本发明属于生物育种，具体涉及一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法及应用。
背景技术：
1、转基因技术、分子标记辅助育种等生物育种技术已广泛的应用于现代农作物育种当中，这必然会大规模的鉴定转基因玉米材料(包括超表达玉米和基因编辑玉米)、分子标记等。
2、目前传统的ctab法提取dna耗时较长、人工成本高，并且不适合大量样品提取；而采用试剂盒提取dna需要配套的耗材试剂，步骤较多、成本高，而且提取样品数目受限。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法，包括如下步骤：
4、s1、取样：选取生长发育良好的玉米植株，用打孔器从叶片中部取圆形叶片1片，放于深孔板中，所述在深孔板预装1粒钢珠；
5、s2、研磨：样品在液氮中速冻1min，然后用高通量组织研磨机研磨，单次可以研磨96×2个样品；
6、s3、水浴：向磨好的样品中加入50μl naoh溶液，在98℃-100℃水中水浴10min；
7、s4、中和：将样品从沸水中取出，加入50μl的te溶液，中和s3步骤中的碱性，此混合液即含有样品dna，用于pcr扩增反应；
8、s5、dna提取物后续相关实验：待s4中样品室温放置30min，12000rpm室温离心1min后，取上清液3μl作模板，用于pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，同时pcr扩增产物混合后可用于下一代基因测序。
9、优选的，所述步骤s1中玉米植株为3叶至10叶期的玉米植株，所取圆形叶片不含有主叶脉，圆形叶片直径为0.5-0.6cm。
10、优选的，所述步骤s1中深孔板为96孔，可装96个样品，所述步骤s1中钢珠直径为3mm，所述步骤s2高通量组织研磨机型号为scientz-192，震动频率设置为20，研磨时间为1min，单次研磨样品数目为192个。
11、优选的，所述步骤s3中naoh溶液关键在于浓度为100mm，其配制方法为：用电子天平称取4g naoh固体粉末于烧杯中，超纯水溶解后用量筒定容至1l。
12、优选的，所述步骤s4中te溶液关键在于浓度10mm，ph＝2.0，用以中和s3步骤中的碱性，有利于后续的pcr扩增，te溶液配制方法为：用电子天平称取1.2114g tris碱固体粉末于烧杯中，800ml超纯水溶解，用浓hcl调ph至2.0，用量筒定容至1l，浓度为10mm。
13、优先的，所述步骤s5中pcr反应液组成为：正向引物/反向引物(浓度10mm)各0.4μl，dna模板3μl，2×taq master mix(dye plus)，超纯水补足至20μl，pcr反应程序为：95℃预变性3min，95℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环，72℃5min。
14、优先的，所述步骤s5中pcr扩增引物序列为：zmhsp3-crispr-f1：atcacgtttgtgaggagagctttgaggg，
15、zmhsp3-crispr-r1：tgcgatctatctcctggttcagcacgtc。
16、优先的，所述步骤s5中琼脂糖凝胶电泳方法步骤为：1％琼脂糖凝胶，每个胶孔上样5μl，电压140v，运行10min后凝胶成像仪检测。
17、优先的，所述步骤s5中pcr扩增产物每个样品各取3μl，96×2个样品混合一起用于下一代基因测序。
18、一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法在超表达转基因玉米材料检测、基因编辑材料检测、遗传图谱构建、分子标记辅助育种、品种纯度或真实性鉴定中应用。
19、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
20、1、本发明对样品需求量很少、所需玉米叶片直径仅约0.6cm，对于某些珍贵的转基因材料友好；对样品要求低，从早期比如3叶期就可以取材鉴定；
21、2、成本低、提取试剂为实验室常见的naoh和tris、用量很少、配制简单，一次配1l的提取试剂可以提取大约20000个样品；提取过程中不需要异丙醇、异戊醇和氯仿等强腐蚀性有机溶剂，安全无毒、无污染；
22、3、操作简便、提取时间非常短、通量高，一人一天8小时可以提取大约3000个样品；
23、4、所提取的dna混合液完全满足下游pcr扩增反应以及pcr产物可用于下一代测序，对高通量鉴定基因编辑材料、突变体材料、转基因材料、遗传图谱构建、分子标记等适用。
1.一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法，其特征在于：所述步骤s1中玉米植株为3叶至10叶期的玉米植株，所取圆形叶片不含有主叶脉，圆形叶片直径为0.5-0.6cm。
3.根据权利要求1所述的一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法，其特征在于：所述步骤s1中深孔板为96孔，可装96个样品，所述步骤s1中钢珠直径为3mm，所述步骤s2高通量组织研磨机型号为scientz-192，震动频率设置为20，研磨时间为1min，单次研磨样品数目为192个。
4.根据权利要求1所述的一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法，其特征在于：所述步骤s3中naoh溶液关键在于浓度为100mm，其配制方法为：用电子天平称取4g naoh固体粉末于烧杯中，超纯水溶解后用量筒定容至1l。
5.根据权利要求1所述的一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法，其特征在于：所述步骤s4中te溶液关键在于浓度10mm，ph＝2.0，用以中和s3步骤中的碱性，有利于后续的pcr扩增，te溶液配制方法为：用电子天平称取1.2114g tris碱固体粉末于烧杯中，800ml超纯水溶解，用浓hcl调ph至2.0，用量筒定容至1l，浓度为10mm。
6.根据权利要求1所述的一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法，其特征在于：所述步骤s5中pcr反应液组成为：正向引物/反向引物(浓度10mm)各0.4μl，dna模板3μl，2×taq master mix(dye plus)，超纯水补足至20μl，pcr反应程序为：95℃预变性3min，95℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环，72℃5min。
7.根据权利要求1所述的一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法，其特征在于：所述步骤s5中pcr扩增引物序列为：zmhsp3-crispr-f1：atcacgtttgtgaggagagctttgaggg，
8.根据权利要求1所述的一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法，其特征在于：所述步骤s5中琼脂糖凝胶电泳方法步骤为：1％琼脂糖凝胶，每个胶孔上样5μl，电压140v，运行10min后凝胶成像仪检测。
9.根据权利要求1所述的一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法，其特征在于：所述步骤s5中pcr扩增产物每个样品各取3μl，96×2个样品混合一起用于下一代基因测序。
10.根据权利要求1-9任一所述的一种适用于pcr扩增高效玉米叶片dna提取方法在超表达转基因玉米材料检测、基因编辑材料检测、遗传图谱构建、分子标记辅助育种、品种纯度或真实性鉴定中应用。
