折风险。3、能减少女性生理期大量出血，预防内出血及痔疮等。中老年女性、偏好荤菜、常流鼻血以及长期服用抗生素者都应特别注意多从食物中摄取维生素k。4、能够促进钙的吸收。同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)，是蛋氨酸去甲基后形成的一种含硫氨基酸，属于蛋氨酸循环的中间产物。有关其代谢紊乱的报道最早来源于先天性胱硫醚合成酶缺乏导致出现同型半胱氨酸尿患者的观察。此后，又相继发现其他几种参与hcy代谢的酶或辅酶改变所引起的代谢紊乱。同型半胱氨酸的临床意义：1.与心脑血管疾病的关系：hcy水平升高是心脑血管疾病的独立危险因素，危险度随血浆总hcy水平增加而升高[1]。研究发现，高hcy血症是发生动脉粥样硬化的独立危险因素，hcy与心力衰竭的相关性更为密切，对尚未出现心脏病症状者来说，hcy升高者患心力衰竭的危险可加倍，妇女的危险可增加3倍。2.与神经系统疾病的关系：脑血管病是目前严重危害人类健康的主要疾病，近年来随着分生物学的深入发展，hcy在脑卒中的作用日益受到重视[2]；研究表明，hcy的升高是与中风有重要关联的危险因子；高hcy是造成老年痴呆症和帕金森的重要因素。3.与高血压的关系：研究显示对于患有周围动脉闭塞性疾病的年轻女性，高同型半胱氨酸血症和高血压具有很强的协同作用。4.与糖尿病的关系：血浆hcy水平可作为2-型糖尿病患者大血管疾病的独立危险因素[3]；监测糖尿病患者hcy水平有利于对其预后的评估，hcy升高在糖尿病伴肾脏、视网膜及血管并发症的患者更为严重。5.与慢性肾功能衰竭(crf)的关系：crf普遍有高hcy血症，其发生率是正常人的33倍；尿毒症时hcy升高。6.与血栓栓塞的关系：高hcy血症(＞20μmol/l)可使深静脉血栓发生率增加4倍；高hcy是我国汉族人群肺血栓栓塞症(pte)发作的一个独立危险因子，降低hcy可降低国人静脉血栓栓塞症(vte)的危险。7.与监测肝损伤的关系：血浆hcy浓度检测还可应用于对普通人群慢性肝病的筛选。8.与优生优育：孕妇检测hcy对防止妊娠并发症与优生优育(预防早产、流产、新生儿体重减低、胎儿神经管畸形等)具有重要意义。发明人发现，在某些心血管疾病中，脂溶性维生素和同型半胱氨酸的血浆浓度会发生变化或异常，具有一定的关联性，但是现有技术中一般都是各种脂溶性维生素的同时检测，以及同型半胱氨酸的单独检测，分开检测时，一方面检测的方法不同，检测结果的误差存在较大差别，数据之间的关联性受到一定程度的干扰；另一方面，分开检测，严重延长了分析的时间，降低了检测效率。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法。为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，包括如下步骤：对血浆样品进行前处理，前处理方法为：向血清样品中加入1,4-二硫苏糖醇，混匀后，再加入蛋白沉淀剂进行处理；从前处理后的血浆样品中萃取脂溶性维生素和同型半胱氨酸；将萃取液经过吹干、复溶后，上液相色谱质谱联用系统进行进样分析；所述萃取剂为正己烷。本发明的以上一个或多个实施例的有益效果为：当首先向血清样品中加入1,4-二硫苏糖醇，再沉淀蛋白时，可以有效防止蛋白对脂溶性维生素和同型半胱氨酸的吸附，避免待测物质的损失，有利于提高检测的准确性。另外，1,4-二硫苏糖醇后，去蛋白后再进行萃取时，可以同时改善脂溶性维生素和同型半胱氨酸在血浆和正己烷之间的分配系数，使正己烷更完全地将脂溶性维生素和同型半胱氨酸进行萃取，对提高两种物质检测准确性较为有利。1,4-二硫苏糖醇还可以提高正己烷对脂溶性维生素和同型半胱氨酸萃取的选择性，防止正己烷对血浆中的其他物质过多萃取，对脂溶性维生素和同型半胱氨酸的检测造成干扰。采用同一方法同时对脂溶性维生素和同型半胱氨酸进行检测，使其具有相近的损失、相近的误差，检测得到的结果具有较好的同步性，便于研究两者血浆浓度的联系对心血管疾病的影响。附图说明构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。图1为本发明实施例中，对四种脂溶性维生素和同型半胱氨酸混合标样的液相色谱分离图谱。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，包括如下步骤：对血浆样品进行前处理，前处理方法为：向血清样品中加入1,4-二硫苏糖醇，混匀后，再加入蛋白沉淀剂进行处理；从前处理后的血浆样品中萃取脂溶性维生素和同型半胱氨酸；将萃取液经过吹干、复溶后，上液相色谱质谱联用系统进行进样分析；所述萃取剂为正己烷。在一些实施例中，1,4-二硫苏糖醇溶液的浓度为70-120μg/ml，进一步的，所述1,4-二硫苏糖醇的浓度为100μg/ml。进一步的，血清样品与1,4-二硫苏糖醇溶液的体积比为3.5-4.5:1。1,4-二硫苏糖醇在血浆中为该浓度时，可以更好地避免目标物质在蛋白质上的吸附，而且1,4-二硫苏糖醇的浓度较小，样品经萃取后，不会对待测物质产生干扰，对提高检测的准确性更有利。在一些实施例中，所述蛋白沉淀剂为甲醇和水的混合液，其中，水的质量百分数为1％-10％，进一步的，蛋白沉淀剂中，水的质量百分数为2％。进一步的，血清与蛋白沉淀剂的体积比为1:1.2-2。在一些实施例中，采用氮气将萃取液吹干。进一步的，所述复溶的复溶剂为95％甲醇水溶液。在一些实施例中，液相色谱检测条件为：phenomenexkintexc18，30*3mm，2.6μm；流速：0.7ml/min；柱温：40℃；流动相：a：0.1％甲酸 水；b:0.1％甲酸 乙腈 异丙醇，乙腈和异丙醇的体积比为2-3:10-15。该种流动相可以顺利地将六种脂溶性维生素和同型半胱氨酸完全分离，有利于提高检测的准确性。在一些实施例中，液相色谱的梯度洗脱程序为：0-0.4min，流动相a的体积百分数一直为60％；0.4-1.5min，流动相a的体积百分数由60％逐渐降为40％；1.5-2.5min，流动相a的体积百分数由40％逐渐降为0；2.5-4.5min，流动相a的体积百分数一直为0；4.5-4.51min，流动相a的体积百分数升至60％；4.51-5.0min，流动相a的体积百分数一直为60％。下面结合实施例对本发明进一步说明：实施例1一种同时检测血清中多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，采用液相色谱串联质谱进行检测，包括如下步骤：(一)将全血离心，离心速度为3400r/min，离心时间为10min，取上清液得血清，血清在4℃冷藏避光条件下保存(24h内)，至分析前备用，或置于-20℃冷冻避光条件下保存(72h内)，或置于-80℃冷冻避光条件下避光保存(30天内)。(二)各种溶液的配制1)制备内标储备液(溶剂为甲醇水，水的质量百分数为50％)，内标储备液中各物质的浓度分别为：维生素a-d6：10μg/ml；25-羟基维生素d3-d6：50μg/ml；同型半胱氨酸hcy-d8:50μg/ml；维生素e-d6：100μg/ml；维生素k-d4：10μg/ml。2)取内标储备液一定体积，然后采用甲醇水(水的质量百分数为50％)对其进行稀释，得到内标工作液，各内标工作液中各种物质的浓度分别为：维生素a-d6：200ng/ml；25-羟基维生素d3-d6：200ng/ml；同型半胱氨酸hcy-d8:2000ng/ml；维生素e-d6：2000ng/ml；维生素k-d4：40ng/ml。3)配制各脂溶性维生素(维生素a、25oh-vd2、25oh-vd3、维生素e、维生素k)和同型半胱氨酸的储备液，储备液的浓度均为100μg/ml。然后用5％bsam/v(牛血清白蛋白)甲醇溶液制备6个梯度的混合标准溶液分装于1.5ml棕色瓶中，-20℃保存备用。(三)样品前处理及检测分别取血清样品200μl于2mlep(环氧树脂)管中，加入50μl内标工作液以及50μl还原剂(1,4-二硫苏糖醇(dtt)溶液，其浓度为100μg/ml)，涡旋混匀；向其中加入350μl蛋白沉淀剂(甲醇水溶液，水的百分含量为2％)，涡旋10秒；再加入1.0ml萃取剂(正己烷)进行液液萃取，涡旋10min，然后10000rpm离心10分钟；取离心后的上清液900μl，在室温氮气下吹干，残渣用100μl复溶剂复溶，涡旋，上液相色谱质谱联用系统进样20μl分析。液相色谱条件为：色谱柱：phenomenexkintexc18，30*3mm，2.6μm；流速：0.7ml/min；色谱柱温：40℃。流动相：a：0.1％甲酸 水；b:0.1％甲酸 乙腈 异丙醇，乙腈和异丙醇的体积比为2:10。流动相的梯度洗脱程序，如表1所示：表1流动相的梯度洗脱程序time(min)a％b％060400.460401.540602.501004.501004.5160405.06040质谱条件：1、离子源：apci源；nc:5.0；tem:450；cad:6；cur:25；gs1:50。2、质谱离子对，如表2所示。表2数据采集方式：(多反应监测模式)mrm；雾化气温度：450℃；雾化气气流：5.0l/min；毛细管电压：4500v；离子源：大气压电离源(apci)；离子模式：正离子模式。(四)本实施例中的方法论证如下：1)分别移取10μl五种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的储备液，至10ml容量瓶中、混匀，用甲醇水定容，采用以上方法进行检测，由图1可知，采用以上方法可以将六种物质完全分离。2)线性范围与灵敏度试验根据目标物在人体内的含量范围确定标准曲线浓度范围，试验中使用不含目标物的血清样品(人血清基质)配制6个不同浓度的校准曲线点，va的浓度分别为：40、80、160、400、800、1600ng/ml；α-ve的浓度分别为：500、1000、2000、5000、10000、20000ng/ml；25oh-vd2的浓度分别为：2、4、8、20、40、80ng/ml；25oh-vd3的浓度分别为5、10、20、50、100、200ng/ml；vk的浓度分别为0.5、1、2、5、10、20ng/ml；hcy的浓度分别为500、1000、2000、3000、5000、8000ng/ml；所得样品采用以上样品前处理方法净化样品并进行检测，获得结果见表3。表3线性范围及灵敏度3)方法精密度与准确度试验将16ml血清样本混匀，均分成4管，每管血清量4ml，取一管作为本底值检测(serum)，另外3管添加ve、vd3、vd2、va、vk和hcy标准品作为l、m、h三个梯度样本(按照标准品体积/血清体积<2％添加标准品值)。分别从以上4管，每管取3份用96孔板检测ve、vd3、vd2、va、vk、hcy值，样品的前处理方法以及检测方法同上。l、m、h样本添加回收率误差在±15％以内，样本精密度cv<15％。每个浓度平行处理6个样，获得数据见表4。表4精密度与准确度(五)实际样品的测定将血液样本1-5分别采用以上方法进行检测，检测的结果如表5所示。表5以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3
技术特征：1.同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
对血浆样品进行前处理，前处理方法为：向血清样品中加入1,4-二硫苏糖醇，混匀后，再加入蛋白沉淀剂进行处理；
从前处理后的血浆样品中萃取脂溶性维生素和同型半胱氨酸；
将萃取液经过吹干、复溶后，上液相色谱质谱联用系统进行进样分析；
所述萃取剂为正己烷。
2.根据权利要求1所述的同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，其特征在于：1,4-二硫苏糖醇溶液的浓度为70-120μg/ml，进一步的，所述1,4-二硫苏糖醇的浓度为100μg/ml。
3.根据权利要求2所述的同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，其特征在于：血清样品与1,4-二硫苏糖醇溶液的体积比为3.5-4.5:1。
4.根据权利要求1所述的同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，其特征在于：所述蛋白沉淀剂为甲醇和水的混合液，其中，水的质量百分数为1％-10％。
5.根据权利要求1所述的同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，其特征在于：蛋白沉淀剂中，水的质量百分数为2％。
6.根据权利要求1所述的同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，其特征在于：血清与蛋白沉淀剂的体积比为1:1.2-2。
7.根据权利要求1所述的同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，其特征在于：采用氮气将萃取液吹干。
8.根据权利要求1所述的同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，其特征在于：所述复溶的复溶剂为95％甲醇水溶液。
9.根据权利要求1所述的同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，其特征在于：液相色谱检测条件为：phenomenexkintexc18，30*3mm，2.6μm；流速：0.7ml/min；柱温：40℃；流动相：a：0.1％甲酸 水；b:0.1％甲酸 乙腈 异丙醇，乙腈和异丙醇的体积比为2-3:10-15。
10.根据权利要求1所述的同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，其特征在于：液相色谱的梯度洗脱程序为：0-0.4min，流动相a的体积百分数一直为60％；0.4-1.5min，流动相a的体积百分数由60％逐渐降为40％；1.5-2.5min，流动相a的体积百分数由40％逐渐降为0；2.5-4.5min，流动相a的体积百分数一直为0；4.5-4.51min，流动相a的体积百分数升至60％；4.51-5.0min，流动相a的体积百分数一直为60％。
技术总结本发明公开了一种同时检测多种脂溶性维生素和同型半胱氨酸的方法，包括如下步骤：对血浆样品进行前处理，前处理方法为：向血清样品中加入1,4‑二硫苏糖醇，混匀后，再加入蛋白沉淀剂进行处理；从前处理后的血浆样品中萃取脂溶性维生素和同型半胱氨酸；将萃取液经过吹干、复溶后，上液相色谱质谱联用系统进行进样分析，萃取剂为正己烷。
技术研发人员：丁芬
受保护的技术使用者：丁芬
技术研发日：2020.02.28
技术公布日：2020.06.05
