本发明属于分析化学领域，具体涉及一种检测叶酸中杂质d含量的高效液相分析方法。
背景技术：
叶酸是一种水溶性b族维生素，是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。在体内叶酸以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸在体内参与嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和转化。叶酸在制造核酸(核糖核酸、脱氧核糖核酸)上扮演重要的角色。叶酸帮助蛋白质的代谢，并与维生素b12共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红血球不可缺少的物质。叶酸也作为干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)及其它微生物的促进增殖因子而起作用。人体缺少叶酸可导致红血球的异常，未成熟细胞的增加，贫血以及白血球减少。叶酸是胎儿生长发育不可缺少的营养素。孕妇缺乏叶酸有可能导致胎儿出生时出现低体重、唇腭裂、心脏缺陷等。叶酸杂质d(蝶酸)是叶酸的降解杂质，叶酸与叶酸杂质d的结构式如下：
在中国药典2015年版二部、ep9.8、bp2019叶酸质量标准有关物质检查项下，有叶酸杂质d(蝶酸)的检查方法，但对于含有叶酸的制剂或含有叶酸及其他维生素成分的复方制剂，上述方法并不适用。专利cn109239230a公开了一种采用高效液相色谱分析多种维生素制剂的杂质方法，杂质选自叶酸杂质a、叶酸杂质d、对氨基苯甲酸及3-氨基丙醇中的至少一种，但此方法在样品配制过程中需要加入衍生化试剂在线衍生，操作繁琐，耗费时间长，所采用的液相色谱条件为柱切换法，使用预处理柱与分析柱两个色谱柱，该方法可检出13种多种维生素制剂中以上所述杂质，但对于其他多种维生素，特别是12种多种维生素制剂，专属性不一定好。在吴宏富等公开的参考文献“高效液相色谱法测定叶酸片的含量与有关物质”中描述的有关物质检查方法并未对叶酸杂质d进行单独控制，仅检验总杂质含量。
技术实现要素：
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为解决上述问题，本发明提供一种检测叶酸原料以及含有叶酸原料的维生素制剂，特别是12种维生素制剂中叶酸杂质d含量的方法，本申请的技术方案如下：
一种检测叶酸杂质d含量的分析方法，该方法采用高效液相色谱仪测定，其色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相a：磷酸盐缓冲溶液-甲醇；
流动相b：甲醇；
流速：0.8-1.2ml/min；
柱温：25-40℃；
检测波长：280-300nm；
进样量：20μl；
流动相a、b按梯度程序进行。
其中，优选的色谱柱为inertsilods-3，250mm×4.6mm，5μm或效能相当的色谱柱；
优选的，流动相a中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/l-0.1mol/l，ph值为2.0～6.0，磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠等磷酸盐中的一种；磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为75～100：25～0。
优选的，磷酸盐中还含有离子对试剂，该离子对试剂为庚烷磺酸钠离子对或与庚烷磺酸钠作用类似的己烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等磺酸钠离子对试剂，离子对试剂的浓度为1g/l-4g/l。
优选的流速为1.0ml/min
优选的柱温为35℃；
优选的检测波长为298nm；
进样梯度洗脱程序为：
该方法可用于检测叶酸原料或含有叶酸原料的维生素制剂如注射用多种维生素(12)中叶酸杂质d的含量，从而进行原料及制剂中叶酸杂质d含量的质量控制。
本发明产生的有益效果：
1)通过使用高效液相色谱仪的技术，提供了一种检测叶酸中杂质d含量的方法，耗材易得、准确度、灵敏度高、操作简单、专属性好。
2)经过检测，叶酸杂质d定量限为1.652ng，检测限为0.496ng，表明该法检测灵敏度较高。
3)叶酸杂质d在0.0826μg/ml～1.6520μg/ml浓度范围内，线性回归方程为a＝117436c-3657，相关系数为0.9994，线性关系良好。
4)在样品中加入已知量的叶酸杂质d对照品，测得的平均回收率为98.34％，符合可接受标准，说明该方法准确度良好。
附图说明：
图1是实施例2中叶酸杂质d的标准曲线图；
图2是实施例5中检测待测样品的色谱图。
具体实施方式：
实施例1检测限和定量限的检测
步骤(1)取叶酸杂质d对照品约4mg，精密称定，置50ml量瓶中，加28.6mg/ml的碳酸钠溶液4ml使溶解，加水稀释至刻度，摇匀；
步骤(2)精密量取步骤(1)中的溶液1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；
步骤(3)精密量取步骤(2)中的溶液，加水逐步稀释，精密量取稀释后溶液20μl，注入液相色谱仪，信噪比s/n约为10:1时叶酸杂质d的浓度，作为定量限，为0.0826μg/ml；
步骤(4)精密量取步骤(2)中的溶液，加水逐步稀释，精密量取稀释后溶液20μl，注入液相色谱仪，信噪比s/n约为3:1时叶酸杂质d的浓度，作为定量限，为0.0248μg/ml；
实施例2标准曲线的测定
步骤(1)取叶酸杂质d对照品约4mg，精密称定，置50ml量瓶中，加28.6mg/ml的碳酸钠溶液4ml使溶解，加水稀释至刻度，摇匀；
步骤(2)精密量取步骤(1)中的溶液1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；
步骤(3)精密量取步骤(2)中的溶液1ml、2.5ml、4ml、5ml、6ml和8ml，分置于10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别作为20％、50％、80％、100％、120％、160％线性溶液，摇匀，即得；分别精密量取上述线性溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度c(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，见说明书附图的图1，线性方程为a＝117436c-3657，相关系数r为0.9994。
实施例3回收率的测定
步骤(1)取叶酸杂质d对照品适量，精密称定，加28.6mg/ml的碳酸钠溶液适量使溶解，加水定量稀释制成每1ml中约含杂质d0.8μg的溶液，摇匀，作为叶酸杂质d对照品溶液；
步骤(2)取本品约740mg，精密称定，置5ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
步骤(3)取叶酸杂质d适量，精密称定，加28.6mg/ml的碳酸钠溶液适量使溶解，加水定量稀释制成每1ml中约含杂质d0.6μg、0.8μg和1.0μg的溶液，摇匀，分别作为杂质d对照品溶液a、杂质d对照品溶液b和杂质d对照品溶液c。
步骤(4)取注射用多种维生素(12)约740mg，精密称定，共三份，分别置不同5ml量瓶中，分别加杂质d对照品溶液a、杂质d对照品溶液b、杂质d对照品溶液c稀释至刻度，摇匀，分别作为80％、100％、120％样品溶液，各浓度水平平行制备三份；
步骤(5)精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法，以峰面积计算供试品中叶酸杂质d的含量，以测得量与原有量之差与加入量的比值计算回收率，结果如下表：
实施例4叶酸原料中叶酸杂质d含量的测定
步骤1、溶液的配制
对照品溶液的配制：取叶酸杂质d对照品适量，精密称定，加28.6mg/ml的碳酸钠溶液适量使溶解，加水定量稀释制成每1ml中约含杂质d0.8μg的溶液，摇匀，即得。
供试品溶液的配制：取叶酸原料约414mg，精密称定，置5ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
步骤2、液相色谱条件为：
色谱柱：inertsilods-3，250mm×4.6mm，5μm或效能相当的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相a：磷酸盐缓冲溶液-甲醇；磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/l-0.1mol/l，ph值为2.0～6.0，磷酸盐与甲醇的比例为75～100：25～0；
磷酸盐中还可以含有离子对试剂，离子对试剂为庚烷磺酸钠离子对或与庚烷磺酸钠作用类似的己烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等磺酸钠离子对试剂，离子对试剂的浓度为1g/l-4g/l。
流动相b：甲醇；
流速：0.8-1.2ml/min；
柱温：25-40℃；
检测波长：280-300nm；
进样量：20μl；
流动相a、b按梯度程序进行。
精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法，以峰面积计算，供试品溶液中叶酸杂质d的含量为0.03％。
实施例5注射用多种维生素(12)中叶酸杂质d含量的测定(该制剂含有维生素d3、消旋α-生育酚、维生素a棕榈酸酯、维生素c、四水合辅羧酶、右泛醇、烟酰胺、维生素b6、核黄素磷酸钠、叶酸、生物素、维生素b12、甘氨胆酸、大豆磷脂酰胆碱、甘氨酸、盐酸/氢氧化钠适量)
步骤1、溶液的配制
对照品溶液的配制：取叶酸杂质d对照品适量，精密称定，加28.6mg/ml的碳酸钠溶液适量使溶解，加水定量稀释制成每1ml中约含杂质d0.8μg的溶液，摇匀，即得。
供试品溶液的配制：取本品约740mg，精密称定，置5ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
步骤2、液相色谱条件为：
色谱柱：inertsilods-3，250mm×4.6mm，5μm或效能相当的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相a：磷酸盐缓冲溶液-甲醇；磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/l-0.1mol/l，ph值为2.0～6.0，磷酸盐与甲醇的比例为75～100：25～0；
磷酸盐中还可以含有离子对试剂，离子对试剂为庚烷磺酸钠离子对或与庚烷磺酸钠作用类似的己烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等磺酸钠离子对试剂，离子对试剂的浓度为1g/l-4g/l；
流动相b：甲醇；
流速：0.8-1.2ml/min；
柱温：25-40℃；
检测波长：280-300nm；
进样量：20μl；
流动相a、b按梯度程序进行。
精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，见说明书附图2。按外标法，以峰面积计算，供试品溶液中叶酸杂质d的含量为0.05％。
1.一种采用高效液相色谱仪检测叶酸杂质d含量的方法，其特征在于，色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相a：磷酸盐缓冲溶液-甲醇；
流动相b：甲醇；
流速：0.8-1.2ml/min；
柱温：25-40℃；
检测波长：280-300nm；
进样量：20μl；
流动相a、b按梯度程序进行；
所述杂质d的结构式为
2.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱仪检测叶酸杂质d含量的方法，其特征在于，所述色谱柱为inertsilods-3，250mm×4.6mm，5μm或效能相当的色谱柱。
3.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱仪检测叶酸杂质d含量的方法，其特征在于，所述流动相a中磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠等磷酸盐中的一种，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/l-0.1mol/l，ph值为2.0～6.0；磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为75～100：25～0。
4.根据权利要求3所述的采用高效液相色谱仪检测叶酸杂质d含量的方法，其特征在于，所述磷酸盐中还含有离子对试剂，该离子对试剂为庚烷磺酸钠离子对或与庚烷磺酸钠作用类似的己烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等磺酸钠离子对试剂，离子对试剂的浓度为1g/l-4g/l。
5.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱仪检测叶酸杂质d含量的方法，其特征在于，所述流速为1.0ml/min；所述柱温为35℃；所述检测波长为298nm；进样梯度洗脱程序为：
6.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱仪检测叶酸杂质d含量的方法，其特征在于，用于检测叶酸原料中杂质d的含量。
7.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱仪检测叶酸杂质d含量的方法，其特征在于，用于检测注射用多种维生素(12)中杂质d的含量。
技术总结