本发明属于海洋环境保护领域，具体的说一种检测链状亚历山大藻（ alexandrium catenella）的特异性引物和探针及应用、试剂盒和检测方法。
背景技术：
1、链状亚历山大藻 alexandrium catenella是一种冷水性甲藻微藻，可以产生麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish toxins），是世界温带至寒带海域主要的麻痹性贝类毒素产毒亚历山大藻。海水中的链状亚历山大藻被虑食性贝类滤食后，其产生的麻痹性贝类毒素可在贝类体内累积，常造成海洋高等生物或人类因食用沾染麻痹性贝类毒素的贝类而中毒，甚至死亡。链状亚历山大藻在我国主要分布于黄海和渤海海域，也常导致这些海域的贝类沾染麻痹性贝类毒素，严重影响贝类食品安全。不同于其它微藻赤潮，链状亚历山大藻赤潮暴发时通常在海水中目标藻密度较低，海水颜色无明显变化，不易被察觉和监测。2016年以来，渤海秦皇岛近海连续多年暴发链状亚历山大藻赤潮，多次造成当时居民因食用染毒贝类而中毒和死亡，当地政府不得不发布停止采集、市售和食用海产贝类的通告。中毒事件对当地居民身体健康、生命安全和社会稳定造成了严重的不利影响，也给政府管理部门对链状亚历山大藻赤潮的监测预警构成巨大的挑战。
2、亚历山大藻属中产毒物种和不产毒物种形态特征相似，而且赤潮发生时藻密度低，基于形态学特征的传统检测方法难以有效区分产毒和不产毒的亚历山大藻，无法有效检测低密度目标藻。前期针对亚历山大藻研发多种分子检测方法，这些方法虽然可以有效区别产毒和不产毒的亚历山大藻，或检测低密度目标藻，但是这些方法或操作繁琐，或需要依赖于复杂仪器，难于在野外开展现场检测，无法实现对链状亚历山大藻赤潮及时检测和有效预警。因此，急需研发一种灵敏度高、检测范围广、操作简便、可在野外现场对链状亚历山大藻进行特异性快速定量检测方法，助力于对我国近海海域链状亚历山大藻赤潮的监测预警和减灾防控。
技术实现思路
1、本发明目的在于提供一种检测快速、灵敏性高、操作简便、可在野外现场特异性检测链状亚历山大藻的定量方法。
2、为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
3、一种检测链状亚历山大藻的特异性引物和探针，特异性的引物和探针为：
4、上游引物: ac-f4 5´-tgtttagcattgctgtgaacaaagagagtc-3´
5、下游引物: ac-r 5´-atatgcaagtcttcagcttgtctcagttgt-3´
6、探针:
7、 ac-p 5´-ccaatcaaccatgtttaggttgcaaagcag(thf)tgcaacacatccagg-3´。
8、所述特异性的引物中上游引物5´端由生物素（biotin）标记；
9、探针5´端用羧基荧光素（fam）标记，第31位碱基（胞嘧啶c）用四氢呋喃（thf）残基取代，3´端用c3 spacer标记。
10、一种所述的特异性引物和探针的应用，其特征在于，所述的特异性引物和探针在快速定性和/或定量检测链状亚历山大藻中应用。
11、一种快速定性和/或定量检测链状亚历山大藻的试剂盒，所述的试剂盒包含所述的特异性引物和探针。
12、一种快速定性和/或定量检测链状亚历山大藻的方法，以待检测样品中藻基因组总dna为模板，利用所述的特异性引物和探针进行重组酶聚合酶扩增（rpa）反应，反应产物再进行横向流动试纸条（lfd）检测，进而定性和/或定量检测链状亚历山大藻。
13、所述根据横向流动试纸条（lfd）上检测线进行定性检测；再根据横向流动试纸条（lfd）检测线颜色深浅对样品中链状亚历山大藻密度进行定量检测。
14、所述采用试纸条型核酸重组酶聚合酶扩增（rpa）反应试剂盒（ks105，苏州先达生物公司，中国）进行重组酶聚合酶扩增（rpa）反应，反应总体积为10 μl，包括重组酶聚合酶扩增（rpa）反应试剂干粉（10 μl量）一份，溶解剂4 μl、超纯水3.6 μl、10 μm上游引物0.42μl、10 μm下游引物0.42 μl、10 μm 探针0.12 μl、dna模板1 μl、激活剂0.4 μl。
15、所述重组酶聚合酶扩增（rpa）反应条件为37℃扩增反应30 min，反应进行4 min时，将反应管取出轻微振荡，快速离心后放回37℃条件中扩增进行扩增反应。
16、所述重组酶聚合酶扩增（rpa）反应产物的横向流动试纸条（lfd）检测，取5 μl重组酶聚合酶扩增（rpa）反应产物加入1.5 ml干净离心管中，使用ph 8.0 tris-hcl溶液（生工生物，上海）稀释50倍，将配套的横向流试纸条（ts101，苏州先达生物公司，中国）插入离心管中，10 min后判读检测结果。
17、所述的重组酶聚合酶扩增（rpa）反应产物的横向流动试纸条（lfd）定性检测，将横向流动试纸条（lfd）插入重组酶聚合酶扩增（rpa）反应产物50倍稀释液10 min后，横向流试纸条上同时出现质控线和检测线为阳性结果，仅出现质控线为阴性结果，均没有出现质控线和检测线，而结果无效。
18、反应10 min后，横向流试纸条上同时出现质控线和检测线时拍摄试纸条，将拍摄的试纸条图片转为灰度图片，进行灰度值测度，将检测线灰度值（t）和质控线灰度值（c）分别减去试纸条背景灰度值（b），利用两者的比值s=（t-b）/（c-b）与重组酶聚合酶扩增（rpa）反应的链状亚历山大藻细胞dna模板之间的关系，对样品中的链状亚历山大藻进行定量检测。
19、本发明所具有的特征：
20、本发明的检测方法以核糖体its间隔区为目标靶区，该靶区在亚历山大藻细胞内拷贝数高，且具有分辨亚历山大藻属内不同物种的能力。本发明的检测方法针对链状亚历山大藻核糖体its间隔区序列设计特异性重组酶聚合酶扩增（rpa）引物和探针，采用横向流动试纸条（lfd）进行检测。
21、本发明具有以下的优点：
22、1. 特异性高，本发明的重组酶聚合酶扩增—横向流动试纸条（rpa-lfd）检测方法可特异性检测链状亚历山大藻；
23、2. 灵敏度高，本发明的重组酶聚合酶扩增—横向流动试纸条（rpa-lfd）检测方法的检测限低于1个细胞，可检测海域中低密度链状亚历山大藻，有助于对链状亚历山大藻赤潮的早期监测预警；
24、3. 检测范围广，本发明的重组酶聚合酶扩增—横向流动试纸条（rpa-lfd）检测方法的定量检测范围为6 cells/l - 6×104cells/l，检测范围广，达到4个数量级，满足野外链状亚历山大藻赤潮（链状亚历山大藻密度介于数个细胞/升至数千个细胞/升之间）检测和监测的需求；
25、4. 操作简便，本发明的重组酶聚合酶扩增—横向流动试纸条（rpa-lfd）检测方法仅需在37℃恒温条件中即可进行反应，不需要依赖pcr仪等专业仪器；
26、5. 检测速度快，本发明的重组酶聚合酶扩增—横向流动试纸条（rpa-lfd）检测方法中重组酶聚合酶扩增反应仅需30 min，横向流动试纸条（rpa-lfd）检测也只需10 min，整个检测过程可在短时间完成。
1.一种检测链状亚历山大藻的特异性引物和探针，其特征在于，特异性的引物和探针为：
2.按权利要求1所述的检测链状亚历山大藻的特异性引物和探针，其特征在于，所述特异性的引物中上游引物5´端由生物素biotin标记；
3.一种权利要求1所述的特异性引物和探针的应用，其特征在于，所述的特异性引物和探针在快速定性和/或定量检测链状亚历山大藻中应用。
4.一种快速定性和/或定量检测链状亚历山大藻的试剂盒，其特征在于，试剂盒包含权利要求1所述的特异性引物和探针。
5.一种快速定性和/或定量检测链状亚历山大藻的方法，其特征在于，以待检测样品中藻基因组总dna为模板，利用权利要求1所述的特异性引物和探针进行重组酶聚合酶扩增rpa反应，反应产物再进行横向流动试纸条lfd检测，进而定性和/或定量检测链状亚历山大藻。
6.按权利要求5所述的快速定性和/或定量检测链状亚历山大藻的方法，其特征在于，根据横向流动试纸条lfd上检测线进行定性检测；再根据横向流动试纸条lfd检测线颜色深浅对样品中链状亚历山大藻密度进行定量检测。
7.按权利要求6所述的快速定性和/或定量检测链状亚历山大藻的方法，其特征在于，待横向流动试纸条lfd上出现检测线将其图片转为灰度图片，进行灰度值测度，将检测线灰度值t和质控线灰度值c分别减去试纸条背景灰度值b，利用两者的比值s=（t-b）/（c-b）与重组酶聚合酶扩增rpa反应的链状亚历山大藻细胞dna模板之间的关系，对样品中的链状亚历山大藻进行定量检测。
