本发明属于基因工程，具体为一种与柑橘属植物抗性和叶片表皮蜡质含量相关的mirna及其应用。
背景技术：
1、柑橘属植物是我国南方主栽果树，具有重要的经济价值。柑橘属植物目前主要仍是以室外种植为主，自然气候中的非生物胁迫(低温、干旱和高盐等)严重限制了柑橘的生长发育、产量、品质和地理分布。近几十年来，研究人员为阐明植物适应干旱和盐胁迫的分子机制进行了大量研究，并且已经确立了转录和转录后基因表达调控是植物对抗这两种胁迫的重要策略。表皮蜡质是覆盖在柑橘属植物陆生器官表皮的一层疏水屏障，具有防止柑橘属植物非气孔失水的重要功能，因而与柑橘属植物抵御干旱和高盐等非生物胁迫密切相关。因此，利用现代的基因工程育种提高柑橘属植物表皮蜡质含量，进而提高柑橘属植物耐旱耐盐性，仍然是育种工作的重要方向。
2、植物mirna是一类大约20-24个核苷酸的非编码rna(non-coding rna，ncrna)。mirna在转录后遗传调控中的重要作用已经在不同的植物物种中进行了广泛的研究和表征，包括调节植物生长、发育以及对生物和非生物胁迫的响应。mirna主要通过两种作用机制调控靶基因：一是直接切割靶标mrna；二是抑制靶标mrna的翻译。例如，过表达大豆mir172c可以增强拟南芥的耐旱耐盐性；在水稻中过表达mir393会导致植株分蘖增加、开花提早以及耐盐性和耐旱性降低；马铃薯mir811、mir814、mir835和mir4398被鉴定为调节干旱相关mirna。
3、目前，关于mirna调控植物表皮蜡质合成的报道仅有几例。例如，水稻osa-mir1848可抑制表皮蜡质合成。拟南芥mirw1负调控蜡质成分中的β-二酮积累。通过高通量测序从蜡质缺失型油菜中筛选出的bna-mir165a-5p可抑制油菜蜡质积累。但是，尚未见mirna调控柑橘表皮蜡质合成的报道。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与柑橘属植物抗性和叶片表皮蜡质含量相关的mirna及其应用，所述mirna命名为csi-mirn0008，本发明通过sttm技术获得csi-mirn0008沉默表达载体，再将该载体导入目的植物中，能够有效地调节植物(尤其是柑橘属植物)的叶片表皮蜡质含量、抗旱性和抗盐性。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
3、本发明提供了一种与柑橘属植物抗性和叶片表皮蜡质含量相关的mirna，所述mirna命名为csi-mirn0008，其成熟序列如seq id no.1所示；所述csi-mirn0008的前体序列如seq id no.2所示。
4、优选地，用于编码csi-mirn0008的前体序列的dna分子，其核苷酸序列如seq idno.3所示。
5、本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体携带含有csi-mirn0008的模拟靶标串联序列的表达盒，所述csi-mirn0008的模拟靶标串联序列如seq id no:4所示。
6、本发明还提供了一种含有所述表达载体的工程菌。
7、本发明还提供了一种提高柑橘属植物抗性和叶片表皮蜡质含量的方法，通过抑制柑橘属植物中所述mirna的表达，提高柑橘属植株的抗性和叶片表皮蜡质含量。
8、优选地，所述抗性包括抗旱性和抗盐性。
9、优选地，将合成的csi-mirn0008模拟靶标串联序列与线性d35s-pbi121载体连接构建csi-mirn0008沉默表达载体；采用农杆菌介导的方法，将构建好的csi-mirn0008沉默表达载体导入柑橘属植株，培育得到叶片表皮蜡质含量增加和抗性强的转基因柑橘属植株。
10、更优选地，所述d35s-pbi121载体具有2×35s启动子驱动。
11、更优选地，所述农杆菌为农杆菌gv3101。
12、本发明还提供了一种所述的mirna或所述表达载体或所述工程菌或所述方法在改良柑橘属植物抗性品种和/或提高柑橘属植物叶片表皮蜡质含量中的应用。
13、本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
14、本发明将从纽荷尔脐橙中提取的csi-mirn0008应用于调节植物的叶片表皮蜡质含量、耐旱性和耐盐性，有利于研究植物对逆境胁迫的响应机理，从而培育耐逆性植物。本发明将编码csi-mirn0008的前体序列的dna分子通过sttm技术获得csi-mirn0008沉默表达载体，再将该载体导入目的植物中，能够有效地调节植物(尤其是柑橘)的叶片表皮蜡质含量、耐旱性和耐盐性。本发明调控柑橘叶片表皮蜡质合成和耐旱耐盐性mirna的发现是柑橘耐逆性分子生物学研究领域的一项重大突破，为改良柑橘的耐逆性提供了一条新思路。本发明的提出丰富了现有mirna领域的研究成果，为培育柑橘耐逆新品种奠定理论基础和提供优质基因资源。
1.一种与柑橘属植物抗性和叶片表皮蜡质含量相关的mirna，其特征在于，所述mirna命名为csi-mirn0008，其成熟序列如seq id no.1所示；所述csi-mirn0008的前体序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述与柑橘属抗性和叶片表皮蜡质含量相关的mirna，其特征在于，用于编码csi-mirn0008的前体序列的dna分子，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带含有csi-mirn0008的模拟靶标串联序列的表达盒，所述csi-mirn0008的模拟靶标串联序列如seq id no:4所示。
4.含有权利要求3所述表达载体的工程菌。
5.一种提高柑橘属植物抗性和叶片表皮蜡质含量的方法，其特征在于，通过抑制柑橘属植物中权利要求1或2所述mirna的表达，提高柑橘属植株的抗性和叶片表皮蜡质含量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗性包括抗旱性和抗盐性。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将合成的csi-mirn0008模拟靶标串联序列与线性d35s-pbi121载体连接构建csi-mirn0008沉默表达载体；采用农杆菌介导的方法，将构建好的csi-mirn0008沉默表达载体导入柑橘属植株，培育得到叶片表皮蜡质含量增加和抗性强的转基因柑橘属植株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述d35s-pbi121载体具有2×35s启动子驱动。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为农杆菌gv3101。
10.权利要求1或2所述的mirna或权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的工程菌或权利要求5～9任意一项所述方法在改良柑橘属植物抗性品种和/或提高柑橘属植物叶片表皮蜡质含量中的应用。
