本发明涉及一种用于生产l-半胱氨酸的方法，其中在亚硫酸盐的存在下，使用至少一种选自o-乙酰基-l-丝氨酸巯基酶(oas巯基酶，ec 4.2.99.8)类别的酶转化o-乙酰基-l-丝氨酸(oas)。作为该生物转化的结果，提供l-半胱氨酸。
背景技术：
1、l-半胱氨酸可以例如用于鱼类养殖(nakamura et al.，fisheries science(2021)87：353-363)或化妆品行业(us 4053630)，例如作为-slim(dsm)的成分用于皮肤护理。在肽化学中，l-半胱氨酸被用作水溶性保护基团。此外，l-半胱氨酸可以通过脱羧转化为牛磺酸。
2、l-半胱氨酸((r)-2-氨基-3-磺丙酸，3-磺基-l-丙氨酸，cas 498-40-8)可以化学生产，例如通过用氯在醇溶液中氧化半胱氨酸(tao et al.amino acids(2004)27：149-151)，用溴在hcl中或碘hcl在dmso中，或通过用过甲酸氧化裂解胱氨酸。此外，l-半胱氨酸也可以通过l-半胱氨酸亚磺酸的氧化来生产。用于化学生产l-半胱氨酸的已知方法，不被认为是可持续的，使用环境有害的化学品并且具有低的消费者接受度，尤其是在食品、化妆品和药物领域的应用中。因此，需要更环境友好且更可持续的生产方法，其中一种选择是生物技术方法。
3、l-半胱氨酸是非蛋白原性l-氨基酸，其可以在自然界中被检测为蛋白原性氨基酸l-半胱氨酸的氧化产物，例如在羊毛中。半胱氨酸也是产甲烷古细菌生物合成辅酶m(com，2-巯基乙磺酸，cas 3375-50-6)的中间体。
4、现有技术提供了用于生产非蛋白原氨基酸的方法，例如通过具有失调的半胱氨酸代谢的微生物的直接发酵(ep 1191106 b1)或通过oas巯基酶催化的oas的生物转化(ep1247869 b1)。这些方法是基于oas巯基酶，其催化oas与亲核体的反应，根据通式(1)以形成非蛋白原氨基酸：
5、(1)oas+亲核体->非蛋白氨基酸+乙酸盐
6、在例如大肠杆菌的半胱氨酸代谢中，oas充当l-半胱氨酸的生物合成前体。后者是通过硫醇基取代β位置处的乙酸酯基团形成的。这种反应，称为β-取代，由oas巯基酶(ec4.2.99.8)类的酶催化。因此，oas是oas巯基酶反应的实际底物(也称为反应物)，并且亲核试剂是可变的共底物。
7、在ep 1 247 869 b1中，测试了多种不同亲核体作为与oas的oas巯基酶-催化的(例如，cysm-催化的)反应的亲核体的适合性，包括硒化物、硒醇、叠氮化物、氰化物、唑和异噁唑烷酮。此外，测试了来自通式h-s-r的硫代硫酸盐和硫醇的组的硫化合物，基团r是单价的取代或未取代的烷基、烷氧基、芳基或杂芳基基团。
8、产生的是非蛋白氨基酸，如s-苯基-l-半胱氨酸，它们在自然界中不用作蛋白质生物合成的构建单元。所披露的亲核体均不允许产生l-半胱氨酸。
9、joo et al.(2018)，j.agric.food chem.66：13454–13463描述了一种用于在细菌谷氨酸棒状杆菌中生产牛磺酸的代谢工程化方法。在菌株中异源表达l-半胱氨酸合酶、半胱氨酸双加氧酶和l-半胱氨酸亚磺酸脱羧酶的基因以实现牛磺酸的产生。joo et al.(2018)，j.agric food chem.66：13454–13463的图2描述了牛磺酸的各种代谢途径，这些还包括途径(“l-半胱氨酸磺酸途径”)，该途径起始于o-磷酸-l-丝氨酸并且经由l-半胱氨酸导致牛磺酸并且原则上也将适合于生产l-半胱氨酸。然而，该图还显示不存在已知的从oas至l-半胱氨酸，仅至l-半胱氨酸的生物合成途径。
10、tevatia et al.，algal research(2015)9：21-26，描述了在微藻中牛磺酸的天然生产，其中l-半胱氨酸也被检测为中间体。如图1a)中描述的，tevatia et al.，algalresearch(2015)9：21-26的生物合成途径导致从l-丝氨酸至l-半胱氨酸(图1a中的“半胱氨酸酸酯”)。所描述的生物合成途径中没有经由oas产生l-半胱氨酸。在微藻中检测到的l-半胱氨酸的细胞内含量非常低并且伴随有多种副产物，这些副产物使得加工过程更困难，如甲硫氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸亚磺酸、次黄牛磺酸和牛磺酸，并且因此微藻的生长不适合于生产l-半胱氨酸。
11、在代谢工程方法中，us2019/0062757 a1(knipbio)描述了用于生产牛磺酸的异源生产菌株，所述菌株还旨在适用于生产l-半胱氨酸。us 2019/0062757a1的图4-9和12描述了牛磺酸的各种生物合成途径，其含有l-半胱氨酸作为中间体，因此原则上适于生产l-半胱氨酸。这些生物合成途径中均没有起始于oas。此外，仅报告了低牛磺酸和牛磺酸产率，并且它们非常低，最高为419ng/ml。没有提到用于生产l-半胱氨酸的产率。必须假定l-半胱氨酸不能达到更高的产率。因此，这种代谢工程方法不适于l-半胱氨酸的生物技术生产。
12、因此，现有技术仅公开了化学方法且没有公开适于工业用途的用于产生l-半胱氨酸的经济上可行的生物技术方法。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供用于通过生物转化生产l-半胱氨酸的生物技术方法。
2、该目的通过一种生产l-半胱氨酸的方法实现，其中在亚硫酸盐的存在下，使用至少一种选自o-乙酰基-l-丝氨酸巯基酶(oas巯基酶，ec 4.2.99.8)类别的酶转化o-乙酰基-l-丝氨酸(oas)。该方法提供通过生物转化产生的l-半胱氨酸。
3、根据本发明的方法的优点是它是用于生产l-半胱氨酸的可持续且技术上可行的生物转化方法。可以省去对环境有害的化学品。不消耗化石原材料，并且没有产生有毒的化学废物和/或废气。因此，本发明的生产方法是环境友好的和可持续的。此外，该方法不需要极端的反应条件或特殊的设备并且因此易于技术上实施。该方法的另一个优点是可以通过这种方式生产需求日益增长的天然l-半胱氨酸。
4、已经出人意料地发现，亚硫酸的盐(在下文中称为亚硫酸盐或so32-)在反应(1)中适合作为亲核体并且允许根据等式(2)在迄今未知的反应中合成l-半胱氨酸。
5、(2)oas+so32-->l-半胱氨酸+乙酸盐
6、在本发明的上下文中，生产方法区分如下：
7、1.化学工艺
8、2.生物技术方法：
9、a)通过代谢工程
10、与生物转化相反，代谢工程(也称为“途径设计”)是通过优化或修饰遗传和调节过程来修饰生物的代谢途径的生物技术方法。新的或修饰的酶可以通过用酶的基因补充基因组而被引入生物体中，或内源酶的基因可以以增强的或减弱的水平表达，由此在生物体中建立新的代谢途径或增强或减弱现有的代谢途径。代谢工程化的目的是生物体以增加的产率产生新的代谢物或细胞内源性代谢物。代谢工程方法不使用特异性针对代谢物的起始材料，例如酶底物，例如本发明中的oas；相反，它仅使用营养培养基，也称为生长培养基，该培养基是所讨论的生物的生长所需要的并且由碳源(例如，葡萄糖)、氮源(例如，铵盐或复合氨基酸混合物，如蛋白胨或酵母提取物)和生长所需要的其他盐组成。这样的营养培养基是本领域技术人员从微生物实践中已知的。
11、b)通过生物转化
12、生物转化定义为在酶催化下将一种或多种反应物转化成产物，酶底物与酶一起加入到反应批料中。在反应批料中，根据等式(2)酶促地(在本发明中，通过选自oas巯基酶(ec4.2.99.8)类别的酶，在亚硫酸盐存在下)转化添加的酶底物，如本发明中的oas。反应物可来源于化学或生物技术生产。在根据本发明的方法中使用的oas可以源自例如化学合成或来自通过发酵生产菌株的生物技术生产。用于酶催化的酶来源于通过生长生产菌株(例如通过发酵)的生物技术生产，或使用含有该酶的生物材料(例如，植物、真菌、藻类、动物器官)。根据生物转化的需要，可以直接使用来自生产菌株生长的生物质或生物材料，或从中分离酶。根据本发明的方法中使用的cysm酶来源于通过发酵生产菌株的生物技术生产。
13、天然生产方法定义为不使用遗传修饰的生物体(gmo)或来自使用gmo生产的产物(反应物、酶)的生物技术生产方法。在本发明中，l-半胱氨酸的生产方法是天然生产方法，此时没有使用gmo生产oas作为有机反应物和oas巯基酶，并且没有化学生产oas巯基酶。在等式(2)中作为共底物的亚硫酸盐是一种无机化合物并且基本上是根据等式(4)至(8)的在水中溶解so2的产物，该等式不对应于一种(不可逆的)化学合成，而是对应于该气体so2的可逆水合以及该水合物h2so3的ph依赖性解离。
14、在genttechnikeset(gentg,german genetic engineering act(德国基因工程法案))的第3条第3款第4句的含义内的自克隆，根据由zentrale kommission fürbiologische sicherheit(zkbs，德国生物安全委员会)发布的声明(参考文献：1991年的6790-10-02)，其中仅一种物种的遗传相同或不同形式(包括其病毒和质粒)被用作供体和受体生物体的过程。
15、在本发明的上下文中，反应批料定义为反应物(原料)、酶和任选的其他反应物的混合物，其中反应物转化成产物。
16、在本发明的含义内的反应的产率被定义为在反应条件下转化成产物的所使用的反应物的量。产率可以表示为绝对量(g或mmol)，表示为体积产率(浓度)，表示为每单位体积的产物的绝对量(mm或g/l)，或表示为产物的相对产率，表示为所用反应物的百分比(考虑反应物和产物的分子量)，也称为百分比产率。
17、发酵是用于以工业规模生产(培养)细胞培养物的方法步骤，其中使优选的微生物生产菌株在培养基、温度、ph、供氧以及培养基的混合的限定条件下生长。取决于生产菌株的构型(基因组成)，发酵的目的是在每种情况下以最高可能的产率生产蛋白质/酶或代谢物用于进一步使用。可以通过发酵生产根据本发明的方法的组分，oas和oas巯基酶。发酵的终产物是由生产菌株的细胞的生物质(发酵罐细胞)和发酵培养基(发酵上清液)组成的发酵罐液，该发酵培养基已经从该生物质中去除并且在发酵过程中从生长培养基以及由该发酵罐细胞分泌的代谢物中形成。发酵的目标产物可以存在于发酵罐细胞或发酵培养基中。例如，在发酵培养基中发现oas，而在发酵罐细胞中发现酶oas巯基酶。
18、开放阅读框(orf，与cds或编码序列同义)是指dna或rna的区域，其以起始密码子开始并以终止密码子结束，并且编码蛋白质的氨基酸序列。orf也称为编码区或结构基因。
19、基因是指含有用于产生生物活性rna的所有基本信息的dna部分。基因含有通过转录产生单链rna拷贝的dna部分，以及涉及该拷贝过程调节的表达信号。表达信号包括例如至少一个启动子、转录起始、翻译起始和核糖体结合位点(rbs)。终止子和一个或多个操纵子是另外的可能的表达信号。
20、基因构建体是指其中基因与其他遗传元件(例如，启动子、终止子、选择标记、复制起点)连接的dna分子。本发明上下文中的基因构建体是环状dna分子，称为质粒、载体或表达载体。基因构建体的遗传元件在细胞生长期间引起其染色体外遗传并且产生由该基因编码的蛋白质。
21、根据本发明，来自oas与亚硫酸盐生物转化的l-半胱氨酸可以直接进一步使用，而无需进一步的加工步骤，或通过已知方法富集或纯化。这里的富集程度取决于进一步的用途。此类方法是本领域技术人员从分离氨基酸的方法中已知的。实施例包括过滤、离心、萃取、吸附、离子交换色谱法、沉淀、结晶。
22、在优选实施方式中，该方法的特征在于从反应批料中富集l-半胱氨酸。特别优选的是例如通过离心去除微粒生物质。
23、在另一优选实施方式中，所述方法的特征在于根据本发明的方法中产生的l-半胱氨酸进一步直接使用，即含有l-半胱氨酸的反应批料不经进一步处理、纯化或分离步骤而进一步使用，所述步骤包括过滤、离心、萃取、吸附、离子交换色谱法、沉淀和结晶。
24、oas巯基酶迄今已经从各种各样的植物和微生物中分离。在大肠杆菌中，存在例如两种oas巯基酶，称为cysk和cysm。相关基因同样是已知的并且分别称为cysk和cysm。
25、在本发明的含义内的oas巯基酶的特征在于它们可以根据等式(3)催化从oas合成蛋白原氨基酸l-半胱氨酸，在这种情况下使用的亲核体是硫化物。因此，cysm相关和cysk相关酶都是本发明含义内的oas巯基酶。
26、(3)oas+s2-->l-半胱氨酸+乙酸盐
27、虽然两种酶具有非常相似的反应机制并且参与l-半胱氨酸的生物合成，但cysm，不同于cysk，相对于亲核体(其可以根据等式(1)与oas反应)具有可变的底物谱。
28、例如，已知与cysk不同，cysm能够催化oas与硫代硫酸盐的反应以形成s-磺基半胱氨酸(cas号1637-71-4)。该反应在以硫代硫酸盐作为硫的唯一来源的细菌生长中起重要作用。
29、此外，ep 1 247 869 b1(wacker)公开了cysm用于生产非蛋白氨基酸的用途。
30、优选地，该方法的特征在于该oas巯基酶是细菌酶，特别优选地cysm并且尤其优选地来自大肠杆菌菌株的cysm。
31、亚硫酸形成大量同时存在于可逆平衡中的化学物质，其在根据本发明的生物转化中作为亲核体的各自适用性是不可预见的。因此已知亚硫酸(h2so3)是气态so2的水溶液，并且作为二元酸，取决于该水溶液的ph以不同的平衡存在，所述平衡的种类还在作为亲核体的适合性中变化。以下等式(4)至(8)是已知的：
32、(4)so2(气态)<->so2(溶解的)
33、(5)so2(溶解的)+h2o<->h2so3
34、(6)h2so3<->hso3-+h+
35、(7)hso3-<->so32-+h+
36、(8)2hso3-<->s2o52-+h2o
37、亚硫酸及其盐用作食品工业中的防腐剂，因为它们表现出抗微生物作用。这意味着亚硫酸及其盐可以杀死微生物，所述微生物可归因于微生物活力所必需的酶的失活。因此，本领域技术人员预期当使用亚硫酸或其盐时，cysm酶也将失活，并且l-半胱氨酸不能通过ep 1247869 b1中公开的方法制备。
38、出于上述原因，本领域的普通技术人员出人意料的是当在生物转化中使用亚硫酸盐和oas时，可以产生l-半胱氨酸。
39、原则上，所有可想到的亚硫酸盐都适合于该反应。优选地，该方法的特征在于所使用的亚硫酸的盐是na2so3、k2so3、(nh4)2so3、nahso3(或其酸酐na2s2o5)或khso3。特别优选地，所使用的亚硫酸的盐是na2so3、nahso3(或其酸酐na2s2o5)以及(nh4)2so3，并且尤其优选地na2so3和nahso3(或其酸酐na2s2o5)。
40、可想到的是使用气态二氧化硫，亚硫酸的酸酐，它可以被引入反应批料中，其中它被水合为亚硫酸h2so3并且，取决于ph，与去质子化形式hso3-和so32-处于平衡。
41、该方法需要oas的可用性。可设想的是用于生产oas的化学方法，例如通过l-丝氨酸的乙酰化，由于l-丝氨酸的高价格，这是昂贵的，或另外生产可以直接使用的外消旋体o-乙酰基-d/l-丝氨酸，或者例如通过拆分预先从外消旋体获得oas。在直接乙酰化的情况下，n-乙酰基-l-丝氨酸(nas)可以作为副产物形成，例如通过在l-丝氨酸的羟基或氨基基团上的非选择性乙酰化或在中性至碱性ph值下oas至nas的已知重排(tai et al.(1995)，biochemistry 34：12311-12322)，其降低产量或需要在l-丝氨酸的氨基基团上预先引入保护基团。因此，l-丝氨酸的直接乙酰化对于经济上可行的方法是不实际的。
42、oas的生物技术生产也是已知的，如例如在ep 1 233 067 b1中披露的。这涉及使用展现出失调的半胱氨酸代谢的生物体，并且因此提供高水平的oas。因此，用于生产oas的成本有效的生产系统是可获得的。
1.一种用于生产l-半胱氨酸的方法，其中在亚硫酸盐的存在下，使用至少一种选自o-乙酰基-l-丝氨酸巯基酶(oas巯基酶，ec 4.2.99.8)类别的酶转化o-乙酰基-l-丝氨酸(oas)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述oas巯基酶是细菌酶。
3.根据权利要求1和2中一项或两项所述的方法，其特征在于，所述oas巯基酶是来自大肠杆菌菌株的cysm。
4.根据权利要求1至3中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述oas巯基酶源自发酵生产。
5.根据权利要求1至4中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述oas巯基酶借助于非gmo的微生物发酵生产。
6.根据权利要求1至5中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述oas巯基酶借助于大肠杆菌菌株dh5α/pfl145发酵生产。
7.根据权利要求1至6中一项或多项所述的方法，其特征在于，oas源自发酵生产。
8.根据权利要求1至7中一项或多项所述的方法，其特征在于，oas借助于非gmo的微生物发酵生产。
9.根据权利要求1至8中一项或多项所述的方法，其特征在于，oas借助于大肠杆菌菌株w3110/pacyc-cysex-gapdh-orf306发酵生产。
10.根据权利要求1至9中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述方法是天然生产方法。
11.根据权利要求1至10中一项或多项所述的方法，其特征在于，所使用的亚硫酸的盐是na2so3、k2so3、(nh4)2so3、nahso3(或其酸酐na2s2o5)或khso3。
12.根据权利要求1至11中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述亚硫酸盐的浓度至少是与oas等摩尔浓度。
13.根据权利要求1至12中一项或多项所述的方法，其特征在于，反应在至少5.5且小于7.5的ph下进行。
14.根据权利要求1至13中的一项或多项所述的方法，其特征在于，基于所使用的oas的摩尔量，l-半胱氨酸的摩尔产率是至少60％。
15.根据权利要求1至14中一项或多项所述的方法，其特征在于，从反应批料中富集l-半胱氨酸。
