本发明涉及维生素c生产，尤其是涉及一种一步法发酵生产2-kga的外源表达系统及构建方法和应用。
背景技术：
1、维生素c(vitamin c)又称为l-抗坏血酸(l-ascorbic acid)，广泛分布在植物组织中，新鲜水果及蔬菜中含量尤多，是生物体中具有多效功能的必需化合物，在保护生物体必需的生物分子(蛋白质、脂质、碳水化合物、dna和rna等)免受自由基(如羟基自由基、超氧化物、单线态氧和过氧化氢)损害方面发挥着重要作用，广泛应用于食品、饮料、制药、化妆品和饲料等领域。
2、维生素c的工业化生产，从其历史发展进程看可以分为浓缩提取、化学合成和生物发酵三个阶段。浓缩提取生产方法发生于19世纪二三十年代，人们对于维生素c的结构、性质不了解的时期，此方法生产成本高，产量极其有限，远远不能满足人们的需求。
3、化学合成阶段以“莱氏法”为代表：以d-葡萄糖为原料，在镍的催化作用下，高温高压加氢还原成d-山梨醇，然后利用一步发酵氧化成l-山梨糖，然后在丙酮和硫酸的作用下，经酮化生成双丙酮-l-山梨糖，再用苯或甲苯提取、水法除去单酮山梨糖、蒸去溶剂分离出双酮糖，然后在高锰酸钠氧化、铂催化下，水解生成2-酮基-l-古龙酸(2-kga)，再通过烯醇化和内酯化，在酸性或碱性条件下转化成维生素c。由于原料便宜易得、产品质量好、收率较高，但存在工序复杂，难连续化操作，劳动强度大，需要大量有毒、易燃化学品，环境污染严重等许多不足。
4、之后各国科学家开始探索以细菌生物酶转化的方法来取代“莱氏法”，已成功应用的“二步发酵法”与“莱氏法”不同之处在于采用大、小混合菌发酵法代替化学法转化l-山梨糖合成2-酮基-l-古龙酸，简化了生产工艺、减少了生产设备投资、去除了大量有机溶媒等有毒物品的使用，极大地减少了“三废”的排放。
5、但是随着对维生素c需求的日益增长，三菌两步法(“二步发酵法”)高能耗、高物耗、混菌发酵难以精确调控和育种困难等劣势慢慢凸显，探索/开发可行的一步法发酵生产2-kga的工艺成为研究人员的共同目标。三菌两步法生产维生素c中，由山梨醇生产2-kga主要包括以下几个步骤，分别为通过d-山梨醇脱氢酶将d-山梨醇转化为l-山梨糖，通过l-山梨糖脱氢酶(ssdh)将l-山梨糖转化为l-山梨酮，通过山梨酮脱氢酶(gsdh)将l-山梨酮转化为2-kga。而目前开发的一步法发酵生产2-kga的生产效率，相较于现有技术还有很大差距。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种一步法发酵生产2-kga的外源表达系统及构建方法和应用，以实现直接由d-山梨醇得到2-kga，达到降低菌株培养、转化、发酵的工作量，缩短维生素c生产周期，降低生产成本的目的。
2、为实现上述目的，本发明提供一种一步法发酵生产2-kga的外源表达系统，所述外源表达系统为将重组表达质粒转入氧化葡萄糖酸杆菌构成；重组表达质粒包括ssdh和gsdh片段，ssdh的序列如seq id no.1所示，gsdh的序列如seq id no.2所示。
3、优选的，氧化葡萄糖酸杆菌保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc1.110。
4、优选的，所述重组表达质粒以pbla质粒为基本骨架，经添加酶切位点、抗性基因、ssdh和gsdh片段构成。
5、一种如上所述的重组表达质粒。
6、包含上述重组表达质粒的工程菌。
7、一种如上所述的一步法发酵生产2-kga的外源表达系统、重组表达质粒或工程菌在2-kga生产中的应用。
8、一种如上所述的一步法发酵生产2-kga的外源表达系统、重组表达质粒或工程菌在维生素c生产中的应用。
9、一种如上所述的一步法发酵生产2-kga的外源表达系统的构建方法，步骤如下：
10、s1、获得酮古龙酸杆菌的基因组；
11、s2、获得基因组中的ssdh、gsdh基因片段；
12、s3、构建包含ssdh、gsdh的重组表达载体；
13、s4、获得包含步骤s3构建的重组表达载体的重组氧化葡萄糖酸杆菌菌株；
14、s5、对步骤s4获得的重组氧化葡萄糖酸杆菌菌株进行发酵培养，收集纯化即可获得2-kga。
15、优选的，所述酮古龙酸杆菌为spu b805酮古龙酸杆菌菌株。
16、优选的，所述步骤s2中获得ssdh基因片段的上游引物序列如seq id no.3所示，下游引物序列如seq id no.4所示，获得gsdh基因片段的上游引物序列如seq id no.5所示，下游引物序列如seq id no.6所示。
17、因此，本发明提供的一种一步法发酵生产2-kga的外源表达系统及构建方法和应用，其具体技术效果如下：
18、(1)本发明创造性地将酮古龙酸杆菌中的ssdh、gsdh基因在氧化葡萄糖酸杆菌中进行异源表达，使氧化葡萄糖酸杆菌具备ssdh、gsdh的功能，实现了由氧化葡萄糖酸杆菌一步发酵生产2-kga；
19、(2)应用本发明提供的外源表达系统可以实现直接由d-山梨醇得到2-kga，大幅降低菌株培养、转化、发酵的工作量，从而大幅缩短由d-山梨醇得到2-kga的周期；大幅降低维生素c生产过程的工作量，大幅缩短生产周期，进而大幅降低生产成本；
20、(3)本发明提供的外源表达系统构建方法简单易操作，可以用于维生素c的大规模生产。
21、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
1.一种一步法发酵生产2-kga的外源表达系统，其特征在于：所述外源表达系统为将重组表达质粒转入氧化葡萄糖酸杆菌构成；重组表达质粒包括gsdh和ssdh片段，gsdh的序列如seq id no.1所示，ssdh的序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种一步法发酵生产2-kga的外源表达系统，其特征在于：氧化葡萄糖酸杆菌保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc1.110。
3.根据权利要求1所述的一种一步法发酵生产2-kga的外源表达系统，其特征在于：所述重组表达质粒以pbla质粒为基本骨架，经添加酶切位点、抗性基因、ssdh和gsdh片段构成。
4.一种如权利要求1或2所述的重组表达质粒。
5.包含权利要求4所述重组表达质粒的工程菌。
6.一种如权利要求1-3任一项所述的一步法发酵生产2-kga的外源表达系统、权利要求4所述的重组表达质粒或权利要求5所述的工程菌在2-kga生产中的应用。
7.一种如权利要求1～3任一项所述的一步法发酵生产2-kga的外源表达系统、权利要求4所述的重组表达质粒或权利要求5所述的工程菌在维生素c生产中的应用。
8.一种如权利要求1～3任一项所述的一步法发酵生产2-kga的外源表达系统的构建方法，其特征在于，步骤如下：
9.根据权利要求8所述的一种一步法发酵生产2-kga的外源表达系统的构建方法，其特征在于：所述酮古龙酸杆菌为spu b805酮古龙酸杆菌菌株。
10.根据权利要求8所述的一种一步法发酵生产2-kga的外源表达系统的构建方法，其特征在于：所述步骤s2中获得ssdh基因片段的上游引物序列如seq id no.5所示，下游引物序列如seq id no.6所示，获得gsdh基因片段的上游引物序列如seq id no.3所示，下游引物序列如seq id no.4所示。
