本发明属于生物医药，具体涉及一种foxo3在制备抗肝癌药物中的应用。
背景技术：
1、肝癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，其中肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是原发性肝癌的主要类型，化学治疗效果差且分子靶向药物反应率相对较低，患者5年生存率仅为18％。肿瘤细胞代谢重编程(metabolic reprogramming)是肿瘤发生发展的基础。hcc细胞通过代谢重编程参与多种代谢途径和信号通路的改变，以满足细胞快速过程中生长对能量供给、生物合成等需求，对于hcc细胞生长和发展具有重要的促进作用。因此，从hcc能量代谢异常的角度揭示其代谢重编程的机制，并探寻其可能的调控因子及潜在靶点，可为其治疗及药物研发提供新思路。
2、代谢重编程的一个主要特征就是“warburg效应”。正常细胞在氧供充足情况下进行氧化磷酸化，缺氧时则发生糖酵解产生细胞生存及增殖所需的能量。而肿瘤细胞即便在氧供充足的情况下，仍通过糖酵解代谢途径产生atp和大量的乳酸，即为warburg效应。该现象最早在肝癌中发现，且研究表明有氧糖酵解可促进hcc增殖、生长、转移并诱导免疫逃逸等。因此，对有氧糖酵解的调控和干预一直是包括hcc在内的肿瘤发生发展研究的热点。
3、利用多维调控代谢模型，通过整合分析hcc转录调控代谢网络预测潜在靶点，识别出hippo通路失活是hcc的关键失调信号。而yes相关蛋白(yes-associatedprotein，yap)作为hippo通路失活的主要效应因子，可入核与转录因子tead结合形成转录复合体，促进hcc细胞对葡糖糖的摄取。然而，yap是否调控hcc细胞谷氨酰胺代谢的相关研究未见报道。
4、肿瘤细胞另一种重要的代谢改变为谷氨酰胺代谢(glutaminolysis)依赖：即谷氨酰胺被代谢分解成α-酮戊二酸，参与到三羧酸循环中，提供atp及中间代谢产物，为肿瘤细胞提供其生长所需的能量。其中谷氨酰胺酶(glutaminase，gls)为谷氨酰胺代谢关键限速酶，有研究表明，肝癌中gls高表达，可大量消耗并利用谷氨酰胺，表现出明显的“谷氨酰胺依赖”的现象。
5、foxo是叉头框(forkhead box，fox)蛋白亚家族，有助于调节糖异生基因程序在肝脏的表达。在哺乳动物中foxo家族由foxo1、foxo3、foxo4和foxo6四个成员组成，其中foxo3在癌症中通常失调。但是foxo3如何调控肿瘤细胞谷氨酰胺代谢尚未见报道。
6、鉴于糖酵解和谷氨酰胺代谢在代谢重编程中的重要地位以及两者调控hcc增殖、转移、氧化应激等重要作用，靶向干预这些异常的代谢过程将为研发抗hcc药物提供新思路。然而，虽距“warburg效应”的提出已过百年，单一阻断解或谷氨酰胺代谢途径仍未能有效的解决肿瘤治疗问题。研究发现，糖酵解和谷氨酰胺代谢之间存在功能互补。当糖酵解被阻断时，肿瘤细胞增强谷氨酰胺代谢来维持其存活，如mtor抑制剂mln128阻断糖酵解通路，但长期给药反而增强谷氨酰胺代谢，使肿瘤细胞在糖酵解抑制状态下仍然存活并保持高增殖能力。此外，肿瘤细胞亦可增强糖酵解以逃脱谷氨酰胺代谢抑制剂的生长抑制和杀灭作用。综上，肿瘤细胞代谢重编程在糖酵解和谷氨酰胺代谢途径间功能互补，单一阻断糖酵解或者谷氨酰胺代谢并不能有效抑制肿瘤细胞的发生发展。因此，双重阻断糖酵解和谷氨酰胺代谢可为基于代谢重编程的hcc治疗提供新思路。
技术实现思路
1、本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种foxo3在制备抗肝癌药物中的应用。
2、本发明的第二个目的是提供foxo3过表达慢病毒在制备抗肝癌药物中的应用。
3、本发明的第三个目的是提供一种药物组合物，该药物组合物以上述foxo3过表达慢病毒为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。
4、本发明的第四个目的是提供一种促进foxo3过表达的化合物aur在制备抗肝癌药物中的应用。
5、本发明的技术方案如下：
6、foxo3在制备抗肝癌药物中的应用，foxo3的序列为seq id no.1，具体如下所示：
7、
8、
9、
10、在一种优选方案中，foxo3作为药物靶点在制备抗肝癌药物中的应用。
11、foxo3在制备抗肝癌药物中的应用时，药物可以制成固体制剂或者液体制剂。进一步地，在本发明提供的技术方案的基础上，药物可以制成注射剂、口服液、颗粒剂、粉剂、片剂或胶囊剂。
12、在一种优选方案中，foxo3以慢病毒作为载体，制备foxo3过表达慢病毒。
13、本发明还提供foxo3过表达慢病毒在制备抗肝癌药物中的应用。
14、在一种优选方案中，本发明提及的foxo3过表达慢病毒的构建方法，包括如下步骤：
15、质粒构建：用age i酶对纯化的gv358质粒dna进行酶切，对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目标条带，获得线性化的gv358载体。将pcr扩增纯化的foxo3基因片段与酶切后gv358质粒dna连接得到重组载体foxo3-gv358，并进行pcr鉴定，将鉴定出的阳性克隆转化子进一步送测序。将测序结果正确的菌液转接于含相应抗生素的lb培养基中进行扩大培养，再进行质粒抽提，获得高纯度质粒。
16、将构建好的质粒和病毒包装辅助质粒(helper 1.0)和病毒包装辅助质粒(helper2.0)共转染293t包装细胞中，包装慢病毒，扩增收集病毒，采用超速离心的浓缩纯合发生得到高浓度的慢病毒保存液，测定病毒滴度；将空载体和慢病毒载体按照上述步骤共转染293t细胞，包装阴性对照慢病毒。
17、在本发明中通过实验进行了如下验证：过表达foxo3可抑制hepg2和huh-7细胞的增殖、迁移和侵袭。过表达foxo3可引起hepg2细胞内糖酵解和谷氨酰胺代谢途径中多种代谢物水平发生改变。foxo3过表达可抑制huh-7细胞乳酸、atp的生成和谷氨酰胺的摄取以及糖酵解水平，并且抑制hk2、ldha、gls和gdh蛋白的表达。而沉默foxo3会促进hepg2和huh-7细胞乳酸、atp的生成以及谷氨酰胺的摄取，并且促进hk2、ldha、gls和gdh蛋白的表达。过表达hk2或过表达gls可逆转foxo3过表达对hepg2和huh-7细胞增殖的抑制作用。上述结果提示foxo3可通过双重阻断糖酵解和谷氨酰胺代谢继而抑制hcc生长。
18、本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物以上述foxo3过表达慢病毒为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。该药物组合物可以为固体制剂或液体制剂，特别是注射剂、口服液、颗粒剂、粉剂、片剂或胶囊剂。药学上可接受的辅料在整个制剂技术发展过程中起到关键的作用，许多制剂中辅料占到大部分，因而很大程度上辅料的性质决定了制剂的性质。优良的辅料可以增强主药的稳定性，延长药剂的有效期；可以调控主药在体内外的释放速度；可以改变药物在体内的吸收，增加生物利用度，对具体的辅料类型不作限定。
19、在本发明中，促进foxo3过表达的化合物aur在制备抗肝癌药物中的应用，其中，化合物aur的结构式如下：
20、
21、在本发明中，利用edu增殖试剂盒检测aur对hepg2和huh-7细胞增殖能力的影响，结果发现：aur可显著抑制hepg2和huh-7细胞增殖能力，可显著抑制huh-7细胞乳酸、atp的生成以及对谷氨酰胺的摄取，通过阻断糖酵解和谷氨酰胺代谢继而抑制hcc细胞的增殖。探索药物aur对糖酵解和谷氨酰胺关键酶的影响，结果发现：药物aur可显著抑制hepg2和huh-7细胞中糖酵解关键酶己糖激酶2(hexokinase 2，hk2)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，ldha)和谷氨酰胺代谢关键酶谷氨酰胺酶(glutaminase，gls)和谷氨酰胺脱氢酶(glutamine dehydrogenase，gdh)的表达，说明药物aur能抑制hcc细胞糖酵解和谷氨酰胺代谢途径中关键酶的表达。
22、采用本发明的技术方案，优势如下:
23、本发明证实了过表达foxo3可抑制hepg2和huh-7细胞的增殖、迁移和侵袭。过表达foxo3可引起hepg2细胞内糖酵解和谷氨酰胺代谢途径中多种代谢物水平发生改变。foxo3过表达可抑制huh-7细胞乳酸、atp的生成和谷氨酰胺的摄取以及糖酵解水平，并且抑制hk2、ldha、gls和gdh蛋白的表达。而沉默foxo3会促进hepg2和huh-7细胞乳酸、atp的生成以及谷氨酰胺的摄取，并且促进hk2、ldha、gls和gdh蛋白的表达。过表达hk2或过表达gls可逆转foxo3过表达对hepg2和huh-7细胞增殖的抑制作用。上述结果表明foxo3可通过双重阻断糖酵解和谷氨酰胺代谢继而抑制hcc生长，为抗hcc代谢重编程药物的研发提供新的靶点。
1.foxo3在制备抗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述foxo3的序列如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述foxo3作为药物靶点在制备抗肝癌药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述foxo3以慢病毒作为载体。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物制成液体制剂或固体制剂。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物制成注射剂、口服液、颗粒剂、粉剂、片剂或胶囊剂。
6.foxo3过表达慢病毒在制备抗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述foxo3的序列如seq id no.1所示。
7.一种药物组合物，它以权利要求1所述的foxo3过表达慢病毒为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物制成液体制剂或固体制剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物制成注射剂、口服液、颗粒剂、粉剂、片剂或胶囊剂。
10.促进foxo3过表达的化合物aur在制备抗肝癌药物中的应用，所述化合物aur的结构式如下：
