本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种分离测定帕博西尼及其杂质的方法。
背景技术：
帕博西尼是一种高选择性的细胞周期蛋白依赖性激酶cdk4和cdk6可逆性拮抗剂。通过抑制cdk4/6阻断细胞周期从g1期到s期的进程，从而抑制dna合成。临床前研究数据表明，帕博西尼可能具有肿瘤细胞减灭及抑制细胞生长作用，是新型乳腺癌药物。帕博西尼的分子式为c24h29n7o2，化学名为：6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-[[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基]氨基]-8h-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮，结构式如式(a)所示
在合成该化合物的过程中，有几步重要的中间体和未知杂质可能会由于去除不完全而影响药物的纯度和质量，这些已知中间体和未知杂质以及产生的降解产物即为药物质量控制中通常所说的有关物质(即杂质)。对于帕博西尼的合成主要控制的已知杂质有十二个，分别是：杂质sm1、杂质sm2、杂质a1、杂质z7、杂质z8、杂质z12、杂质z16、杂质z21、杂质z23、杂质z25、杂质z26、杂质z29，结构式分别如式(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)所示
可见，帕博西尼的杂质较多，且结构类似，给分离带来难度。此外，各杂质的极性各不相同，在满足帕博西尼与各杂质分离的前提下，还要满足杂质与杂质之间的分离，导致检测难度较大。采用常规的检测手段方法难以实现帕博西尼与杂质以及杂质与杂质之间的有效分离，严重影响帕博西尼及其制剂的质量控制。
为了准确地控制帕博西尼及其制剂产品的质量，有必要研究一种能简单、快速、准确地分离检测出帕博西尼及其制剂有关物质的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种分离测定帕博西尼及其杂质的方法，其操作简单、方便，可有效分离测定帕博西尼及其杂质，有效控制帕博西尼及其产品的质量。
本发明的技术方案是：一种分离测定帕博西尼及其杂质的方法，具有以下步骤，
1)制备试样溶液
取帕博西尼或含有帕博西尼的制剂，加稀释剂溶解，得到浓度为0.1-10mg/ml的试样溶液；
2)制备对照溶液
取步骤1)得到的试样溶液，加稀释剂稀释50-1000倍，得到对照溶液；
3)采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，设置流动相的流速为0.8-1.2ml/min，所述流动相由流动相a和流动相b组成，流动相a为浓度是0.0001-1.0mol/l的缓冲溶液，缓冲溶液中添加磷酸调节ph值为1-5，流动相b为甲醇，流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相a的体积百分数为88％～92％，流动相b的体积百分数为8％～12％；0分钟至5分钟，流动相a的体积百分数为88％～92％，流动相b的体积百分数为8％～12％；5分钟至10分钟，流动相a的体积百分数线性减少至58％～62％，流动相b的体积百分数线性增加至38％～42％；10分钟至40分钟，流动相a的体积百分数线性减少至23％～27％，流动相b的体积百分数线性增加至73％～77％；40分钟至45分钟，流动相a的体积百分数线性减少至8％～12％，流动相b的体积百分数线性增加至88％～92％；45分钟至65分钟，流动相a的体积百分数为8％～12％，流动相b的体积百分数为88％～92％，65分钟至66分钟，流动相a的体积百分数线性增加至88％-92％，流动相b的体积百分数线性减少至8％-12％，66分钟至75分钟，流动相a的体积百分数为88％-92％，流动相b的体积百分数为8％-12％；
4)分别向高效液相色谱仪进样等体积的步骤1)试样溶液、步骤2)对照溶液，进样量为5μl-100μl，利用200nm至280nm波长检测，记录色谱图，完成试样溶液中杂质的分离测定。
进一步的，步骤1)、步骤2)所述稀释剂为甲醇和缓冲溶液的混合物，甲醇与缓冲溶液的体积比为25-55：45-75。
优选的，甲醇与缓冲溶液的体积比为40：60。
进一步的，所述缓冲溶液为磷酸、或磷酸盐溶液或两者的混合物，磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二胺或任意混合。
步骤3)中流动相a为浓度是0.001-0.01mol/l。
步骤3)所述缓冲溶液为磷酸、或磷酸盐溶液或两者的混合物，磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二胺或任意混合，缓冲溶液的ph值为2.0-3.5。
步骤3)流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相a的体积百分数为90％，流动相b的体积百分数为10％；0分钟至5分钟，流动相a的体积百分数为90％，流动相b的体积百分数为10％；5分钟至10分钟，流动相a的体积百分数线性减少至60％，流动相b的体积百分数线性增加至40％；10分钟至40分钟，流动相a的体积百分数线性减少至25％，流动相b的体积百分数线性增加至75％；40分钟至45分钟，流动相a的体积百分数线性减少至10％，流动相b的体积百分数线性增加至90％；45分钟至65分钟，流动相a的体积百分数为10％，流动相b的体积百分数为90％，65分钟至66分钟，流动相a的体积百分数线性增加至90％，流动相b的体积百分数线性减少至10％，66分钟至75分钟，流动相a的体积百分数为90％，流动相b的体积百分数为10％。
步骤4)进样时，进样量为10μl，利用220nm波长检测，色谱柱的柱温为20-40℃。
色谱柱的柱温为30℃。
采用上述技术方案具有以下有益效果：
1、本发明分离测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，采用梯度洗脱方式，确保能够使帕博西尼与杂质、杂质与杂质之间得到有效分离；流动相a中用磷酸调ph值至1-5，有效改善了杂质的峰形，可以增强保留，改善分离度，确保色谱峰的良好对称性和较高的柱效。选用甲醇与缓冲溶液混合液作为稀释剂溶解样品，排除了溶剂峰的干扰和溶剂效应。
2、本发明分离测定方法采用流动相a(缓冲溶液 磷酸调节ph)、流动相b(甲醇)梯度洗脱方式测定帕博西尼及其制剂的杂质，避免了传统的流动相采用一种有机相不能完全分离极性相似的杂质，可以有效将帕博西尼与已知杂质和未知杂质进行有效分离和测定，解决了分离测定帕博西尼与其杂质难分离的问题，从而保证了帕博西尼及其制剂的质量可控。
3、本发明分离测定方法使用的稀释剂不干扰杂质测定，专属性强；各杂质灵敏度均符合要求。按加校正因子的自身对照法计算杂质含量，主峰与相邻杂质及相邻杂质间分离度均符合要求。本品及各杂质最小检测限为0.0013％，表明大于0.0013％的杂质均能被检出，准确度较高。
下面结合附图和具体实施方式作进一步的说明。
附图说明
图1为实施例一甲醇-缓冲溶液混合液的液相色谱图；
图2为实施例一混合对照溶液的液相色谱图；
图3为实施例二试样溶液的液相色谱图；
图4为实施例二对照溶液的液相色谱图；
图5为实施例三试样溶液的液相色谱图；
图6为实施例三对照溶液的液相色谱图；
图7为实施例三空白辅料供试液的液相色谱图。
具体实施方式
仪器与条件
高效液相色谱仪选用agilent1260型液相色谱仪及化学工作站，设置为自动进样。以zorbaxeclipseplusc18柱(5μm，250×4.6mm)为分离色谱柱。紫外检测器波长：220nm。流动相：以0.025mol/l磷酸二氢钾溶液(1000ml磷酸二氢钾溶液用磷酸调为ph值为3.0)为流动相a，以甲醇为流动相b，进行梯度洗脱：0分钟，流动相a的体积百分数为90％，流动相b的体积百分数为10％；0分钟至5分钟，流动相a的体积百分数为90％，流动相b的体积百分数为10％；5分钟至10分钟，流动相a的体积百分数线性减少至60％，流动相b的体积百分数线性增加至40％；10分钟至40分钟，流动相a的体积百分数线性减少至25％，流动相b的体积百分数线性增加至75％；40分钟至45分钟，流动相a的体积百分数线性减少至10％，流动相b的体积百分数线性增加至90％；45分钟至65分钟，流动相a的体积百分数为10％，流动相b的体积百分数为90％；65分钟至66分钟，流动相a的体积百分数线性增加至90％，流动相b的体积百分数线性减少至10％；66分钟至75分钟，流动相a的体积百分数为90％，流动相b的体积百分数为10％。柱温为30℃，流速：1.0ml/min。进样体积为10μl。
实施例一：
分别取杂质sm1、杂质sm2、杂质a1、杂质z7、杂质z8、杂质z12、杂质z16、杂质z21、杂质z23、杂质z25、杂质z26、杂质z29(各杂质的纯度均在95％以上)各25mg，精密称量，置于25ml量瓶中，加甲醇-缓冲溶液(体积比为40：60)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备液；取帕博西尼约20mg，精密称定，置于25ml量瓶中，精密加入杂质贮备液0.25ml，加甲醇-缓冲溶液(体积比为40：60)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照溶液。
分别取稀释剂甲醇-缓冲溶液(体积比为40：60)、混合对照溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图，结果如图1、图2所示。
图1表明，甲醇-缓冲溶液的混合物及色谱系统不干扰测定。
图2中依次出峰的顺序是杂质z8、杂质z16、杂质z12、杂质sm2、杂质z26、杂质z21、帕博西尼、杂质z23、杂质z29、杂质z7、杂质sm1、杂质z25、杂质a1。图2表明，本发明分离测定方法可以有效分离帕博西尼中可能存在的未知结构的杂质和已知结构的杂质，且各杂质检测灵敏度均能符合要求，主峰与相邻杂质及各杂质间的分离度均符合要求，即本方法可以用于帕博西尼及其制剂的杂质的测定。
实施例二帕博西尼原料药(由重庆三圣实业股份有限公司提供)的测定
取帕博西尼20mg，精密称定，置于25ml量瓶中，加甲醇-缓冲溶液(体积比为40：60)超声处理溶解并稀释至刻度，摇匀，作为试样溶液；精密量取试样溶液1.0ml，置于100ml量瓶，用甲醇-缓冲溶液(体积比为40：60)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；按实施例一的色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图。试样溶液的色谱图中如有杂质峰(除溶剂峰外)，按加校正因子的自身对照法计算杂质含量。结果如图3、图4所示。检测结果如表1：
表1帕博西尼有关物质检测结果
实施例三帕博西尼胶囊(由重庆三圣实业股份有限公司提供)的测定
取帕博西尼胶囊适量(约相当于帕博西尼20mg)，置于25ml量瓶中，加甲醇-缓冲溶液(体积比为40：60)超声处理溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为试样溶液；精密量取试样溶液1.0ml，置于100ml量瓶，用甲醇-缓冲溶液(体积比为40：60)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另按帕博西尼胶囊处方比例取空白辅料适量，照试样溶液相同的方法制备空白辅料供试液；按实施例一的色谱条件进行液相色谱分析。记录色谱图，结果如图5、图6、图7所示。采用加校正因子的自身对照法计算试品中各异构体杂质含量，检测结果如表2：
表2帕博西尼胶囊有关物质检测结果
1.一种分离测定帕博西尼及其杂质的方法，其特征在于，具有以下步骤，
1)制备试样溶液
取帕博西尼或含有帕博西尼的制剂，加稀释剂溶解，得到浓度为0.1-10mg/ml的试样溶液；
2)制备对照溶液
取步骤1)得到的试样溶液，加稀释剂稀释50-1000倍，得到对照溶液；
3)采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，设置流动相的流速为0.8-1.2ml/min，所述流动相由流动相a和流动相b组成，流动相a为浓度是0.0001-1.0mol/l的缓冲溶液，缓冲溶液中添加磷酸调节ph值为1-5，流动相b为甲醇，流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相a的体积百分数为88％～92％，流动相b的体积百分数为8％～12％；0分钟至5分钟，流动相a的体积百分数为88％～92％，流动相b的体积百分数为8％～12％；5分钟至10分钟，流动相a的体积百分数线性减少至58％～62％，流动相b的体积百分数线性增加至38％～42％；10分钟至40分钟，流动相a的体积百分数线性减少至23％～27％，流动相b的体积百分数线性增加至73％～77％；40分钟至45分钟，流动相a的体积百分数线性减少至8％～12％，流动相b的体积百分数线性增加至88％～92％；45分钟至65分钟，流动相a的体积百分数为8％～12％，流动相b的体积百分数为88％～92％，65分钟至66分钟，流动相a的体积百分数线性增加至88％-92％，流动相b的体积百分数线性减少至8％-12％，66分钟至75分钟，流动相a的体积百分数为88％-92％，流动相b的体积百分数为8％-12％；
4)分别向高效液相色谱仪进样等体积的步骤1)试样溶液、步骤2)对照溶液，进样量为5μl-100μl，利用200nm至280nm波长检测，记录色谱图，完成试样溶液中杂质的分离测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)、步骤2)所述稀释剂为甲醇和缓冲溶液的混合物，甲醇与缓冲溶液的体积比为25-55：45-75。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，甲醇与缓冲溶液的体积比为40：60。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸、或磷酸盐溶液或两者的混合物，磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二胺或任意混合。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中流动相a为浓度是0.001-0.01mol/l。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述缓冲溶液为磷酸、或磷酸盐溶液或两者的混合物，磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二胺或任意混合，缓冲溶液的ph值为2.0-3.5。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相a的体积百分数为90％，流动相b的体积百分数为10％；0分钟至5分钟，流动相a的体积百分数为90％，流动相b的体积百分数为10％；5分钟至10分钟，流动相a的体积百分数线性减少至60％，流动相b的体积百分数线性增加至40％；10分钟至40分钟，流动相a的体积百分数线性减少至25％，流动相b的体积百分数线性增加至75％；40分钟至45分钟，流动相a的体积百分数线性减少至10％，流动相b的体积百分数线性增加至90％；45分钟至65分钟，流动相a的体积百分数为10％，流动相b的体积百分数为90％，65分钟至66分钟，流动相a的体积百分数线性增加至90％，流动相b的体积百分数线性减少至10％，66分钟至75分钟，流动相a的体积百分数为90％，流动相b的体积百分数为10％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)进样时，进样量为10μl，利用220nm波长检测，色谱柱的柱温为20-40℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，色谱柱的柱温为30℃。
技术总结