本发明涉及细胞分离技术领域，具体而言，尤其涉及一种双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置及方法。
背景技术：
在癌症检测、生物医学等领域，对于实现对人体外周血中细胞的分离的方法的研究，很有理论价值和应用前景。
库尔特电阻脉冲计数法是一种对颗粒和细胞进行检测、计数和尺寸判定的有效方法，近年来随着微流控芯片加工技术的快速发展，目前已有许多在微流控芯片上利用库尔特原理对微纳颗粒、血细胞、细菌和病毒等进行计数的研究报道。
目前常用的人体外周血中循环肿瘤细胞分离的方法包括如下几种：
密度梯度离心法：即依据不同细胞沉降系数的不同来进行分离，将全血平铺于密度梯度离心液上，各个成分被依次分离，但此方法存在分离出的循环肿瘤细胞与其他细胞混合的情况，与此同时，该分离方法的需血量过多，达到15～35ml。
过滤法：即通过细胞大小的不同直接用过滤的方法分离循环肿瘤细胞，但此方法富集到的细胞数过少，平均1ml血液只能获取1～2个ctc，获取效率太低。
cellsearch技术：该技术由强生公司麾下的veridex公司开发，该技术通过ctc特异性抗体抗epcam(上皮细胞粘附因子)富集上皮细胞内的ctc，再进一步使用结合荧光染料的抗-cd45和抗-细胞角蛋白(ck)8，18/19与细胞和dapi荧光染色试剂共同识别ctc，但这种方法缺点是富集效果不够好，操作过程繁复。
值得注意的是，上述几种办法关注的问题是ctc的富集与分离，都是在较大的尺度上进行循环肿瘤细胞检测，与此同时，双液相分离技术作为较常见的手段也常在实验室中出现，并用于各种实验。传统的双液相实验大多是依靠两液相之间互不相溶的特点进行萃取等操作，或者是在两液相形成的界面上进行电泳实验，但在两液相间做细胞分离的实验确是对其的崭新的利用。当前循环肿瘤细胞检测在市面上大多使用的是美国强生集团的cellsearch系统来对人体外周血进行富集纯化，其使用的循环肿瘤细胞特异性磁珠造价昂贵，检测费用极高，且样品需求大，检测成本较高。
技术实现要素：
根据上述提出的技术问题，而提供一种双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置及方法。本发明在较小的尺度进行人体外周血中的循环肿瘤细胞的分离与检测，所需样品较少，并且，双液相外周血中循环肿瘤细胞分离方法和装置只需要1ml人体外周血，且使用了造价更加低的白细胞特异性磁珠对白细胞进行结合，而不是对循环肿瘤细胞进行结合，在不浪费细胞的同时最大限度地提升分离的效果，分离时间也大大缩短。
本发明采用的技术手段如下：
一种双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置，包括：有机玻璃样品池；有机玻璃样品池的上端开设有开口供溶液滴入，有机玻璃样品池的中部垂直设置有计数板，计数板两侧各有一个铂电极，计数板中央设置有一个贯通的检测门，有机玻璃样品池的底部设置有与样品池底部等面积的电磁铁；
检测时，有机玻璃样品池中的下层液体为葡聚糖溶液，上层液体为预处理后的外周血；癌细胞位于葡聚糖溶液界面上，通过所述铂电极施加直流电场后，癌细胞沿界面运动通过检测门被检测和计数。
进一步地，所述的铂电极一个固定在计数板上，另外一个固定在样品池内壁，铂电极垂直方向穿过有机玻璃样品池中的上层液体和下层液体。
进一步地，所述计数板的厚度为30-50μm，上端露出上层液体液面，下端距离样品池下部2-3mm。
进一步地，所述检测门位于计数板中央，且垂直于样品池下表面，其宽度为30μm，长度为1-2cm，检测门上下两端不与所述计数板上下两端连接。
进一步地，所述装置的电场强度为15-20v/cm。
进一步地，所述葡聚糖溶液的相对分子质量为450000-650000，浓度为10％。
进一步地，所述预处理具体为：向经红细胞裂解处理后的外周血样品中加入白细胞特异性磁珠溶液，磁珠溶液体积为外周血样品体积的十分之一。
本发明还提供了一种双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置的分离与检测方法，包括如下步骤：
s1、样品滴加：先滴加10％的葡聚糖溶液至到样品池的一半容积，随后滴加经过预处理后的人体外周血，形成双液相界面；
s2、细胞分离：打开电磁铁电源开关，已结合磁珠的白细胞受磁力吸引向下移动，并穿过双液相界面，到达溶液底部，外周血中的循环肿瘤细胞则停留在双液相形成的界面上；
s3、细胞检测：打开检测门两端的电源开关，界面上的癌细胞在电泳力作用下流向检测门并顺序通过检测门，每个细胞通过检测门时会产生一个电压脉冲信号，通过计数脉冲信号的个数即可计数样品中癌细胞的个数。
较现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明提供的循环肿瘤细胞分离与检测装置及方法，利用双液相，将结合特异性磁珠的白细胞分离至下液相中，而癌细胞留在上层样品中，克服了在微通道中样品流速慢且需要较大磁场力的缺点，具有分离通量高，分离时间短的优点；
2、本发明提供的循环肿瘤细胞分离与检测装置及方法，可用计数板上的检测门全自动计数分离后样品中癌细胞的个数。和传统的磁式分离法相比，可免用显微镜。
基于上述理由本发明可在细胞分离等领域广泛推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做以简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明有机玻璃样品池示意图。
图2为本发明计数板及检测门示意图。
图中：a、电磁铁；b、检测门(侧视)；c、参考电阻；d1(d2)、铂电极；e、外周血；f、葡聚糖溶液；g、计数板；h、检测门(正视)。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。同时，应当清楚，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员己知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任向具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。
在本发明的描述中，需要理解的是，方位词如“前、后、上、下、左、右”、“横向、竖向、垂直、水平”和“顶、底”等所指示的方位或位置关系通常是基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，在未作相反说明的情况下，这些方位词并不指示和暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位或者以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制：方位词“内、外”是指相对于各部件本身的轮廓的内外。
为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其位器件或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。
此外，需要说明的是，使用“第一”、“第二”等词语来限定零部件，仅仅是为了便于对相应零部件进行区别，如没有另行声明，上述词语并没有特殊含义，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。
如图1所示，本发明提供了一种双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置，包括：由五块3cm*3cm的有机玻璃组成的有机玻璃样品池；有机玻璃样品池的上端开设有开口供液体滴入，有机玻璃样品池的中部垂直设置有计数板，有机玻璃样品池的底部设置有与样品池底部等面积的电磁铁；计数板的厚度为30-50μm，上端露出上层液体液面，下端距离样品池下部2-3mm，计数板前后分别固定两个铂电极，铂电极一个固定在计数板上，另外一个固定在样品池内壁，铂电极垂直方向穿过有机玻璃样品池中的上层液体和下层液体。铂电极两端连接直流电源和参考电阻，参考电阻连接差分放大器的输入端，差分放大器连接笔记本电脑，检测结果直接在电脑屏幕上显示。计数板中央设置有一个检测门，检测门垂直于样品池下表面，宽度为30μm，长度为1-2cm，检测门上下两端不与所述计数板上下两端连接。
检测时，电场强度为15-20v/cm，有机玻璃样品池中的下层液体为葡聚糖溶液，葡聚糖溶液的相对分子质量为450000-650000，浓度为10％。上层液体为预处理后的外周血；癌细胞位于葡聚糖溶液界面上，癌细胞沿界面运动通过检测门。
作为本发明优选的实施方式，预处理具体为：向新鲜的外周血样品中加入体积为其十分之一的白细胞特异性磁珠；摇匀后，将样品放置于4℃的环境下轻微震荡二十分钟。
本发明还提供了一种双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置的分离与检测方法，包括如下步骤：
s1、样品滴加：先滴加10％的葡聚糖溶液至到样品池的一半容积，随后滴加经过预处理后的人体外周血，形成双液相界面；
s2、细胞分离：打开电磁铁电源开关，已结合磁珠的白细胞受磁力吸引向下移动，并穿过双液相界面，到达溶液底部，外周血中的循环肿瘤细胞则停留在双液相形成的界面上；
s3、细胞检测：打开检测门两端的电源开关，界面上的癌细胞在电泳力作用下流向检测门并顺序通过检测门，当细胞通过检测门时产生不同的电压脉冲信号，根据脉冲信号的个数即可计数样品中癌细胞的个数。
综上所述，本发明在实验室验证中，利用双液相形成的界面可以高通量的将癌细胞分离；此外，利用阻抗脉冲原理，可以自动计数通过检测门癌细胞的个数。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的范围。
1.一种双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置，其特征在于，包括：有机玻璃样品池；有机玻璃样品池的上端开设有开口供溶液滴入，有机玻璃样品池的中部垂直设置有计数板，计数板两侧各有一个铂电极，计数板中央设置有一个贯通的检测门，有机玻璃样品池的底部设置有与样品池底部等面积的电磁铁；
检测时，有机玻璃样品池中的下层液体为葡聚糖溶液，上层液体为预处理后的外周血；癌细胞位于葡聚糖溶液界面上，通过所述铂电极施加直流电场后，癌细胞沿界面运动通过检测门被检测和计数。
2.根据权利要求1所述的双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置，其特征在于，所述的铂电极一个固定在计数板上，另外一个固定在样品池内壁，铂电极垂直方向穿过有机玻璃样品池中的上层液体和下层液体。
3.根据权利要求1或2所述的双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置，其特征在于，所述计数板的厚度为30-50μm，上端露出上层液体液面，下端距离样品池下部2-3mm。
4.根据权利要求1所述的双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置，其特征在于，所述检测门位于计数板中央，且垂直于样品池下表面，其宽度为30μm，长度为1-2cm，检测门上下两端不与所述计数板上下两端连接。
5.根据权利要求1所述的双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置，其特征在于，所述装置的电场强度为15-20v/cm。
6.根据权利要求1所述的双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置，其特征在于，所述葡聚糖溶液的相对分子质量为450000-650000，浓度为10％。
7.根据权利要求1所述的双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置，其特征在于，所述预处理具体为：向经红细胞裂解处理后的外周血样品中加入白细胞特异性磁珠溶液，磁珠溶液体积为外周血样品体积的十分之一。
8.一种基于权利要求1-7任一项所述双液相外周血中循环肿瘤细胞分离与检测装置的分离与检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
s1、样品滴加：先滴加10％的葡聚糖溶液至到样品池的一半容积，随后滴加经过预处理后的人体外周血，形成双液相界面；
s2、细胞分离：打开电磁铁电源开关，已结合磁珠的白细胞受磁力吸引向下移动，并穿过双液相界面，到达溶液底部，外周血中的循环肿瘤细胞则停留在双液相形成的界面上；
s3、细胞检测：打开检测门两端的电源开关，界面上的癌细胞在电泳力作用下流向检测门并顺序通过检测门，每个细胞通过检测门时会产生一个电压脉冲信号，通过计数脉冲信号的个数即可计数样品中癌细胞的个数。
技术总结