本发明属于分子生物学，具体涉及一种抗人tim-3单克隆抗体及其制备方法。
背景技术：
1、tim-3(t cell immunoglobulin and mucin domain 3)属于免疫球蛋白超家族，是一种表达在多种免疫细胞表面的分子，包括t细胞、b细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞的ⅰ型细胞表面糖蛋白，参与细胞凋亡。tim-3是免疫刺激分子，也是免疫抑制分子，具体取决于表达tim-3受体的不同细胞以及肿瘤微环境。在正常情况下，tim-3参与维持免疫平衡，调控t细胞的活性，防止过度激活和炎症反应。然而，在自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(sle)和类风湿关节炎(ra)中，tim-3的表达水平可能会异常升高。这种升高与t细胞的功能异常有关，可能导致t细胞持续活化，产生大量的炎症介质，进而引发和加剧炎症反应。在肿瘤微环境中，tim-3的高表达与t细胞功能的抑制有关，使得t细胞失去了对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，促进了肿瘤的免疫逃逸。为了克服这种免疫抑制，研究人员正在探索通过阻断tim-3信号通路来增强t细胞对肿瘤的杀伤能力。例如，使用抗tim-3抗体可以阻止其与配体结合，从而恢复t细胞的功能，提高肿瘤免疫治疗的疗效。此外，通过基因编辑技术，使t细胞表达不具有免疫抑制功能的tim-3突变体，也是一种可能的策略。在临床试验中，针对tim-3的免疫治疗策略已经显示出一定的潜力，特别是在结合其他免疫检查点抑制剂如pd-1/pd-l1抑制剂使用时，可能产生更为协同的效果。因此，开发抗人tim-3单克隆抗体具有良好的应用前景。
2、杂交瘤技术是目前发展最成熟、应用最普遍的单克隆抗体开发平台，但是其耗时长、细胞融合效率低，并且可应用的物种有限。噬菌体展示技术虽然缩短了抗体开发时长，但由于不能保证轻重链的天然配对而影响了抗体的特异性、亲和力。
技术实现思路
1、针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供一种抗人tim-3单克隆抗体及其制备方法。本发明提供的单克隆抗体开发方法具有耗时短、通量高、阳性率高等优点，且在分子、细胞层面均具有良好的抗原抗体结合活性，为人tim-3蛋白的elisa、facs等检测提供了支持。
2、本发明以单个b细胞作为研究主体，利用流式细胞术分选出表达阳性抗体的小鼠b细胞，采用单细胞抗体建库方法，保持了抗体轻重链的天然配对，替代了效率低、耗时长、易受污染的杂交瘤细胞融合与培养。
3、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
4、在本发明的第一方面，提供了一种抗人tim-3单克隆抗体，所述单克隆抗体包括氨基酸序列如seq id no：1-3所示的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3；以及氨基酸序列如seq id no：4-6所示的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。
5、进一步地，所述抗体包括氨基酸序列如seq id no：7所示的重链可变区。
6、进一步地，所述抗体包括氨基酸序列如seq id no：8所示的轻链可变区。
7、在本发明的第二方面，还提供了如第一方面所述抗人tim-3单克隆抗体的制备方法，过程如下：表达human tim-3/his protein，并结合水溶性佐剂对小鼠进行快速免疫，收集小鼠脾脏和骨髓细胞；利用流式分选仪筛选与human tim-3抗原结合的小鼠b细胞；对阳性b细胞进行单细胞建库，通过ngs测序获得轻重链天然配对的抗体序列；进一步对序列进行筛选后，通过哺乳动物细胞高通量表达系统进行抗体表达；最后通过elisa与facs检测验证即得。
8、具体来说，所述的制备方法包括如下步骤：
9、s1、依据human tim-3的蛋白序列信息，表达human tim-3/his protein蛋白；
10、s2、用步骤s1获得的human tim-3/his protein结合水溶性佐剂对小鼠进行快速免疫后，提取小鼠脾脏、骨髓细胞；
11、s3、以步骤s2获得的小鼠细胞为原材料，通过流式分选细胞仪筛选到表达阳性抗体的细胞，经过单细胞建库系统，构建抗体文库并进行二代测序；
12、s4、筛选步骤s3获得的抗体序列，提取轻重链天然配对的抗体序列，并克隆至载体pcdna3.4中；
13、s5、通过哺乳动物细胞高通量表达系统诱导抗human tim-3抗体高通量表达，通过抗体检测技术elisa与facs方法进行抗原结合验证，最终获得抗human tim-3的单克隆抗体。
14、在本发明的第三方面，还提供了编码如第一方面所述抗人tim-3单克隆抗体的核酸。
15、在本发明的第四方面，还提供了含有如第三方面所述核酸的表达载体，优选的所述表达载体为pcdna3.4。
16、在本发明的第五方面，还提供了含有如第四方面所述表达载体的宿主细胞，优选的所述宿主细胞为cho细胞。
17、在本发明的第六方面，还提供了如第一方面所述抗人tim-3单克隆抗体在制备人tim-3蛋白检测试剂中的应用。
18、在本发明的第七方面，还提供了如第一方面所述抗人tim-3单克隆抗体在制备与人tim-3蛋白结合的产品中的应用。
19、与现有技术相比，本发明的技术效果如下：本发明提供的抗human tim-3单克隆抗体的开发方法缩短了目的抗体的开发时间，并且通量高、阳性率高，在分子、细胞层面均具有良好的抗原抗体结合活性。
1.一种抗人tim-3单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括氨基酸序列如seq idno：1-3所示的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3；以及氨基酸序列如seq id no：4-6所示的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。
2.根据权利要求1所述的抗人tim-3单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括氨基酸序列如seq id no：7所示的重链可变区。
3.根据权利要求1所述的抗人tim-3单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括氨基酸序列如seq id no：8所示的轻链可变区。
4.如权利要求1-3任意一项所述抗人tim-3单克隆抗体的制备方法，其特征在于，过程如下：表达human tim-3/his protein，并结合水溶性佐剂对小鼠进行快速免疫，收集小鼠脾脏和骨髓细胞；利用流式分选仪筛选与human tim-3抗原结合的小鼠b细胞；对阳性b细胞进行单细胞建库，通过ngs测序获得轻重链天然配对的抗体序列；进一步对序列进行筛选后，通过哺乳动物细胞高通量表达系统进行抗体表达；最后通过抗体检测技术检测验证即得。
5.根据权利要求4所述抗人tim-3单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的抗体检测技术为elisa和/或facs方法。
6.编码如权利要求1-3任意一项所述抗人tim-3单克隆抗体的核酸。
7.含有如权利要求6所述核酸的表达载体。
8.含有如权利要求7所述表达载体的宿主细胞。
9.如权利要求1-3任意一项所述抗人tim-3单克隆抗体在制备人tim-3蛋白检测试剂中的应用。
10.如权利要求1-3任意一项所述抗人tim-3单克隆抗体在制备与人tim-3蛋白结合的产品中的应用。
