本发明属于基因工程和基因治疗，具体涉及一种rna降解活性降低的dcas6-毒素变体融合蛋白及其筛选方法和应用。
背景技术：
1、crispr/cas系统是原核生物的一种天然免疫系统，可防御侵入性遗传元件，包括噬菌体或质粒。基于该系统易用性和可编程性等特点，已被广泛应用于哺乳动物细胞的基因组编辑和转录调控等方面，推动了疾病诊断、基因治疗、新药开发等生物医学研究领域的发展。crispr/cas9系统作用于基因组dna，直接敲除某一特定基因后会引起不可逆的损伤，同时由于其脱靶率，会带来应用不安全性。cas13是一种rna引导的rna核酸内切酶，这使其能够在细胞内对rna进行敲低、定点编辑、剪切调控等操作。然而，目前该技术还面临一些挑战，如“旁切效应”以及蛋白体积过大难以递送等问题。因此，仍需研究和挖掘更具有安全性且效果显著的rna降解工具，应用于疾病治疗、基因功能等领域。
2、crispr/dcas6系统具备识别和结合具有特定cas6结合位点(cbs)的茎环rna的能力，但失去切割活性，其在特定的向导rna(guide rna,grna)引导下，可识别并结合至目标rna序列。通过将dcas6蛋白与不同的效应蛋白进行融合表达，并设计特定的grna，crispr/dcas6系统可精确识别并结合至目标rna序列，进而实现对rna功能的调控。
3、毒素-抗毒素系统由两个共表达的基因组成，其中一个基因编码毒素，另一个编码抗毒素，毒素通过破坏翻译过程(抑制dna回旋酶、降解mrna或修饰核糖体成分)来阻止细菌生长。抗毒素可以中和毒素毒性，二者相互作用对细菌生长状态起精密调节作用。二型ta系统被研究的最为广泛，该系统中，毒素mazf能够切割含aca序列的mrna，毒素mqsr能够切割含有gcu序列的mrna，因此将这两种序列特异性核酸内切酶进行改造，并将其与dcas6蛋白进行融合，筛选得到具有高邻近切割活性和低非特异性降解活性的dcas6-毒素变体融合蛋白，在grna介导下，实现哺乳动物细胞内rna的降解。相较于cas9和cas13系统，dcas6蛋白体积更小，更适合体内递送，具有更好的临床应用前景。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种rna降解活性降低的dcas6-毒素变体融合蛋白及其筛选方法。
2、具体的技术方案如下：
3、第一方面，本发明提供了一种与dcas6蛋白融合的人工改造的mqsr毒素变体，它包括的dcas6-nes-3×ggs-mqsr变体融合蛋白；所述mqsr毒素变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生如下突变：y61a/k98a或h7a/m58a/k98a；本发明提供了一种与dcas6蛋白融合的人工改造的mazf毒素变体，它包括的dcas6-nes-3×ggs-mazf变体融合蛋白；所述mazf毒素变体在氨基酸序列seq id no.2的基础上发生如下突变：r29s/i81a或s55a/k56a/g57a/y5。
4、优选地，mqsr毒素蛋白的来源包括escherichia coli str.k-12substr.mg1655细菌；mazf毒素蛋白的来源包括escherichia coli str.k-12substr.mg1655细菌。
5、另一方面，本发明提供了一种rna降解活性降低的dcas6-毒素变体融合蛋白的筛选方法，包括如下步骤：
6、1)以基因合成的毒素蛋白的质粒为模板，对mqsr毒素的y61a/k98a或h7a/m58a/k98a进行定点饱和突变，对mazf毒素的r29s/i81a或s55a/k56a/g57a/y58a进行定点饱和突变；
7、2)通过引物设计和pcr将核出孔序列nes插入至dcas6蛋白c端，然后利用重叠延伸pcr技术将dcas6蛋白c端部分和毒素变体蛋白通过3×ggs连接子融合，将重组片段插入至哺乳动物表达载体pcmv3，得到dcas6-nes-3×ggs-toxin变体融合蛋白表达质粒，整个蛋白由cmv启动子驱动表达；
8、3)基于双荧光报告系统筛选毒素变体蛋白，双荧光报告系统在同一个表达载体上以不同的启动子转录表达绿色荧光蛋白gfp和蓝色荧光蛋白bfp，它包括的表达质粒为cmv-cbs-gfp-pa-sv40-bfp-pa，其中cbs-gfp转录本作为靶标，招募dcas6-toxin变体融合蛋白，用于检测毒素变体的邻近降解活性；bfp转录本作为对照，用于来检测非特异性降解活性，从而筛选得到具有高邻近切割活性和低非特异性降解活性的毒素变体蛋白；
9、一种rna降解活性降低的dcas6-毒素变体融合蛋白的应用，利用筛选出来的融合蛋白进行内源性基因降解，具体包括如下步骤：
10、1)bgcbs质粒的设计优化，该质粒在靶向序列的两端都插入cbs序列(cas6蛋白结合位点)，由u6启动子驱动表达；
11、2)筛选dcas6-toxin变体融合蛋白，将筛选得到的毒素变体蛋白与bgcbs质粒共转染至hek293t细胞，对细胞或细胞系内的mrna表达水平进行敲低，筛选降解效果最好的变体，进行普适性实验；
12、3)在hek293t细胞中共转染步骤2)筛选得到的最好的变体和靶向nras、ppib、survivin和myc mrna的grna质粒，诱导48h后收集细胞，然后利用qrt-pcr技术检测细胞内nras、ppib、survivin和myc mrna表达水平；
13、4)通过qpcr分析靶向ppib基因的nras mrna的表达水平，来评估脱靶率。
14、与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
15、本发明通过对毒素蛋白mqsr和mazf的氨基酸序列进行定点突变，与dcas6蛋白融合后，得到dcas6-toxin变体融合蛋白，并利用双荧光报告系统筛选出了高邻近切割活性和低非特异性降解活性的融合蛋白，其可应用于细胞内源性rna的降解，对于rna的靶向治疗具有重要作用。
1.一种rna降解活性降低的dcas6-毒素变体融合蛋白，其特征在于，其为dcas6-nes-3×ggs-mqsr变体融合蛋白或dcas6-nes-3×ggs-mazf变体融合蛋白，dcas6-nes-3×ggs-mqsr变体融合蛋白中的mqsr毒素变体是在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生如下突变：y61a/k98a或h7a/m58a/k98a；dcas6-nes-3×ggs-mazf变体融合蛋白中的mazf毒素变体是在氨基酸序列seq id no.2的基础上发生如下突变：s55a/k56a/g57a/y58a或r29s/i81a。
2.如权利要求1所述的一种rna降解活性降低的dcas6-毒素变体融合蛋白，其特征在于，mqsr毒素蛋白和mazf毒素蛋白来源包括escherichia coli str.k-12substr.mg1655细菌。
3.一种如权利要求1或2所述的rna降解活性降低的dcas6-毒素变体融合蛋白的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.一种如权利要求1或2所述的rna降解活性降低的dcas6-毒素变体融合蛋白的应用，包括如下步骤：
