本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及高甜甙罗汉果新品种特异性rapd分子标记鉴定引物及其方法、应用。
背景技术：
1、罗汉果(siraitia grosvenorii)是广西特有的一种药食同源的葫芦科植物，具有清热润肺，止咳祛痰，滑肠通便等作用，其主要成分罗汉果甜甙v是一种零热量的纯天然甜味剂，为蔗糖浓度的300—400倍。由于罗汉果具有药用和食用的功能，在国内外都受到广泛的欢迎。日渐增大的市场需求促进农民种植罗汉果的积极性，使得罗汉果种植面积迅速增加，但多年的人工驯化及选种，均追求着罗汉果产量上升，这使得市场上的栽培罗汉果种质逐渐减少，趋向单一，缺少高甜甙含量的品种。选育出高产优质、抗逆性强的优良品种，是打开罗汉果终端产品市场，推动产业进步的重中之重，而新品种的鉴定，也成为罗汉果新品种保护的关键一环。
2、rapd技术是一种以pcr为基础的分子标记技术，该技术是以生物基因组dna为模板，以一个长度约为10bp的核苷酸序列作为随机引物，通过pcr扩增，产生若干单引物扩增产物，经凝胶电泳呈现目的扩增片段。选定对高甜甙罗汉果新品种具有高度特异性的的rapd引物，高效地扩增出其特异性目标片段，通过与常规罗汉果的扩增产物凝胶电泳图对比，可以快速鉴别高甜甙罗汉果新品种与其余常规种苗。
技术实现思路
1、本发明的目的之一为提供高甜甙罗汉果新品种特异性rapd分子标记鉴定引物。
2、本发明所述的高甜甙罗汉果新品种为申请人自主选育获得的高甜甙罗汉果新品种ly1，其成熟果实甜甙v含量较常规品种高20％，具有更高的提取应用价值。为有效区分该罗汉果新品种与现有不同产品地的不同来源罗汉果品种，发明人通过华大基因的oligo合成服务合成了367个随机引物用于高甜苷罗汉果新品种特异性rapd分子标记鉴定引物的初步筛选，最后发现了rp1-pr10共10个可以表达高甜甙罗汉果新品种特异性rapd分子标记(如图1-10所示)。为了验证rp1-pr10 rapd分子标记的可靠性，发明人将9种常规品罗汉果与高甜甙罗汉果新品种ly1使用rp1-pr10进行pcr分子检测发现，高甜苷罗汉果新品种ly1相较于9种常规品罗汉果的扩增产物中，均有清晰的特异性目标片段区分高甜甙罗汉果新品种ly1与9个常规种苗(如图11-20)。
3、具体地，高甜甙罗汉果新品种特异性rapd分子标记鉴定引物，包括一个或任意两个以上以下所述rapd随机引物：
4、rp1：acggtaccag；
5、rp2：cagcgacaag；
6、rp3：tgcccagcct；
7、rp4：tcgcatccct；
8、rp5：ggctgcgaca；
9、rp6：gacacggacc；
10、rp7：ccgaacacgg；
11、rp8：aagcccgagg；
12、rp9：tggtcgcaga；
13、rp10：cccgatcaga。
14、本发明的目的之二是高甜甙罗汉果新品种特异性rapd分子标记鉴定引物在区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种中的应用。
15、本发明的目的之三是提供高甜甙罗汉果新品种特异性rapd分子标记鉴定方法。
16、具体地，高甜甙罗汉果新品种特异性rapd分子标记鉴定方法，以罗汉果的总dna为模板，采用上述rapd随机引物rp1-rp10任一或任意两个以上进行pcr扩增，根据扩增产物目标片段鉴定。
17、根据扩增结果，使用引物rp1进行pcr扩增时，在分子量1.3kb具有一条特异性条带；使用引物rp2进行pcr扩增时，在分子量1.5kb具有一条特异性条带；使用引物rp3进行pcr扩增时，在分子量1.3kb和1.8kb分别具有一条特异性条带；使用引物rp4进行pcr扩增时，在分子量0.6kb具有一条特异性条带；使用引物rp5进行pcr扩增时，在分子量1.3kb左右多一条特异性条带；使用引物rp6进行pcr扩增时，在分子量1.4kb具有一条特异性条带；使用引物rp7进行pcr扩增时，在分子量1.2kb具有一条特异性条带；使用引物rp8进行pcr扩增时，在分子量1kb具有一条特异性条带；使用引物rp9进行pcr扩增时；在分子量1.6k左右和1.7kb左右多一条特异性条带；使用引物rp10进行pcr扩增时，在分子量1.3kb具有一条特异性条带。
18、本发明目的之四为提供所述高甜甙罗汉果新品种特异性rapd分子标记鉴定引物在区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的应用。
19、本发明目的之四为提供区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
20、1)提取待测罗汉果的总dna；
21、2)以所提取的总dna为模板，采用权利要求1所述的任一引物进行pcr，得到扩增产物；
22、3)所述扩增产物进行电泳，对比所述高甜甙罗汉果新品种与其他来源的罗汉果品种扩增产物目标片段的差异，将其区分。
23、根据扩增结果，较其余不同来源罗汉果扩增产物目标片段，高甜甙罗汉果新品种的扩增产物在分子量0.6kb、1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb和1.8kb分别具有一条特异性条带。
24、具体地，高甜甙罗汉果新品种扩增中，使用引物rp1进行pcr扩增时，在分子量1.3kb具有一条特异性条带；使用引物rp2进行pcr扩增时，在分子量1.5kb具有一条特异性条带；使用引物rp3进行pcr扩增时，在分子量1.3kb和1.8kb分别具有一条特异性条带；使用引物rp4进行pcr扩增时，在分子量0.6kb具有一条特异性条带；使用引物rp5进行pcr扩增时，在分子量1.3kb左右多一条特异性条带；使用引物rp6进行pcr扩增时，在分子量1.4kb具有一条特异性条带；使用引物rp7进行pcr扩增时，在分子量1.2kb具有一条特异性条带；使用引物rp8进行pcr扩增时，在分子量1kb具有一条特异性条带；使用引物rp9进行pcr扩增时，在分子量1.6k左右和1.7kb左右多一条特异性条带；使用引物rp10进行pcr扩增时，在分子量1.3kb具有一条特异性条带。
25、本发明中，pcr体系为25μl，包含：ddh2o 17μl，各罗汉果总dna 2μl，dntp 1μl，rapd引物2μl，ex taq聚合酶3μl。pcr反应的条件为：95℃5min，然后95℃30sec，35℃30sec，72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。
26、本发明的有益效果：
27、1.rapd所用引物为随机引物，没有严格的种属界限，具有广泛性、通用性且不需要预先知道基因组信息。
28、2.rapd实验中dna用量很少，纯度要求不高，实验过程简单，工作进度快且成本较低；
29、3.筛选得到的10个rapd随机引物对于自行选育获得的高甜甙罗汉果新品种有高度特异性，能明显将其与其他常规罗汉果品种区分开来。
1.高甜甙罗汉果新品种特异性rapd分子标记鉴定引物，其特征在于，包括一个或任意两个以上以下所述rapd随机引物：
2.高甜甙罗汉果新品种特异性rapd分子标记鉴定方法，其特征在于，以罗汉果的总dna为模板，采用任一或任意两个以上以下所述rapd随机引物进行pcr扩增，根据扩增产物目标片段鉴定：
3.权利要求1所述高甜甙罗汉果新品种特异性rapd分子标记鉴定引物在区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种中的应用。
4.区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法，其特征在于，使用引物rp1进行pcr扩增时，在分子量1.3kb具有一条特异性条带，为高甜甙罗汉果新品种。
6.根据权利要求4所述的区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法其特征在于，使用引物rp2进行pcr扩增时，在分子量1.5kb具有一条特异性条带，为高甜甙罗汉果新品种。
7.根据权利要求4所述的区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法其特征在于，使用引物rp3进行pcr扩增时，在分子量1.3kb和1.8kb分别具有一条特异性条带，为高甜甙罗汉果新品种。
8.根据权利要求4所述的区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法其特征在于，使用引物rp4进行pcr扩增时，在分子量0.6kb具有一条特异性条带，则为高甜甙罗汉果新品种。
9.根据权利要求4所述的区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法其特征在于，使用引物rp5进行pcr扩增时，在分子量1.3kb左右多一条特异性条带，则为高甜甙罗汉果新品种。
10.根据权利要求4所述的区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法其特征在于，使用引物rp6进行pcr扩增时，在分子量1.4kb具有一条特异性条带，则为高甜甙罗汉果新品种。
11.根据权利要求4所述的区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法其特征在于，使用引物rp7进行pcr扩增时，在分子量1.2kb具有一条特异性条带，则为高甜甙罗汉果新品种。
12.根据权利要求4所述的区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法其特征在于，使用引物rp8进行pcr扩增时，在分子量1kb具有一条特异性条带，则为高甜甙罗汉果新品种。
13.根据权利要求4所述的区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法其特征在于，使用引物rp9进行pcr扩增时，高甜甙罗汉果新品种较其余不同来源罗汉果，在分子量1.6k左右和1.7kb左右多一条特异性条带，则为高甜甙罗汉果新品种。
14.根据权利要求4所述的区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法其特征在于，使用引物rp10进行pcr扩增时，在分子量1.3kb具有一条特异性条带，则为高甜甙罗汉果新品种。
15.根据权利要求4所述的区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法所述pcr体系为25μl，包含：ddh2o 17μl，各罗汉果总dna2μl，dntp 1μl，rapd引物2μl，ex taq聚合酶3μl。
16.根据权利要求4所述的区分高甜甙罗汉果新品种和不同来源罗汉果品种的方法所述pcr反应的条件为：95℃5min，然后95℃30sec，35℃30sec，72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。
