本发明属中药制剂指纹图谱检测技术领域，尤其涉及一种降糖灵口服液指纹图谱检测方法及其指纹图谱。
背景技术：
降糖灵口服液组方是根据《证治汇补》中的黄芪葛根汤以及明代医家龚廷贤所著《寿世保元》之经典名方麦味地黄丸加减化裁而来，选取多种天然中药材采用现代工艺精心制作而成的中医复方制剂。具有益气养阴、生津止渴、清热泻火、益肾缩尿之功效，临床上用于降血糖、治疗糖尿病。50多年临床应用证明，其与传统中医治疗方针相匹配的处方组成和良好的疗效，使其沿用至今并得到了广大患者的信赖与好评。其组成包括生地黄、黄芪、天冬、天花粉、枸杞子、覆盆子、粉葛、熟地黄、泽泻，现代药理研究证明其含有多种生物活性成分。现有的降糖灵口服液质量标准仅对其主要组成药材之一黄芪进行了定性鉴别，这对于中药成分复杂、其他多种有效成分尚不十分明确的复方中药制剂来说，单纯依靠测定某一有效组成、忽略其他有效成分来进行解决质量检测和确定不同批次间质量差异的问题显然是不全面也不科学的。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种降糖灵口服液指纹图谱检测方法及其指纹图谱，克服了现有降糖灵口服液质量控制技术的不足，使其质量控制更加完善和科学，达到控制降糖灵口服液质量进而监控药品安全生产的目的。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
它包括以下步骤：
（1）混合对照品溶液的制备：
精密称定葛根素10.05mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷10.08mg，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到葛根素贮备液和毛蕊异黄酮葡萄糖苷贮备液；再分别精密量取上述葛根素贮备液1.0ml、毛蕊异黄酮葡萄糖苷贮备液1.0ml，并置于同一10ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得到混合对照品溶液；
（2）供试品溶液的制备：
精密量取降糖灵口服液10.0ml于分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次25ml，合并萃取液，用水饱和正丁醇洗涤两次，每次25ml，弃去洗液，正丁醇液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，滤过，取续滤液过0.45微孔的滤膜，得到供试品溶液；
（3）高效液相色谱条件为：
色谱柱：capcellpakc18mgⅱ，4.6×250mm，5μm；
测定波长：254nm；
柱温：25℃；
进样体积：5µl；
流动相：0.2%磷酸水溶液-甲醇；
流速：1.0ml/min；
采用梯度洗脱方式洗脱50min，梯度洗脱程序见表1：
表1梯度洗脱程序
（4）标准指纹图谱的建立：
将12批降糖灵口服液分别按照上述步骤（2）制成供试品溶液，同时将葛根素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷按照上述步骤（1）制得混合对照品溶液，将制得的12批供试品溶液和混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中，按照上述步骤（3）的高效液相色谱条件进行检测，分别记录50min内混合对照品溶液和这个12批供试品溶液的图谱及数据，并将得到的这些图谱及数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统中进行分析，建立降糖灵口服液的标准指纹图谱；
该标准指纹图谱由12个共有指纹峰构成，且以葛根素作为参照峰即a3号峰，所述12个共有指纹峰的相对保留时间及相对标准偏差如下表2：
表2指纹图谱中12个共有指纹峰的相对保留时间范围及相对标准偏差
（5）待测降糖灵口服液的质量检测：
将待测降糖灵口服液按照上述步骤（2）制成待测供试品溶液，同时将葛根素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷按上述步骤（1）制成混合对照品溶液，将制得的测供试品溶液和混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中，按照上述步骤（3）的高效液相色谱条件进行检测，分别记录50min内测供试品溶液和混合对照品溶液的图谱及数据，将得到的这些图谱及数据与上述步骤（4）建立的标准指纹图谱比较，计算相似度，识别所具有的共同吸收峰的数量，确定相似度。
上述技术方案中，更具体的技术方案还可以是：所述降糖灵口服液是以生地黄、黄芪、天冬、天花粉、枸杞子、覆盆子、粉葛、熟地黄、泽泻为有效成分原料制成的。
进一步的，结合化学计量学分析法对所述降糖灵口服液的质量进行分析。
进一步的，所述化学计量学分析法包括聚类分析法和主成分分析法。
由于采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
1.本发明对降糖灵口服液的质量控制技术做了更加科学和深入的研究，采用目前国际和国内公认的同时具备科学性和实用性的天然植物制品指纹图谱技术，采用高效液相色普法（hplc）并结合化学计量学分析法对降糖灵口服液进行指纹图谱的研究，建立了降糖灵口服液的标准指纹图谱，达到了准确测定不同批次降糖灵口服液所含主要化学成分的种类和数量的目的，进而对其主要有效成分进行科学的鉴别和含量测定，最终科学评价其质量情况。
2.本发明中采用的高效液相色谱检测方法精密度高、重现性良好、稳定性良好，具有一定的专属性。
3.本发明所建立的标准指纹图谱有12个共有峰，信息量大，较完整的保留了供试品溶液中的化学成分。
附图说明
图1是12批降糖灵口服液样品hplc叠加色谱图。
图2是降糖灵口服液标准指纹图谱。
图3是混合对照品色谱图。
图4是12批降糖灵口服液样品聚类分析树状图。
图5是公共因子碎石图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详述：
以下实施例为降糖灵口服液指纹图谱检测方法，以及由该检测方法化学计量学评价降糖灵口服液的质量的方法：
1.仪器与材料
1.1仪器1260高效液相色谱仪（美国agilent公司）；hh-s6数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；synergy超纯水机（美国millipore公司）；kq-500gdv超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；xs-205du型电子分析天平（瑞士mettlertoledo公司）；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。
1.2材料实验所用降糖灵口服液样品来源于中国广西柳州市中医医院，样品信息见表2；葛根素对照品（批号：110752-201615，中国食品药品检定研究院，含量：95.4%），毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号：111920-201606，中国食品药品检定研究院，含量：97.6%）；甲醇、乙腈（色谱纯，默克股份两合公司），水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
表3降糖灵口服液样品信息表
2.方法
2.1色谱条件和系统适应性
色谱柱：capcellpakc18mgⅱ(4.6×250mm，5μm)；测定波长：254nm，柱温：25℃，进样体积：5µl；流动相：含0.2%磷酸水溶液-甲醇（体积流量：1.0ml·min-1）梯度洗脱，洗脱程序见表1；各对照品与其他成分的色谱峰分离度符合要求。
表1梯度洗脱程序
2.2溶液制备
2.2.1混合对照品溶液的配制精密称定葛根素10.05mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷10.08mg，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到葛根素贮备液和毛蕊异黄酮葡萄糖苷贮备液；再分别精密量取上述葛根素贮备液1.0ml、毛蕊异黄酮葡萄糖苷贮备液1.0ml，并置于同一10ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得到混合对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备精密量取降糖灵口服液10.0ml于分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次25ml，合并萃取液，用水饱和正丁醇洗涤两次，每次25ml，弃去洗液，正丁醇液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，滤过，取续滤液过0.45微孔的滤膜，得到供试品溶液。
2.3方法学考察
2.3.1精密度分别精密吸取“2.3.2重复性”项下同一供试品溶液，连续进样6次，测定，记录降糖灵口服液样品hplc图谱及数据，以a3号峰葛根素作为参照峰，计算12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd值。结果显示：12个共有峰的相对保留时间的rsd为0.06～0.0.4%，相对峰面积的rsd为0.3～2.6%，表明仪器的精密度良好。
2.3.2重复性取同一批次降糖灵口服液样品（s1号），平行处理6份，分别进样，测定，记录降糖灵口服液样品hplc图谱及数据，以a3号峰葛根素作为参照峰，计算12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示：6份样品12个共有峰的相对保留时间的rsd为0.02～0.2%，相对峰面积的rsd为0.6～5.7%，表明该实验重复性良好。
2.3.3稳定性分别精密吸取“2.3.2重复性”项下同一供试品溶液，分别于1，2，4，6，8，12h进样，测定，记录降糖灵口服液样品hplc图谱及数据，以a3号峰葛根素作为参照峰，计算12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，12个共有峰的相对保留时间的rsd为0.07～0.5%，相对峰面积的rsd为0.5～4.8%，说明供试品溶液在12h内稳定性良好。
2.4hplc特征指纹图谱（即标准指纹图谱）的建立
2.4.1hplc指纹图谱的生成精密量取表1中的12批降糖灵口服液样品10.0ml，按“2.2.2”项下的方法制备降糖灵口服液供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样5µl进行测定，记录12批降糖灵口服液样品的hplc图谱及数据。将图谱及数据在aglilent化学工作站中生成cdf文件导出，再导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004a版）进行分析，形成这12批降糖灵口服液样品hplc叠加色谱图（见图1）。
2.4.2相似度评价选择s1号降糖灵口服液样品的图谱为参照图谱，以中位数法作为生成对照指纹图谱（sr）的方法，时间窗宽度设定为0.1min，然后进行谱峰识别和谱峰匹配。系统根据降糖灵口服液样品的共有模式，生成降糖灵口服液sr图谱（即降糖灵口服液标准指纹图谱）（见图2），并评价相识度（见表4）。结果表明，12批降糖灵口服液样品与sr图谱的相似度结果均大于0.9，说明各批次降糖灵口服液样品图谱与sr图谱相似度符合hplc指纹图谱技术要求，构建的降糖灵口服液sr图谱（即降糖灵口服液标准指纹图谱）具有一定的代表性。
表4降糖灵口服液hplc指纹图谱相似度评价结果
2.4.3共有峰的指认及相关分析将12批次样品都具有的色谱峰标定作为共有指纹图谱峰，共标定了12个共有峰，见图1。通过与混合对照品的hplc图谱对比，见图3，指认a3为葛根素、a6为毛蕊异黄酮葡萄糖苷。而且葛根素所在指纹图谱中的3号峰，其保留时间适中，分离度良好，峰面积较大且为共有峰，故选用葛根素(a3)作为参照峰。以参照峰的相对保留时间和相对峰面积作为1，分别计算12批降糖灵口服液样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积rsd。结果表明，不同批次的降糖灵口服液样品共有峰相对保留时间的rsd在0.07～0.4％之间，相差较小，结果见表5；而相对峰面积的rsd相差较大，为3.7～26.7%，结果见表6。由此可知，不同批次的降糖灵口服液在化学成分种类上基本一致，但是制剂之间的各种化学成分含量容易受多种因素的影响，不同批次制剂之间质量有一定差异。
表512批降糖灵口服液样品共有峰相对保留时间
表612批降糖灵口服液样品共有峰相对峰面积
2.5化学计量学分析
2.5.1聚类分析以相似度评价所标定的12个共有峰的峰面积为变量，运用spss19.0分析软件对其进行聚类分析。所有数据经过标准化处理，采用组间连接法及平方欧式距离，得样品聚类分析树状图，结果见图4。样品间的分类距离值越大表明样品的差异性越大，当分类距离为10时，12批降糖灵口服液样品被分为3类。其中，s1和s2聚为第1类，s5和s9聚为第2类，其余样品聚为第3类；聚类分析所得到的降糖灵口服液之间的相关性，与相似度评价得到的样品之间的相关性，结果基本一致。
2.5.2主成分分析对12批次降糖灵口服液样品相似度评价所标定的12个共有峰的峰面积做标准化处理后导入spss19.0软件进行主成分分析，最佳主成分以特征根大于1来进行确定，提取了两个主成分。第1主成分（pca1）的初始特征值为8.769，其方差贡献率为73.074%，第2主成分（pca2）的初始特征值为1.808，其方差贡献率为15.068%，且两个主成分的累积方差贡献率大于88.142%，结果见表7。以pca因子为变量绘制公因子碎石图，见图5，从图中可以看出率先提取出来的两个主成分的坡度较为陡峭，说明所提取的两个主成分基本可以代表降糖灵口服液制剂的质量。为了使提取的主成分更加全面、清晰地反映原始数据包含的信息，将因子分析得到的成分矩阵进行正交旋转，得到12个指标在两个主成分中的旋转成分矩阵，见表8，从表中可以看出第1主成分的信息主要来自于色谱峰a5、a3（葛根素）、a4、a7、a6（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）、a8的信息，此类峰的峰面积较大，表示成分含量较高，对降糖灵口服液品质有明显的影响；第2主成分主要来自色谱峰a1、a11的信息。根据旋转成分矩阵可推测葛根素对降糖灵口服液制剂品质有明显的影响，并且影响降糖灵口服液制剂品质差异的并不是单一成分，而是多成分的协同作用的结果。
表7解释的总方差
表8旋转成分矩阵
2.5.3基于主成分分析建立降糖灵口服液质量评价综合模型根据表8结果，以x1、x2代表两个主成分来作为12批降糖灵口服液制样品成分所表达的信息，以其相似度评价所标定的12个共有峰的峰面积为变量，建立其品质评价模型。得到pca1的线性关系表达式为：x1＝－0.174a1＋0.483a2＋0.950a3＋0.916a4＋0.960a5＋0.889a6＋0.919a7＋0.856a8＋0.911a9＋0.777a10＋0.476a11＋0.944a12；pca2的线性关系表达式为：x2＝0.915a1＋0.753a2＋0.274a3＋0.310a4＋0.236a5－0.044a6＋0.162a7＋0.483a8＋0.128a9＋0.258a10＋0.857a11＋0.146a12（注：表达式中各变量非原始峰面积，而是标准化处理后峰面积）。将上述表达式与所对应的两个主成分的方差贡献率作内积后，得到降糖灵口服液质量综合评价函数x（综合得分）的表达式为：x＝（73.074%x1＋15.068%x2）/88.142%，综合得分越高表示制剂的整体质量越好，结果见表9，从表中可以看出批次为s5和s9样品综合得分最高。
表912批降糖灵口服液制主成分得分、综合得分及排名
3.结论
根据以上相似度评价结果显示，不同批次的降糖灵口服液在化学成分种类上基本一致，但含量存在差异，聚类分析将12批不同产地的降糖灵口服液分成3大类，主成分分析结果提示葛根素对降糖灵口服液品质有明显的影响，第2大类降糖灵口服液整体质量最好。综上所述，本发明建立的以相似度评价、聚类分析和主成分分析为核心的化学模式识别方法从不同的侧重角度对不同批次的降糖灵口服液进行质量分析，为其制剂的质量控制提供了科学的评价方法。
1.一种降糖灵口服液指纹图谱检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）混合对照品溶液的制备：
精密称定葛根素10.05mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷10.08mg，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到葛根素贮备液和毛蕊异黄酮葡萄糖苷贮备液；再分别精密量取上述葛根素贮备液1.0ml、毛蕊异黄酮葡萄糖苷贮备液1.0ml，并置于同一10ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得到混合对照品溶液；
（2）供试品溶液的制备：
精密量取降糖灵口服液10.0ml于分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次25ml，合并萃取液，用水饱和正丁醇洗涤两次，每次25ml，弃去洗液，正丁醇液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，滤过，取续滤液过0.45微孔的滤膜，得到供试品溶液；
（3）高效液相色谱条件为：
色谱柱：capcellpakc18mgⅱ，4.6×250mm5μm；
测定波长：254nm；
柱温：25℃；
进样体积：5µl；
流动相：0.2%磷酸水溶液-甲醇；
流速：1.0ml/min；
采用梯度洗脱方式洗脱50min，梯度洗脱程序见表1：
表1梯度洗脱程序
（4）标准指纹图谱的建立：
将12批降糖灵口服液分别按照上述步骤（2）制成供试品溶液，同时将葛根素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷按照上述步骤（1）制得混合对照品溶液，将制得的12批供试品溶液和混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中，按照上述步骤（3）的高效液相色谱条件进行检测，分别记录50min内混合对照品溶液和这个12批供试品溶液的图谱及数据，并将得到的这些图谱及数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统中进行分析，建立降糖灵口服液的标准指纹图谱；
（5）待测降糖灵口服液的质量检测：
将待测降糖灵口服液按照上述步骤（2）制成待测供试品溶液，同时将葛根素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷按上述步骤（1）制成混合对照品溶液，将制得的测供试品溶液和混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中，按照上述步骤（3）的高效液相色谱条件进行检测，分别记录50min内测供试品溶液和混合对照品溶液的图谱及数据，将得到的这些图谱及数据与上述步骤（4）建立的标准指纹图谱比较，计算相似度，识别所具有的共同吸收峰的数量，确定相似度。
2.根据权利要求1所述的降糖灵口服液指纹图谱检测方法，其特征在于：所述降糖灵口服液是以生地黄、黄芪、天冬、天花粉、枸杞子、覆盆子、粉葛、熟地黄、泽泻为有效成分原料制成的。
3.根据权利要求1或2所述的降糖灵口服液指纹图谱检测方法，其特征在于：结合化学计量学分析法对所述降糖灵口服液的质量进行分析。
4.根据权利要求3所述的降糖灵口服液指纹图谱检测方法，其特征在于：所述化学计量学分析法包括聚类分析法和主成分分析法。
5.一种降糖灵口服液指纹图谱，其特征在于：由12个共有指纹峰构成，且以葛根素作为参照峰即a3号峰，所述12个共有指纹峰的相对保留时间及相对标准偏差如下表2：
表2指纹图谱中12个共有指纹峰的相对保留时间范围及相对标准偏差
6.根据权利要求5所述的降糖灵口服液指纹图谱，其特征在于：该降糖灵口服液指纹图谱是由权利要求1步骤（4）建立的降糖灵口服液的标准指纹图谱。
7.根据权利要求5或6所述的降糖灵口服液指纹图谱，其特征在于：所述降糖灵口服液是以生地黄、黄芪、天冬、天花粉、枸杞子、覆盆子、粉葛、熟地黄、泽泻为有效成分原料制成的。
技术总结