本发明涉及植物病毒学和分子生物学，具体涉及一种突变型质粒载体及制备方法和应用，具体涉及用于防治番茄褐色皱纹果病毒的突变型质粒载体。
背景技术：
1、病毒病是仅次于真菌病的第二大类植物病害，对绝大部分作物均造成不同程度的危害，植物病毒病的防治是研究热点及难点问题。黄瓜花叶病毒（cucumer mosaic virus，cmv）是目前已知的寄主范围最广的植物病毒之一，可侵染100多科1222多种植物，造成多种具有重要经济价值的植物（农作物、园艺作物等）出现黄化、矮化、畸形等症状，严重影响其产量和品质(mochizuki et al., 2012)。番茄褐色皱纹果病毒（tobrfv）属于杆状病毒科（ virgavirudea）烟草花叶病毒属（ tobamovirus）。tobrfv最早于2015年由约旦科学家首次鉴定和报道(salem et al., 2016)。此后，该病毒在世界范围内迅速蔓延，陆续在30余个国家或地区被检出。2019年在山东禹城首次发现报道了tobrfv(yan et al., 2019)。tobrfv发现主要侵染番茄（ solanum lycopersicon）（luria et al., 2017）。植株感病后嫩叶和顶芽表现为斑驳、斑点和黄化等花叶症状，叶片变窄、畸形；花和果实大量减少，叶柄、花梗和花萼逐渐坏死；果实变形，出现黄、棕或绿色斑点、斑块或条纹，严重时导致畸形、变褐、坏死(salem et al., 2016; salem et al., 2020)。发病严重的情况下，经济损失高达100%（salem et al., 2016）。鉴于tobrfv潜在的危害及影响，2021年4月，tobrfv被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。
2、对于植物病毒病的防治，最有效的方法是抗病品种的筛选与培育，但其存在育种周期长、抗病品种抗性易丧失等不足。另一种方法是弱毒交叉保护，是利用弱毒突变体侵染，诱导植物自身的免疫系统而防治后期侵染的同样类型强病毒株系，是一种有效的病毒防治策略。弱毒突变体可以是天然存在的，也可以通过分子生物学手段进行人工制备。弱毒疫苗的构建是通过在一个骨架病毒中插入异源病毒片段，来达到防治插入片段对应的病毒的效果，这种突变型病毒就是弱毒疫苗。
3、以黄瓜花叶弱毒病毒为基础病毒载体，能够抗番茄褐色皱纹果病毒的疫苗目前还未见有报道。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明提供了一种突变型质粒载体及制备方法和应用，具体涉及用于防治番茄褐色皱纹果病毒的突变型质粒载体。本发明获得含有黄瓜花叶病毒（cmv）rna2的突变型质粒，将其与含有cmvfny分离物的rna1、rna3混合接种，用于防治番茄褐色皱纹果病毒（tomato brown rugose fruit virus，tobrfv）。基于此，本发明获得的突变型质粒载体与含有cmvfny分离物的rna1、rna3混合即构成抗tobrfv的弱毒疫苗，为田间防治tobrfv引起的植物病毒病提供了疫苗材料和有效防治措施。本发明的技术方案如下：
2、一种用于防治番茄褐色皱纹果病毒的突变型质粒载体，所述突变型质粒载体包括如seq id no.1所示的核苷酸序列；所述突变型质粒载体中突变型rna2的核苷酸序列如seqid no.2所示。
3、进一步，所述突变型质粒载体的制备方法如下：
4、（1）中间载体pcbfr2-2bpt的构建：
5、所述突变型质粒载体的中间载体为pcbfr2-2bpt，中间载体pcbfr2-2bpt含有cmvfny分离物的rna2全长序列，并且在2682位g与2683位g之间插入taatag，以及 smai酶切位点；根据genbank中公布的cmvfnyrna2的序列(登录号：d00355)，设计引物fny2-2683-f和fny2-2682-r；以pcb301-cmvfny-r2为模板，在phanta max super-fidelity dna polymerase(vazyme)作用下进行pcr反向扩增，利用dpni（neb）降解质粒模板后，对pcr扩增片段进行smai酶切后自连，连接产物转化大肠杆菌dh5α，经菌落pcr、质粒酶切鉴定和dna测序，确认得到载体pcbfr2-2bpt；所述引物fny2-2683-f的序列如seq id no.3所示，引物fny2-2682-r的序列如seq id no.4所示。
6、（2）将中间载体pcbfr2-2bpt经 smai单酶切，获得线性中间载体pcbfr2-2bpt，使用试剂盒peasy®-basic seamless cloning and assembly kit（transgen）将其与核苷酸序列为seq id no.1的tobrfv基因片段同源重组，获得突变型质粒载体，命名为pcbfr2-2bpt-tobrfv73-294；同源重组使用到的引物tobrfv-73-f的序列如seq id no.5所示，引物tobrfv-294-r的序列如seq id no.6所示。
7、进一步的，本发明还包括所述突变型质粒载体pcbfr2-2bpt-tobrfv73-294在防治番茄褐色皱纹果病毒的应用；所述应用步骤如下：
8、将突变型质粒pcbfr2-2bpt-tobrfv73-294转化农杆菌，与含有cmvfny分离物的野生型rna1和野生型rna3的质粒农杆菌混合预先接种至番茄。
9、本发明的有益效果：
10、（1）对于获得的黄瓜花叶病毒rna2的2b蛋白提前终止型突变体pcbfr2-2bpt，本发明进一步在新的终止密码子后插入tobrfv保守片段，得到含有tobrfv片段的黄瓜花叶病毒rna2的2b蛋白提前终止型突变体，该质粒与含有cmvfny分离物的野生型rna1和野生型rna3的质粒混合接种，可以预防tobrfv强毒的侵染，可作为抗番茄褐色皱纹果病毒的弱毒疫苗。
11、（2）该组质粒转化农杆菌后，分别与含有cmvfny野生型rna1和野生型rna3质粒的农杆菌混合后预先接种植株，突变体预先接种处理的植株对tobrfv具有预防效果。
12、本发明提供的突变型质粒中插入的tobrfv基因片段，是长度为222 bp的tobrfv基因组保守序列，对tobrfv分离物具有防治的潜力。
1. 一种用于防治番茄褐色皱纹果病毒的突变型质粒载体，其特征在于，所述突变型质粒载体含有如seq id no.1所示的核苷酸序列；所述突变型质粒载体中突变型rna2的核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.如权利要求1所述突变型质粒载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：
3.如权利要求1所述突变型质粒载体pcbfr2-2bpt-tobrfv73-294在构建植物弱毒疫苗中的应用。
4.如权利要求1所述突变型质粒载体pcbfr2-2bpt-tobrfv73-294在防治番茄褐色皱纹果病毒的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用的步骤如下：
