一、技术领域：
本发明涉及杂粮中残留物检测技术领域，具体涉及的是分散固相萃取结合液相色谱串联质谱检测增产胺的方法。
二、
背景技术：
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植物生长调节剂可用于调控植物体内的蛋白质、酶与核酸等物质的合成，对植物生长发育过程中的不同阶段如发芽、生根、开花、结果、落叶、休眠和细胞伸长、器官分化、花芽分化等起到调节和控制作用。它们有的能提高植物的维生素、叶绿素等含量，有的能改变其株型，有的可增强植物抗旱、抗寒、抗盐碱与抗病虫害的能力，有的能增产，已被广泛应用于大田作物、经济作物、林木、蔬菜、果树及花卉等各个方面，并获得了显著的效果，但是，植物生长调节剂属于农药，如果过量或不规范使用植物生长调节剂可能使植物快速增长，但对农产品的品质会有一定影响，并且对人体健康产生危害。
绿豆有许多活性组分和膳食纤维，有解暑解毒、改善肠道菌群的功效，对慢性疾病的调节和预防具有治疗潜力和医用价值。但绿豆生产水平普遍较低，为提高绿豆的产量，使用植物生长调节剂喷施作物以提高产量成为一个研究热点课题。植物生长调节剂通过影响植物内源激素系统，达到调节作物生长发育目的，被广泛应用于现代农业生产过程中。
我国关于植物生长调节剂的多残留检测技术和有关限量标准的基础研究还处于发展初期，有些植物生产调节剂的检测国家标准尚未建立。由于食品基质复杂，而植物生长调节剂种类繁多，化学结构和性质各异，且残留水平较低，因此需要采用更有效地样品前处理技术和更为灵敏的检测方法来进行植物生长调节剂残留分析检测。增产胺它是一种性能优异的植物生长调节剂，在许多农业作物上表现出明显的增产作用并且可以提高化肥利用率，增加作物抗逆性，增产胺在众多农作物，比如豆类、马铃薯、玉米、甜菜、小麦和棉花等中均有应用，增产胺化学名称为2-(3，4-二氯苯氧基)三乙胺（dcpta）能通过植物的茎、叶吸收显著地增强植物的光合作用，促进植物生长发育，增强酶的活性，使作物增产增收，提高品质等作用。前期实验研究表明，增产胺对绿豆花荚具有一定的调节作用。但是使用后其残留量目前尚未见报道。因此建立绿豆中增产胺准确、高效的检测方法非常重要，对确保杂粮安全具有重要的现实意义。
由于食品基质非常复杂，影响分析检测的因素较多，气相色谱法和液相色谱法易出现假阳性结果，需进一步确证，hplc法的灵敏度较低。
目前检测杂粮中植物生长调节剂常用的方法有高效液相色谱法、气相色谱法、高效液相色谱串联质谱法、气相色谱串联质谱法等。但在分析过程中，样品的分离、纯化都是必不可少的前处理步骤。样品预处理技术是样品分析过程中关键，传统的样品前处理技术如液液萃取、固相萃取，存在操作繁琐耗时，需要使用大量的对人体和环境有毒或有害的有机溶剂等缺点。因此，建立省时高效、有机溶剂消耗少的样品前处理新技术已成为分析化学领域的研究热点。
三、
技术实现要素：
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本发明的目的是提供分散固相萃取结合液相色谱串联质谱检测增产胺的方法，这种分散固相萃取结合液相色谱串联质谱检测增产胺的方法用于解决现有传统萃取技术使用有机试剂量大的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：这种分散固相萃取结合液相色谱串联质谱检测增产胺的方法包括如下步骤：
一、采用psa gcb为分散固相萃取吸附剂，用于净化绿豆提取液中增产胺，具体为：称取2g绿豆样品至50ml聚四氟乙烯离心管中，然后加入0.2g氯化钠、1g无水硫酸镁、20ml体积比为1:99的醋酸-乙腈溶液，涡流搅拌1min后，以10000r/min离心3min，取上层清液5ml转移到15ml聚四氟乙烯离心管中，加入50mggcb、200mgpsa，斡旋震动3min，10000r/min离心5min，取上清液过0.22μm微孔膜；
二、利用液相色谱串联质谱法对步骤一处理后的绿豆提取液中进行定性定量分析，检测绿豆提取液中增产胺。
上述方案中液相色谱串联质谱法分析时：安捷伦c18液相色谱柱；流动相a为体积比为0.2%的甲酸和甲醇的混合物，流动相b为体积比为0.2%的甲酸和水的混合物，流速为0.25mlmin-1，等度洗脱：20%a-80%b，柱温30℃，进样量5μl；鞘气流速为11.0lmin-1，鞘气温度为250℃，毛细管电压为3500v，气化温度为300℃。
有益效果：
1、本发明建立了绿豆样品中增产胺的uhplc-ms/ms分析方法，样品采用分散固相萃取前处理技术，经酸化乙腈提取，psa和gcb联合净化，该方法满足绿豆中植物生长调节剂分析的要求，准确度高，同时具有方便、快捷、省时、净化效果好、灵敏度高的特点，可用于杂粮中的植物生长调节剂残留检测。
2、本发明采用分散固相萃取技术，克服了传统固相萃取操作繁琐、费时、需消耗大量有毒有害溶剂、易对环境产生污染等缺点，具有消耗溶剂少、操作简便、快速、易与各种分析仪器联用等优点，展现出了广阔的应用前景。
3、本发明中uhplc-ms/ms结合了液相色谱仪高的选择性、分离能力与质谱仪很强的组分鉴定能力，是一种分离分析复杂有机混合物超痕量分析的有效手段。
4、本发明将石墨化炭黑（gcb） n-丙基乙二胺（psa）7应用于对增产胺吸附，采用gcb psa为分散固相萃取吸附剂，结合uhplc-ms/ms，建立了绿豆中增产胺的检测方法，精密度高、重复性好，回收率高，完善了植物生长调节剂的安全监控手段，为我国粮食安全生产提供技术支撑。
四、附图说明:
图1增产胺标准溶液离子流图。
图2增产胺二级质谱图。
五、具体实施方式：
这种分散固相萃取结合液相色谱串联质谱检测增产胺的方法，利用psa gcb为分散固相萃取吸附剂，用于净化绿豆提取液中增产胺，净化绿豆样品提取液后，采用uhplc-ms/ms对其进行定性、定量分析。前处理步骤包括称量、涡旋、离心、浓缩步骤；仪器分析包括利用uhplc-ms/ms对目标化合物进行进行定性定量分析，具体如下：
一、采用psa gcb为分散固相萃取吸附剂，用于净化绿豆提取液中增产胺，具体为：称取2g绿豆样品至50ml聚四氟乙烯离心管中，然后加入0.2g氯化钠、1g无水硫酸镁、20ml体积比为1:99的醋酸-乙腈溶液，利用涡旋混合器涡流搅拌1min后，再利用转速不低于10000r/min的高速冷冻离心机，以10000r/min离心3min，取上层清液5ml转移到15mlptfe(聚四氟乙烯)离心管中，加入50mggcb、200mgpsa，斡旋震动3min，10000r/min离心5min，取上清液过0.22µm的有机相微孔滤膜；分散固相萃取是基于固相萃取发展起来一种样品预处理技术，主要用于样品的分离和富集，与传统的固相萃取法相比较，可以有效的将分析物与干扰组分分离，提高分析物的回收率，减少样品预处理过程，操作简单、省时、省力。
通过大量实验及研究得到：一是采用醋酸-乙腈溶液（1:99，v/v）为提取溶剂，增产胺的回收率最高，另外，实验还发现使用乙腈作为提取溶剂时，基质干扰物明显少。二是，当提取剂达到20ml后，继续增加提取剂体积回收率变化不大，这是因为20ml提取剂基本达到萃取平衡，故增大提取剂体积，回收率没有明显变化。三是，gcb可去除提取液中的色素，但gcb用量过量，目标化合物的回收率逐渐降低，这是因为目标化合物含有氮原子易带正电荷，而gcb表面带负电容易吸附目标化合物，故gcb最佳用量为50mg，psa为200mg，净化效果较好且回收率满足要求。
二、利用液相色谱串联质谱法对步骤一处理后的绿豆提取液中进行定性定量分析，检测绿豆提取液中增产胺；
液相色谱质谱仪：agilentc18（50mm×2.1mm,1.8µm）；流动相（a）为甲酸和甲醇的混合物（0.2%，v/v），流动相（b）为甲酸和水的混合物（0.2%，v/v）。流速为0.25mlmin-1，等度洗脱：20%a-80%b，柱温30℃，进样量5μl；鞘气流速为11.0lmin-1，鞘气温度为250℃，毛细管电压为3500v，气化温度为300℃。
表1增产胺质谱检测参数和保留时间
试验验证：
1、绘制标准曲线：
本实验最终采用纯溶剂配制标准工作溶液，在优化的色谱和质谱条件下进行分析，以峰面积（ｙ）对浓度（ｃ）绘制基质校准曲线，以定量离子对色谱峰信噪比s/n≥3对应的最低浓度为样品的检出限(lod)，s/n≥10对应的最低浓度为定量限(loq)，得到增产胺的lod和loq见表2。
表2方法的线性范围、线性方程、r、lod和loq
2、加标回收及精密度验证：
为了进一步评估该方法的准确度和精密度，对阴性绿豆样品进行了加标回收实验。每种化合物添加３个浓度水平，每个水平做６个平行样品，然后按本文建立的样品前处理方法、最优色谱和质谱条件下，标准溶液外标法测定，平均回收率和相对标准偏差（rsd）见表3。增产胺在３个添加水平的平均回收率在93.8-103.4%之间，rsd小于6.2%，表明方法具有良好的准确度和精密度。
表3绿豆加标样品平均回收率和精密度结果(n=6)
试验结论：
本发明建立了绿豆样品中增产胺的uhplc-ms/ms分析方法，样品采用分散固相萃取前处理技术，经酸化乙腈提取，psa和gcb联合净化。通过考察方法的线性范围、检出限、定量限、加标回收率及相对标准偏差。结果表明，该方法满足绿豆中植物生长调节剂分析的要求，同时具有方便、快捷、省时、净化效果好、灵敏度高的特点，可用于杂粮中的植物生长调节剂残留检测。
1.一种分散固相萃取结合液相色谱串联质谱检测增产胺的方法，其特征在于包括如下步骤：
一、采用psa gcb为分散固相萃取吸附剂，用于净化绿豆提取液中增产胺，具体为：称取2g绿豆样品至50ml聚四氟乙烯离心管中，然后加入0.2g氯化钠、1g无水硫酸镁、20ml体积比为1:99的醋酸-乙腈溶液，涡流搅拌1min后，以10000r/min离心3min，取上层清液5ml转移到15ml聚四氟乙烯离心管中，加入50mggcb、200mgpsa，斡旋震动3min，10000r/min离心5min，取上清液过0.22μm微孔膜；
二、利用液相色谱串联质谱法对步骤一处理后的绿豆提取液中进行定性定量分析，检测绿豆提取液中增产胺。
2.根据权利要求1所述的分散固相萃取结合液相色谱串联质谱检测增产胺的方法，其特征在于：所述液相色谱串联质谱法分析时：安捷伦c18液相色谱柱；流动相a为体积比为0.2%的甲酸和甲醇的混合物，流动相b为体积比为0.2%的甲酸和水的混合物，流速为0.25mlmin-1，等度洗脱：20%a-80%b，柱温30℃，进样量5μl；鞘气流速为11.0lmin-1，鞘气温度为250℃，毛细管电压为3500v，气化温度为300℃。
技术总结