本发明属于植物生物，具体涉及甘蓝型油菜bnbpr1基因及其在油菜根肿病防控中的应用。
背景技术：
1、根肿病由芸薹根肿菌导致，能够专性危害十字花科作物，属于土传病害。根肿病主要影响植物根部的正常生长，发病植株根部形成肿瘤状的肿大块茎，每年造成十字花科作物产量降低20％-30％，严重时高达60％以上。相比传统农业防治手段，选育根肿病抗性品种是最为绿色、环保、经济可行的措施。在芸薹属种质资源中，目前发现的抗性材料大多数都来源于芜菁，最早应用于甘蓝型油菜中的抗性位点也来源于芜菁。早期，研究者通过人工种间杂交合成了甘蓝型油菜，进而将芜菁(ecd04)中的抗病位点导入，最终选出抗根肿病的品种mendel。目前，国内的研究者也通过将芜菁中的抗病位点导入甘蓝型油菜中选育出华油杂62r、垦油杂741r及华油杂706r等抗根肿病的新品种。目前市场上出现的甘蓝型油菜抗根肿病品种都是通过导入外源根肿病抗性基因选育而来，但导入外源基因的同时可能会伴随着一些不利的性状，最终影响作物的品质和农艺性状，且选育的周期较长。已经报道的根肿病抗性位点如白菜中的crr1、crr2、crr4、crd以及芜菁中的crb和crr3等只有极少数的基因如crb被应用于甘蓝型的抗性改良中，缺乏可用于抗性改良的油菜抗病基因和抗源材料。因而，挖掘新的油菜根肿病抗性基因，创制新的油菜抗根肿病材料对油菜根肿病的防治和抗病品种选育至关重要。
2、遗传变异是作物分子育种的源动力，crispr基因编辑技术的兴起为创制作物遗传变异提供了更高效的途径。crispr技术提供了一种快速的方式来产生理想的种质，可通过删除造成不良性状的负调控遗传元件，或者通过精确的基因组编辑引入功能获得性突变。近年来，随着基因组编辑技术的快速发展，作物遗传育种的进程大大加速，该项技术已经被广泛运用于水稻、小麦、玉米等各类作物的产量、品质和抗性改良中。结合基因编辑技术和油菜转基因技术，创制抗根肿病种质和抗性品种是病害绿色防控的经济有效和安全的途径。
技术实现思路
1、鉴定关键的抗根肿病调控基因，通过生物技术创制并合理利用高抗材料，对于油菜根肿病的防控与绿色发展至关重要。基于此，通过广泛深入的研究，本发明发现了油菜bnbpr1基因的抗病功能应用。
2、本发明的一个方面，本发明提供了一种甘蓝型油菜抗根肿病基因bnbpr1，所述bnbpr1基因包括2个同源拷贝，分别为bnaa10.pbr1基因和bnac09.pbr1基因；其中bnaa10.pbr1的核苷酸序列如seq id no.1所示，bnac09.pbr1的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3、本发明的一个方面，本发明提供了bnbpr1基因在根肿菌防控中的应用，通过基因编辑技术敲除油菜bnbpr1基因的两个同源拷贝bnaa10.pbr1和bnac09.pbr1，纯合双突变体，下调bnbpr1基因的表达来对油菜根肿病进行防控。
4、本发明的一个方面，本发明提供了一种抗根肿病油菜的制备方法，所述方法包括通过基因编辑技术敲除油菜bnbpr1基因的两个同源拷贝bnaa10.pbr1和bnac09.pbr1，获得对根肿病抗性增强的纯合双突变体转基因油菜新材料。
5、在本发明的一个实施例中，通过在油菜中获得纯合双突变转基因来获得对根肿病抗性的油菜材料，所述方法，通过以下步骤实现：
6、(1)设计能同时靶向bnaa10.pbr1和bnac09.pbr1的sgrna，将该序列克隆到crispr/cas9载体上；其中sgrna序列如seq id no.3和seq id no.4所示，bnaa10.pbr1的核苷酸序列如seq id no.1所示，bnac09.pbr1的核苷酸序列如seq id no.2所示；
7、(2)将步骤(1)中含sgrna的敲除载体crispr/cas9-bnbpr1通过电击转化法导入对油菜侵染能力强的农杆菌菌株gv3101中；
8、(3)通过农杆菌侵染油菜下胚轴的遗传转化方法将上述农杆菌载体转入油菜，获得转基因油菜植株；
9、(4)对上述获得的转基因植株进行检测，筛选鉴定出成功编辑两个拷贝且基因型纯合的转基因植株。
10、本发明以westar品种为背景，通过crispr/cas9技术敲除了油菜中bnbpr1的两个同源拷贝基因(bnaa10.pbr1和bnac09.pbr1)，获得纯合的双拷贝突变体株系，具体突变类型如表1所示。与非转基因野生型相比，纯合双突变体抗根肿病的能力增强，对根肿菌更抗病，说明bnbpr1强烈负调控油菜对根肿菌的抗性。
11、本发明的优点
12、本发明提供的油菜bnbpr1基因是优质抗根肿病调控基因资源，敲除该基因的两个同源拷贝bnaa10.pbr1和bnac09.pbr1获得的纯合双突变体对根肿菌的抗性显著增强。bnbpr1基因属于甘蓝型油菜内源基因，利用该基因获取的抗病材料具有抗病性较强、规避了导入外源抗性基因可能携带不利基因片段等优点。传统育种方法存在抗病资源受天然遗传隔离限制，选育周期长，耗时费力等弊端，而利用抗病调控基因的基因工程育种方法则具有抗病资源更广泛、操作简单、周期短、经济、适宜培育广谱、持久、高抗病性品种等优点。结合基因编辑技术和油菜转基因技术，利用bnbpr1基因创制抗根肿病种质和抗性品种是病害绿色防控的经济有效和安全的途径，为油菜根肿病的防治，以及油菜抗病品种的选育奠定了基础。
13、本发明利用甘蓝型油菜bnbpr1基因，采用基因工程方法，创制高抗根肿病的油菜材料，具有周期短，选育快速等特点，同时为油菜bnbpr1基因功能研究和植物免疫抗菌机制研究奠定基础。
1.一种甘蓝型油菜抗根肿病基因bnbpr1，其特征在于，bnbpr1基因包括2个同源拷贝，分别为bnaa10.pbr1基因和bnac09.pbr1基因；其中bnaa10.pbr1的核苷酸序列如seq idno.1所示，bnac09.pbr1的核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的bnbpr1基因在根肿病防控中的应用，其特征在于，通过敲除bnbpr1基因中的两个同源拷贝获得纯合双突变体，下调bnbpr1基因的表达来对油菜根肿病进行防控。
3.一种甘蓝型油菜抗根肿菌能力的筛选方法，其特征在于，通过检测甘蓝型油菜的bnbpr1基因，如果bnbpr1基因的2个同源拷贝bnaa10.pbr1基因和bnac09.pbr1基因的功能缺失，成为纯合双突变体，则该甘蓝型油菜抗根肿菌能力强。
4.一种获得抗根肿菌的甘蓝型油菜的方法，其特征在于，通过敲除甘蓝型油菜的bnbpr1基因中的两个同源拷贝获得纯合双突变体，进而得到抗根肿菌的甘蓝型油菜。
5.一种甘蓝型油菜bnbpr1基因纯合双突变体植株的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，其中sgrna序列如seq id no.3和seqid no.4所示，bnaa10.pbr1的核苷酸序列如seq id no.1所示，bnac09.pbr1的核苷酸序列如seq id no.2所示。
