技术领域：
本发明属于生物技术与分子生物学领域，具体地涉及一种大肠杆菌编码的异柠檬酸裂合酶突变基因acea及该基因编码的氨基酸序列及其应用。
背景技术：
苯丙氨酸是一种芳香族氨基酸，它是组成蛋白质的20种氨基酸之一，并且是人体的必需氨基酸。常温下l-苯丙氨酸为无色至白色片状晶体或白色结晶性粉末，可溶于水，难溶于乙醇等有机溶剂，比旋光度为-35.1°，等电点为5.48。l-苯丙氨酸是8种必须氨基酸之一，其作为营养物质的同时也是体内的生糖兼生酮氨基酸，在代谢中有着不可代替的作用。在工业上，l-苯丙氨酸主要用于与天冬氨酸反应形成人工甜味剂阿斯巴甜。这种甜味剂在功能食品添加剂中有着广泛的需求。在医药领域上，l-苯丙氨酸是静脉输液的必需物质，同时可以用作许多抗肿瘤药物靶向供给的载体。目前全球市场l-苯丙氨酸年需求量超过50000吨，并且逐年以15％的速率稳定增长，其中阿斯巴甜的年需求量约为20000吨；另一方面，医药行业每年l-苯丙氨酸需求量约为8000吨。因此，l-苯丙氨酸具有巨大的市场开发空间(liux,niuh,liq,etal.metabolicengineeringfortheproductionofl-phenylalanineinescherichiacoli[j].3biotech,2019,9(3).)。
苯丙氨酸的合成途径目前比较清晰，大肠杆菌利用自身的pts系统将外源的葡萄糖转运至细胞内，同时将其磷酸化为六磷酸葡萄糖。磷酸化后的葡萄糖一部分通过糖酵解途径(emp)进入三羧酸循环产生atp为机体的生命活动提供能量和一些中间物质(作为前体物为参与机体其他物质的合成)，其中就包括磷酸烯醇式丙酮酸(pep)，另一部分则进入磷酸戊糖非氧化还原途径(pp)产生赤藓糖4-磷酸(e4p)，pep和e4p经过莽草酸途径生成分支酸并最终生成苯丙氨酸。苯丙氨酸的生物合成受其自身的反馈抑制和反馈阻遏。苯丙氨酸的生产菌株的代谢工程改造策略主要包括以下几部分内容：1.增加前体pep和e4p的供给；2.增强莽草酸途径；3.降低其他芳香族氨基酸竞争途径通量；4.解除反馈阻遏和反馈抑制；5.增强苯丙氨酸外排；6.敲除苯丙氨酸去路途径(rodrigueza,martínez,juana,flores,noemí,etal.engineeringescherichiacolitooverproducearomaticaminoacidsandderivedcompounds[j].microbialcellfactories,2014,13(1):126.)。
目前很少有通过改造中央碳代谢tca循环相关酶的活性进而有效提高苯丙氨酸产量的报道。异柠檬酸裂合酶(isocitratelyase，缩写icl，ec4.1.3.1)是以一种在乙醛酸循环中将异柠檬酸切割为乙醛酸和琥珀酸的酶。其产物再通过苹果酸合酶合成苹果酸，跳过了三羧酸循环(tca循环)中脱去二氧化碳的两步(cortayjc,bleicherf,duclosb,etal.utilizationofacetateinescherichiacoli:structuralorganizationanddifferentialexpressionoftheaceoperon[j].biochimie(paris),1989,71(9):1043-1049.)。这一途径广泛存在于细菌、真菌与植物中。在催化过程中，异柠檬酸被去质子化，羟醛裂解导致琥珀酸酯和乙醛酸酯的释放。该反应机制的功能与糖酵解中的醛缩酶类似，在糖酵解中碳-碳键断裂并生成的新的醛类。在乙醛酸循环中，苹果酸合酶然后催化乙醛酸和乙酰辅酶a缩合形成苹果酸，因此循环可以继续进行。通过从tca循环转移异柠檬酸，icl和苹果酸合酶在乙醛酸循环中的作用导致碳与2-碳化合物的净同化。因此，尽管tca循环不产生净碳同化，但乙醛酸循环产生的中间体可用于合成葡萄糖(通过糖异生)以及其他生物合成产物。因此使用icl和苹果酸合酶的生物体能够从乙酸酯衍生的乙酰辅酶a或乙醇，脂肪酸或聚β-羟基丁酸酯的降解物中合成葡萄糖及其代谢中间体。目前尚未有大肠杆菌编码异柠檬酸裂合酶突变基因acea用于选育芳香族氨基酸高产菌株的报道。
技术实现要素：
本发明人在前期的工作中构建了一种大肠杆菌高产苯丙氨酸的高通量筛选方法，通过对一株苯丙氨酸菌株进行诱变后筛选获得一株苯丙氨酸产量提升的突变菌，再挖掘分析其中对苯丙氨酸高产相关的突变基因，并做了进一步研究，最终完成本发明。
本发明提供一种异柠檬酸裂合酶的突变体，其氨基酸序列在如seqidno：1所示氨基酸序列存在下述突变：第22位氨基酸突变为s。
本发明进一步提供编码如上述异柠檬酸裂合酶的突变体的编码基因。更具体地，其核苷酸序列如seqidno：3所示。
本发明尤其提供异柠檬酸裂合酶编码基因在制备芳香族氨基酸中的应用。
在一个具体实施方式中，其是通过含有所述异柠檬酸裂合酶导入大肠杆菌生产芳香族氨基酸的工程菌的基因组中。
其中，所述异柠檬酸裂合酶编码基因优选编码具有seqidno：1或seqidno：2所示氨基酸序列的多肽。更优选地，所述异柠檬酸裂合酶编码基因具有seqidno：3所示核苷酸序列。
本发明构建的包含有大肠杆菌编码异柠檬酸裂合酶突变基因acea的工程菌生物安全，遗传背景清晰，可以有效的提高大肠杆菌生产苯丙氨酸等芳香族氨基酸的能力，在摇瓶水平可提高苯丙氨酸积累水平达11.2％以上，可提高色氨酸积累水平13.7％以上。
附图说明
图1为用于基因组编辑的质粒pcas-acea的图谱。
图2为大肠杆菌苯丙氨酸工程菌株hdh5和hdh5-a和为色氨酸工程菌株kw002和kw002-a摇瓶水平发酵验证结果。
具体实施方式
本发明人在前期的工作中发明了一种基于苯丙氨酸的高通量的筛选方法，并利用该方法筛选出多株比出发菌的苯丙氨酸产量不同程度上提高的突变株(liu,y.,zhuang,y.,ding,d.,xu,y.,sun,j.,andzhang,d.(2017)biosensor-basedevolutionandelucidationofabiosyntheticpathwayinescherichiacoli,acssyntheticbiology，2017may19；6(5):837-848.doi:10.1021/acssynbio.6b00328.)，该苯丙氨酸高产菌株的基因组测序结果已经公开发表。经测序后发现acea基因的突变型g22s对苯丙氨酸产量提高具有重要作用。将该突变引入本实验保存的一株大肠杆菌高产色氨酸工程菌株中发现在摇瓶水平也可显著提升色氨酸发酵产量。本专利中提及的苯丙氨酸菌株hdh5菌株和kw002菌株的背景及相关操作已在发表的论文中详细说明(liu,y.,zhuang,y.,ding,d.,xu,y.,sun,j.,andzhang,d.biosensor-basedevolutionandelucidationofabiosyntheticpathwayinescherichiacoli,acssyntheticbiology，2017may19；6(5):837-848.doi:10.1021/acssynbio.6b00328；chen,y.,liu,y.,ding,d.,cong,l.,andzhang,d.(2018)rationaldesignandanalysisofanescherichiacolistrainforhigh-efficiencytryptophanproduction,jindmicrobiolbiotechnol,2018may；45(5):357-367.doi:10.1007/s10295-018-2020-x.)。
本发明中的“芳香族氨基酸工程菌株”是指以大肠杆菌或者谷氨酸棒状杆菌等工业菌株，经过适当的培养条件，在适当的培养基中发酵后可以生产苯丙氨酸或者色氨酸的菌株，优先特指大肠杆菌。目前通过本领域的科研人员掌握的各种常规的改造手段获取的大肠杆菌或者谷氨酸棒状杆菌菌株均为芳香族氨基酸工程菌株。
下面结合实例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好的理解本发明，单对本发明不作任何限制。
实施例1、构建pcas-acea
本实施例中构建的pcas-acea质粒用于将大肠杆菌色氨酸和苯丙氨酸工程菌株基因组上acea野生型基因替换为acea突变型(g22s)，该质粒的具体工作原理已公开发表(zhaod,yuans,xiongb,sunh,yel,lij,zhangx,bic.developmentofafastandeasymethodforescherichiacoligenomeeditingwithcrispr/cas9..2016dec1；15(1):205.)。pcas-red的具体构建过程描述如下：将cas9蛋白(以含有cas9蛋白的质粒(addgene编号为：42876))，合成不含有n20序列的grna蛋白(序列为：5’-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctt-3’)以及它的启动子序列(5’-ctaggtttatacataggcgagtactctgttatggagtcagatct-3’)和来自pkd46质粒(kirilla.datsenkoandbarryl.wanner,one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts,pnasjune6,200097(12)6640-6645；https://doi.org/10.1073/pnas.120163297)的大肠杆菌同源重组系统这三部分利用吉布森组装整合为一个质粒，并命名为pcas-red。pcas-acea的质粒是由pcas-red衍生而来，在同源臂及n20序列等进行针对acea基因进行特异性改造，构建过程如下：
以pcas-red质粒为模板，以pcas-acea-cas-lf、pcas-acea-cas-lr为引物，pcr扩增出质粒片段pcas1，pcr体系见表1。以pcas-red质粒为模板，以pcas-acea-n20-lf、pcas-acea-n20-lr为引物，pcr扩增出质粒片段pcas2。以大肠杆菌w3110基因组为模板，以pcas-acea-lf为上游引物，以pcas-acea-mut-lr为下游引物，pcr扩增片段分别为acea-u；以大肠杆菌w3110基因组为模板，以pcas-acea-mut-lf和pcas-acea-lr为引物，pcr扩增片段分别为acea-d。按照表2的体系进行吉布森组装，反应条件为50℃，1h。将10μl连接体系转入dh5α感受态细胞中于30℃利用lb培养基过夜培养，挑选阳性克隆后送金唯智公司测序进行验证，构建成功的质粒命名为pcas-acea。本实例中所用引物见表3.
表1.pcr反应体系
表2.吉布森连接反应体系
表3.构建pcas-acea质粒所需引物
实施例2.构建hdh5-a
将大肠杆菌苯丙氨酸工程菌hdh5制备成感受态，将pcas-acea质粒转入感受态细胞后涂布于含有氨苄抗性的平板上30°过夜培养。挑取阳性单菌落接种到含有氨苄的lb液体培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l)试管中，在30℃摇床下培养6h后加入2g/l的阿拉伯糖(诱导cas9蛋白和pkd46上的重组蛋白的表达)，促进cas9蛋白的筛选。然后继续在30℃摇床下培养6h，将菌液在含有氨苄和2g/l阿拉伯糖的lb平板上进行三区划线，30℃下恒温过夜培养。利用菌落pcr进行验证并进行测序，测序正确的菌株分别命名hdh5-a。
实施例3.构建kw002-a
将大肠杆菌苯丙氨酸工程菌kw002制备成感受态，将pcas-acea质粒转入感受态细胞后涂布于含有氨苄抗性的平板上30°过夜培养。挑取阳性单菌落接种到含有氨苄lb试管中，在30℃摇床下培养6h后加入2g/l的阿拉伯糖(诱导cas9蛋白和pkd46重组蛋白的表达)，促进cas9蛋白的筛选。然后继续在30℃摇床下培养6h，将菌液在含有氨苄和2g/l阿拉伯糖的lb平板上进行三区划线，30℃下恒温过夜培养。利用菌落pcr进行验证并进行测序，测序正确的菌株分别命名kw002-a。
实施例4.苯丙氨酸菌株hdh5和hdh5-a摇瓶发酵
大肠杆菌高产苯丙氨酸菌株hdh5和hdh5-a的摇瓶发酵工艺如下：
(1)斜面活化培养：从-80℃冰箱取出保藏菌种划线于含有卡纳抗性的lb固体培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂15g/l)，37℃培养12-18h。
(2)种子培养：用接种环从新鲜活化斜面上挑取2环大肠杆菌于lb培养基中(500ml三角瓶中装50mllb培养基，封口膜封口)，37℃220r/min振荡培养6-8h至od600约为2-3。
(3)摇瓶分批发酵培养：将种子培养液按10％的接种量接入含有卡纳抗性发酵培养基中(500ml三角瓶，装液量为50ml，封口膜封口)，37℃220r/min振荡培养进行苯丙氨酸分批发酵。发酵培养基如下：
表4.苯丙氨酸发酵培养基配方
发酵结束后，10000rpm离心10min取出上清，利用液相进行检测，检测方法如下：
hplc水相：去离子水，0.22μm孔径的水系微孔过滤膜过滤，超声30min。
hplc盐相：色谱级nah2po36.218g溶解于1l去离子水中，用0.22μm孔径的水系微孔过滤膜过滤，超声30min。
hplc有机相：色谱级甲醇、色谱级乙腈、去离子水体积比为4.5:4.5:1，用0.22μm有机系溶剂微孔过滤膜过滤，超声30min。
hplc程序采用梯度洗脱，洗脱程序为：
表5.hplc梯度洗脱程序
发酵结束后对所有的工程菌株进行苯丙氨酸产量的检测。发酵结果见图2。从结果可以看出，与出发菌株比较，含有大肠杆菌编码异柠檬酸裂合酶突变基因acea突变基因的大肠杆菌工程菌株后，苯丙氨酸的产量提高了11.2％，说明该修饰对于大肠杆菌生产苯丙氨酸具有明显的提升作用。
实施例5.色氨酸菌株kw002和kw002-a摇瓶发酵
大肠杆菌高产色氨酸菌株kw002和kw002-a的摇瓶发酵工艺如下：
(1)斜面活化培养：从-80℃冰箱取出保藏菌种划线于含有四环素抗性的固体lb培养基，37℃培养12-18h。
(2)种子培养：用接种环从新鲜活化斜面上挑取2环大肠杆菌于lb培养基中(500ml三角瓶中装50mllb培养基，封口膜封口)，37℃220r/min振荡培养6-8h，od600约为2-3。
(3)摇瓶分批发酵培养：将种子培养液按10％的接种量接入含有四环素抗性发酵培养基中(500ml三角瓶，装液量为50ml，封口膜封口)，37℃220r/min振荡培养进行色氨酸分批发酵。发酵培养基如下：
表6.色氨酸发酵培养基配方
发酵结束后，10000rpm离心10min取出上清，利用液相进行检测，检测方法如下：
hplc水相：去离子水，0.22μm孔径的水系微孔过滤膜过滤，超声30min。
hplc盐相：色谱级nah2po36.218g溶解于1l去离子水中，用0.22μm孔径的水系微孔过滤膜过滤，超声30min。
hplc有机相：色谱级甲醇、色谱级乙腈、去离子水体积比为4.5:4.5:1，用0.22μm有机系溶剂微孔过滤膜过滤，超声30min。
hplc程序采用梯度洗脱，洗脱程序为如表5所示。
发酵结束后对所有的工程菌株进行色氨酸产量的检测。发酵结果见图2。从结果可以看出，与出发菌株比较，含有大肠杆菌编码异柠檬酸裂合酶突变基因acea突变基因的大肠杆菌工程菌株后，色氨酸的产量提高了13.7％，说明该修饰对于大肠杆菌生产色氨酸具有明显的提升作用。
本发明的菌株的构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域的技术人员按本发明公开的内容达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。
本发明中的菌株代号如hdh5，hdh5-a，kw002和kw002-a等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。
上述方法构建的包含有大肠杆菌编码异柠檬酸裂合酶突变基因acea突变基因的工程菌的用途，包含但不局限于苯丙氨酸和色氨酸。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>异柠檬酸裂合酶突变体及其在制备芳香族氨基酸中的应用
<130>2019.11.5
<160>11
<170>siposequencelisting1.0
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<211>434
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<213>escherichiacoli
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1.一种异柠檬酸裂合酶的突变体，其特征在于，其氨基酸序列在如seqidno：1所示氨基酸序列存在下述突变：第22位氨基酸突变为s。
2.如权利要求1所述的异柠檬酸裂合酶的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seqidno：2所示。
3.编码如权利要求1或2所述异柠檬酸裂合酶的突变体的编码基因。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno：3所示。
5.异柠檬酸裂合酶的突变体的编码基因在制备芳香族氨基酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的芳香族氨基酸为苯丙氨酸或色氨酸。
7.含权利要求5所述的编码基因的工程菌。
8.如权利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌。
9.如权利要求7或8所述的工程菌，其特征在于，所述的编码基因位于质粒或染色体中。
技术总结