【】本发明涉及一种含有干扰素基因刺激因子(sting)和含三方基序蛋白29(trim29)作为活性成分的癌免疫治疗剂和癌免疫治疗佐剂。
背景技术
0、
背景技术：
1、癌通常是一种细胞不正常分化并继续分裂的疾病，由于形成人体组织的细胞周期异常而发生，并经历起始、促进和进展三个阶段。众所周知，癌的病因是环境或食物中含有的致癌物质在正常细胞或肿瘤抑制基因的基因中发生突变，这些细胞不断受到致癌物质的刺激，从而异常增殖并形成癌组织。
2、大多数癌的治疗方法包括外科手术、放射治疗和免疫抗癌治疗以及化疗，研究治疗癌的抗癌药物的方法包括直接搜索针对癌细胞的细胞毒性物质的方法、寻找调节生物体免疫能力的物质的方法、寻找抑制癌细胞转移的物质的方法、以及一种寻找抑制血管生成的物质的方法。然而，目前临床上使用的抗癌药物大多是化学合成的物质，会引起对正常细胞造成毒性等问题，而利用免疫反应的治疗方法最近正引起人们关注以解决这些问题。
3、同时，干扰素基因刺激因子(sting)在dna感应抗病毒免疫中起着核心作用。具体来说，当检测到异常的细胞质dna时，cgamp合成酶(cgas)会产生作为先天免疫剂的cgamp(环gmp-amp)，cgamp会激活免疫受体sting。此外，活化的sting诱导i型干扰素和促炎细胞因子的产生，以募集适应性免疫细胞以消除受损的宿主细胞。因此，sting是先天免疫和获得性免疫之间的中心接口。在实践中，最近的研究表明，肿瘤内施用sting激动剂可激活肿瘤微环境(tme)中的局部免疫并募集效应细胞以消除癌。
4、此外，含有三方基序的蛋白29(trim29)e3连接酶是sting的直接调节因子，trim29介导的sting泛素化以k48连锁特异性方式降解宿主免疫细胞和癌细胞中的sting。在正常情况下，trim29促进sting的非免疫原性降解，相反，当用sting激动剂治疗时，trim29的过表达会干扰免疫反应并减少细胞因子的产生。然而，许多研究报告称，直接抑制trim29会导致癌转移。trim29是转移性黑色素瘤中高度下调的基因，trim29的缺失通过破坏角蛋白分布来增加鳞状细胞癌的转移特征。然而，尚未表明sting和trim29之间蛋白-蛋白相互作用(ppi)的特异性扰动可通过增加细胞sting水平来克服sting激动剂的疗效减弱，而没有潜在的转移风险。
5、因此，本发明人努力开展研究，开发一种抑制sting-trim29相互作用并防止sting29降解的癌免疫治疗剂，从而构建了一种高效的生物活性搜索方法，该方法可筛选出抑制sting和trim29相互作用的化合物，并通过构建的体系发现了氧代哌嗪衍生物。此外，本发明人已经证实，氧代哌嗪衍生物可通过增加细胞内sting的量来进一步激活sting激动剂cgamp介导的免疫应答，从而提高cgamp和免疫检查点抑制剂抗pd-1治疗的免疫抗癌功效。因此，本发明人发现，本发明的sting和trim29的相互作用抑制剂可有效地用作癌免疫治疗剂和癌免疫治疗佐剂中的活性成分，以完成本发明。
6、【引用列表】
7、【非专利文献】
8、【非专利文献1】q.chen,l.sun,z.j.chen,regulation and function of thecgas-sting pathway of cytosolic dna sensing.nat.immunol.17,1142-1149(2016)。
9、【非专利文献2】l.sun,j.wu,f.du,x.chen,z.j.chen,cyclic gmp-amp synthaseis a cytosolic dna sensor that activates the type i interferonpathway.science.339,786-791(2013)。
技术实现思路
0、
技术实现要素：
1、【技术问题】
2、本发明的目的在于提供一种干扰素基因刺激因子(stimulator of interferongenes，sting)与含三方基序蛋白29(tripartite motif-containing protein 29，trim29)的相互作用抑制剂，并用于癌免疫治疗。
3、本发明的另一个目的是提供一种筛选干扰素基因刺激抑制剂(stimulator ofinterferon genes，sting)和含三方基序蛋白29(tripartite motif-containing protein29，trim29)的筛选方法和试剂盒。
4、【问题解决方法】
5、为了实现上述目的，本发明提供一种含有干扰素基因刺激因子(stimulator ofinterferon genes，sting)和含三方基序蛋白29(tripartite motif-containing protein29，trim29)作为活性成分的癌免疫治疗组合物。
6、本发明提供一种含有氧代哌嗪衍生物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐作为活性成分的癌免疫治疗组合物。
7、此外，本发明提供一种含有sting和trim29相互作用抑制剂、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐作为活性成分的癌免疫治疗佐剂。
8、此外，本发明提供一种含有癌免疫治疗剂和癌免疫治疗佐剂的抗癌组合剂。
9、此外，本发明提供一种癌免疫治疗剂的筛选方法，包括：
10、(1)步骤包括分别编码与发光蛋白结合的sting蛋白和与发光蛋白结合的trim29蛋白的载体；
11、(2)将步骤(1)的载体转化进细胞的步骤；
12、(3)用测试物质处理步骤(2)转化的细胞的步骤；
13、(4)将步骤(3)所述的测试物质处理的细胞与未处理的对照组进行比较，并选择降低来自所述处理的细胞的发光信号的物质。
14、此外，本发明提供一种用于筛选癌免疫治疗剂的试剂盒，包括与发光蛋白结合的sting蛋白和与发光蛋白结合的trim29蛋白。
15、【发明效果】
16、本发明的干扰素基因刺激因子(sting)与含三方基序蛋白29(trim29)的相互作用抑制剂通过抑制trim29引起的sting降解和增加细胞内sting的量，进一步激活由sting激动剂cgamp介导的免疫应答，并且当与sting激动剂cgamp和免疫检查点抑制剂联合施用时，进一步表现出显著的免疫抗癌功效。因此，sting和trim29的相互作用抑制剂可有效地用作癌免疫治疗剂和癌免疫治疗佐剂。
17、【附图简要说明】
18、图1是本发明用于筛选抑制干扰素基因刺激因子(sting)与含三方基序蛋白29(trim29)相互作用的化合物的筛选系统示意图。
19、图2是示出通过向sting和trim29的n端和c端引入nanobit(lgbit和smbit)而获得的总共八种组合来确认优化筛选系统的示意图：
20、nl：通过将lgbit引入n端而得到的基团；
21、ns：通过将smbit引入n端而得到的基团；
22、cl：通过将lgbit引入c端而得到的基团；和
23、cs：通过将smbit引入c端而获得的基团。
24、图3是示出氧代哌嗪衍生物通过荧光素酶互补测定法通过抑制sting-trim29相互作用来降低发光信号的效果：
25、1：本发明的式1(以下，式1的化合物在本发明附图中表示为“1”，)；
26、2：本发明的式2(以下，式2的化合物在本发明附图中表示为“2”，)；
27、3：本发明的式3(以下，式3的化合物在本发明附图中表示为“3”，)；
28、4：本发明的式4(以下，式4的化合物在本发明附图中表示为“4”，)；
29、5：本发明的式5(以下，式5的化合物在本发明附图中表示为“5”，)；和
30、6：本发明的式6(以下，式6的化合物在本发明附图中表示为“6”，)。
31、图4是示出确认氧代哌嗪衍生物对诱导sting蛋白细胞内量增加的作用的示意图。
32、图5是示出ifn-β和il-6表达增加的效果，ifn-和il-6是sting亚细胞因子，与本发明的氧代哌嗪衍生物和cgamp共同处理。
33、图6是示出式1的化合物对增加il-15和il-15rα表达的影响的时间依赖性/剂量依赖性确认的示意图，il-15和il-15rα是sting亚细胞因子。
34、图7是示出通过蛋白印迹确认式1的化合物对增加sting亚免疫信号通路活化的影响的示意图。
35、图8是示出通过用精氨酸替换泛素蛋白中除赖氨酸残基48以外的所有赖氨酸残基而获得的转基因泛素蛋白，由于式1的化合物导致的lys48聚合多泛素化由于定量sting的剂量依赖性还原的确认。
36、图9是示出当泛素化蛋白被阻止降解时，式1的化合物的sting增加作用是否消失的图，mg132是一种蛋白酶体抑制剂。
37、图10是示出确认式1的化合物的sting表达增加作用是否通过泛素介导的反应以外的不同细胞机制表现出的，以确认该化合物的sting表达增加作用不受蛋白转录抑制剂(环己酰胺，chx)和转录抑制剂(放线菌素d，actd)。
38、图11是示出确认式1的化合物通过cetsa结果选择性地与sting结合而诱导热不稳定的示意图，a431是人细胞系。
39、图12是示出通过itdrf在a431(一种人细胞系)中通过itdrf结果在高浓度下通过式1的化合物对sting的浓度依赖性热不稳定的交叉验证。
40、图13是示出确认式1的化合物通过cetsa选择性地仅与sting结合而诱导热不稳定的示意图，其为小鼠细胞系的raw 264.7。
41、图14是示出通过itdrf在高浓度下通过itdrf结果在小鼠细胞系raw 264.7中交叉验证sting的浓度依赖性热不稳定的交叉验证。
42、图15是示出当用式1的化合物处理原始细胞264.7时，使用流式细胞术确认细胞内sting的荧光标记强度的示意图。
43、图16是示出当用式1的化合物处理原始264.7细胞时，通过蛋白印迹分析确认细胞内sting量的示意图。
44、图17是示出当用式1的化合物处理原始264.7细胞时，通过qrt-pcr方法确认sting细胞内mrna表达量的示意图。
45、图18是示出由于式1的化合物的sting激动剂cgamp而确认bmdc抗原呈递功效增加的效果的示意图。此外，图18是示出确认细胞毒性t细胞增殖增加的化合物的示意图。经证实，该化合物的这些作用在与cgamp联合施用时显示出协同作用。
46、图19是示出通过同时处理式1和cgamp化合物来确认bmdc的交叉抗原呈递能力的示意图。
47、图20是示出通过图19的实验确认激活的ot-1t细胞选择性地杀死仅表达ova的细胞系的示意图。
48、图21是示出在单独处理式1的化合物或与cgamp联合处理的条件下不诱导或促进细胞毒性t细胞死亡的示意图。
49、图22是示出一种动物试验方法，以确认cgamp在体内同源小鼠模型中的免疫抗癌功效。
50、图23是示出在体内同基因小鼠模型中确认cgamp和配方1化合物联合治疗的实验组中肿瘤生长抑制作用的示意图。
51、图24是示出cgamp和配方1化合物在体内同源小鼠模型中联合治疗的实验组体重变化和毒性信号的确认图。
52、图25是示出用于验证免疫细胞浸润到肿瘤组织中的实验程序和浸润免疫细胞的激活程度的示意图。
53、图26是示出用cgamp和式1的化合物单独或组合处理后确认免疫细胞浸润到肿瘤组织中的确认程度和浸润免疫细胞的激活程度的示意图。
54、图27是示出用于确认肿瘤内免疫细胞中sting表达水平的实验程序的示意图。
55、图28是示出根据式1的化合物的治疗确认肿瘤内免疫细胞中sting表达水平的示意图。
56、图29是示出用于确认式1的化合物的抗癌免疫系统构建效果的实验程序的示意图。
57、图30是示出式1的化合物的抗癌免疫系统构建促进作用的示意图。
58、图31是示出用于确认式1的化合物和免疫检查点治疗剂联合治疗效果的实验程序的示意图。
59、图32是示出式1的化合物与免疫检查点治疗剂联合治疗效果的确认效果的示意图。
60、【实施例说明】
61、下面对本发明作详细说明。
62、本发明提供一种含有干扰素基因刺激因子(sting)和含三方基序蛋白29(trim29)的相互作用抑制剂作为活性成分的癌免疫治疗组合物。
63、所述相互作用抑制剂优选为低分子量化合物、肽或抗体，但不限于其，并且可是式7表示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐：
64、【式7】
65、
66、(在式7中，r1是环烷基，具体地，c3～c7环烷基，芳基，具体地，c6～c10芳基，或芳基烷基，具体地，c6～c10芳基-c1～c5烷基，其中烷基可任选地被烷氧基取代；
67、r2是烷基或芳基-烷基，具体地为c6～c10芳基-c1～c5烷基，其中芳基可任选地被卤素取代；和
68、r3是氨基、烷基氨基、二烷基氨基或杂环烷基-烷基-氨基。
69、此外，[式7]优选由[式1]至[式6]表示的化合物，但不限于：
70、【式1】
71、
72、【式2】
73、
74、【式3】
75、
76、【式4】
77、
78、【式5】
79、和
80、【式6】
81、
82、优选地，所述相互作用抑制剂通过trim29介导的lys48聚合的sting多泛素化(k48连锁特异性多泛素化)与sting结合并抑制sting降解，但不限于此。
83、此外，所述相互作用抑制剂优选上调sting并增加sting激动剂的活性，并且所述sting激动剂优选为c-二-gmp(环二胍酸酯)、cgamp、3'3'-cgamp、c-二-gamp、c-二-amp或2'3'-cgamp，但不限于此。
84、此外，相互作用抑制剂优选激活选自下列的一种或多种免疫因子：细胞毒性t细胞、辅助性t细胞、nk细胞和细胞因子，以对选自下列的一种或多种癌具有预防性或治疗效果：假粘液瘤，肝内胆管上皮癌，成肝细胞瘤，肝癌，甲状腺癌，结肠癌，睾丸癌，骨髓增生异常综合征，成胶质细胞瘤，口腔癌，唇癌，蕈样真菌病，急性骨髓样白血病，急性淋巴细胞白血病，基底细胞癌，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞癌，雄性乳腺癌，脑癌，垂体腺瘤，多发性骨髓瘤，胆囊癌，胆道癌，结直肠癌，慢性骨髓样白血病，慢性淋巴细胞白血病，成视网膜细胞瘤，脉络膜黑色素瘤，壶腹癌，膀胱癌，腹膜癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，鼻窦癌，非-小细胞肺癌，舌癌，星形细胞瘤，小细胞肺癌，小儿脑癌，小儿淋巴瘤，小儿白血病，小肠癌，脑膜瘤，食管癌，神经胶质瘤，肾盂癌，肾癌，心脏癌，十二指肠癌，恶性软组织癌，恶性骨癌，恶性淋巴瘤，恶性间皮瘤，恶性黑色素瘤，眼癌，外阴癌，输尿管癌，尿道癌，未知的原发位点的癌，胃淋巴瘤，胃癌，胃类癌，胃肠间质癌，维尔姆斯癌，乳腺癌，三重阴性乳腺癌，肉瘤，阴茎癌，咽癌，妊娠滋养层疾病，子宫颈癌，子宫内膜癌，子宫肉瘤，前列腺癌，转移性骨癌，转移性脑癌，纵隔癌，直肠癌，直肠类癌，阴道癌，脊柱癌，声学许旺细胞瘤，胰腺癌，唾液腺癌，卡波西肉瘤，佩吉特氏疾病，扁桃体癌，鳞状细胞癌，肺腺癌，肺癌，肺鳞状细胞癌，皮肤癌，肛门癌，横纹肌肉瘤，喉癌，胸膜癌，血癌和胸腺癌，但本发明不限于此。
85、因此，优选由[式1]至[式6]表示的氧代哌嗪衍生物抑制sting和trim29的相互作用，增加sting蛋白的量，并抑制由于trim29介导的lys48聚合的sting多泛素化而降解的sting，但本发明并不限于此。
86、在本发明的具体实施方案中，为了筛选一种抑制sting和trim29相互作用的化合物，本发明人开发了一种通过蛋白-蛋白相互作用策略(upregulation of targetproteins by protein-protein interaction strategy，uppris)将lgbit结合到sting的c末端和smbit发光蛋白结合到trim29的n末端或c末端的靶蛋白上调(见图1和图2)。
87、此外，本发明人已经确认了以[式1]至[式6]为代表的氧代哌嗪衍生物，其通过使用上述建立的筛选系统抑制sting-trim29的相互作用(见图3)。
88、此外，本发明人还研究了氧代哌嗪衍生物对诱导细胞内sting蛋白量增加的作用，从而证实了所有氧代哌嗪衍生物显著增加细胞内sting的量(见图4)。
89、此外，本发明人还研究了氧代哌嗪衍生物对提高sting激动剂(cgamp)免疫激活功效的作用，从而证实了所有氧代哌嗪衍生物在与cgamp共处理下增加sting亚细胞因子的表达并增加下游信号转导蛋白的磷酸化(见图6和图7)。
90、此外，本发明人还研究了氧代哌嗪衍生物抑制sting降解的机理，从而证实了氧代哌嗪衍生物阻止sting降解由于trim29介导的sting的lys48聚合多泛素化(k48键特异性多泛素化)增加细胞内量(见图8至10)。
91、因此，本发明人研究了氧代哌嗪衍生物是否与sting结合，从而证实了氧代哌嗪衍生物在sting和trim29之间与sting结合并抑制sting和trim29的相互作用(见图11至13)。
92、此外，为了确认氧代哌嗪衍生物对增加sting激动剂和其他癌免疫疗法的疗效的作用，本发明人首先研究了氧代哌嗪衍生物是否增加了sting的量，从而证实了在用氧代哌嗪衍生物处理的一组中，sting的细胞内量显著增加(见图15)。
93、此外，本发明人还研究了氧代哌嗪衍生物通过sting激动剂提高骨髓来源的树突状细胞(bmdc)抗原呈递功效的作用，从而证实了氧代哌嗪衍生物增加了sting激动剂的bmdc对细胞毒性t细胞(cd8+t细胞)的抗原呈递功效(见图18)。
94、此外，本发明人研究了基于同时处理氧代哌嗪衍生物和cgamp的bmdc的交叉抗原呈递能力，从而证实了式1的化合物在杀死和处理连续表达ova抗原的mc38细胞系(mc38-ova)时，通过以浓度依赖性方式增加cgamp对bmdc的激活以及从bmdc到ot-1t细胞的抗原呈递功效来促进细胞增殖和对照mc38细胞系(见图19)，并且ot-1t细胞仅选择性地杀死表达ova的细胞系(见图20)。
95、此外，本发明人在用cgamp和/或氧代哌嗪衍生物处理cd8+t细胞时进行了t细胞死亡分析，从而证实了与cgamp处理相比，单独用氧代哌嗪衍生物或与cgamp联合处理时，细胞毒性t细胞的死亡不会被诱导或促进(见图21)。
96、此外，本发明人首先研究了肿瘤生长抑制作用，以确认在体内同基因小鼠模型中通过氧代哌嗪衍生物增加cgamp免疫抗癌功效的作用，从而证实了在与cgamp和氧代哌嗪衍生物联合施用的实验组中抑制肿瘤生长，并且未观察到毒性信号(见图23和24)。
97、此外，本发明人还研究了氧代哌嗪衍生物在增加免疫激活和免疫抗癌功效方面的作用，从而证实了在与cgamp和氧代哌嗪衍生物联合施用的条件下，总t细胞和细胞毒性t细胞对肿瘤的浸润增加以及髓源性抑制细胞的总比率(mdsc)是抑制免疫反应的细胞，被减少(见图25和26)。
98、此外，本发明人已经证实，通过氧代哌嗪衍生物在肿瘤内免疫细胞中增加sting是免疫激活和免疫抗癌功效增加的基础，从而证实了sting的量在以肿瘤相关巨噬细胞(tam)和树突状细胞(dc)为代表的抗原呈递细胞中增加(见图27和28)。
99、此外，本发明人已经研究了抗癌免疫系统的构建效果，从而证实了与氧代哌嗪衍生物联合施用时，原发性肿瘤中的肿瘤生长以浓度依赖性方式受到抑制，与单次施用cgamp相比，最终肿瘤体积减少。此外，本发明人最终证实，在不直接注射药物的继发性癌中也有效地发生肿瘤死亡(见图29和图30)。
100、此外，本发明人研究了与免疫检查点治疗剂联合施用的效果，从而证实，在pd-1抗体和氧代哌嗪衍生物联合施用的情况下，与单独施用pd-1抗体的情况相比，肿瘤生长和最终肿瘤重量以浓度依赖性方式增加(见图31和32)。
101、因此，由于本发明的sting和trim29的相互作用抑制剂通过抑制sting-trim29相互作用来抑制由于trim29引起的sting降解，通过增加sting细胞内的量进一步激活sting激动剂cgamp介导的免疫应答，并且当与sting激动剂cgamp和免疫检查点抑制剂联合施用时也表现出显着的免疫抗癌功效，sting和trim29的相互作用抑制剂可有效用作癌免疫治疗剂和癌免疫治疗佐剂。
102、本发明由式7表示的化合物可以药学上可接受的盐的形式使用，并且由药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐是有用的盐。所述酸加成盐由盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢溴酸、氢碘酸、亚硝酸、亚磷酸等无毒有机酸、脂肪族单羧酸酯和二羧酸盐、苯基取代的烷酸酯、羟基烷酸酯、烷烃二酸酯、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等无机酸以及三氟乙酸等有机酸获得，乙酸盐、苯甲酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、葡萄糖酸、甲磺酸、4-甲苯磺酸、酒石酸和富马酸。这些药用无毒盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐氯化物、溴化物、碘化物、氟化物、乙酸盐、丙酸盐、丙酸盐、癸酸酯、辛酸酯、丙烯酸酯、甲酸酯、异丁酸酯、癸酸盐、庚酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸酯、琥珀酸盐、辛二酸酯、癸二酸酯、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸酯、己烷-1,6-二酸酯、苯甲酸盐、氯苯甲酸酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸二硝基酯、羟基苯甲酸酯、甲氧基苯甲酸酯、邻苯二甲酸酯、对苯二甲酸酯、苯磺酸酯、甲苯磺酸酯、氯苯磺酸酯、二甲苯磺酸酯、苯乙酸酯、苯丙酸酯、苯基丁酸酯、柠檬酸盐、乳酸酯、β-羟基丁酸酯、乙醇酸酯、苹果酸盐、酒石酸盐、甲烷磺酸盐、丙烷磺酸盐、萘-1-磺酸酯、萘-2-磺酸酯和扁桃酸酯。
103、本发明的酸加成盐可通过相关技术中的方法制备，例如，可通过将式7的氧代哌嗪衍生物溶解在甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙腈等有机溶剂中，向其中加入有机酸或无机酸，过滤干燥所得沉淀，或者可通过蒸馏溶剂和过量的酸来制备加压，干燥所得物，并将干燥的所得物在有机溶剂中结晶。
104、此外，可使用碱制备药学上可接受的金属盐。所述碱金属或碱土金属盐是通过将化合物溶解在过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中，过滤不溶性复合盐，并蒸发和干燥滤液而得到的。此时，将钠盐、钾盐或钙盐制备为金属盐在药学上是合适的。此外，通过将碱金属或碱土金属盐与合适的负盐(例如硝酸银)反应而获得相应的盐。
105、此外，本发明不仅包括由式7表示的化合物及其药学上可接受的盐，还包括可由其制备的溶剂化物、旋光异构体、水合物等。
106、本发明中的术语“水合物”是指本发明的化合物或其盐，包括化学计量或非化学计量量的水与非共价分子间作用力结合。由本发明的式7所表示的化合物的水合物可包括由非共价分子间作用力结合的化学计量或非化学计量量的水。水合物可含有1个以上当量的水，优选1～5个当量的水。这种水合物可通过从水或含有水的溶剂中结晶本发明的由式7表示的化合物、其异构体或其药学上可接受的盐来制备。
107、此外，本发明中的术语“溶剂化物”是指本发明的化合物或其盐，其包括化学计量或非化学计量量的溶剂与非共价分子间作用力结合。其优选溶剂包括挥发性、无毒和/或适合于人类施用的溶剂。
108、此外，本发明的术语“异构体”是指具有相同化学式或分子式但在结构上或空间上不同的本发明化合物或其盐。这些异构体包括所有结构异构体，如互变异构体，立体异构体，如具有不对称碳中心的r或s异构体和几何异构体(反式或顺式)，以及光学异构体(对映异构体)。所有这些异构体及其混合物也都包括在本发明的保护范围内。
109、在本发明的癌免疫治疗组合物中，由式7表示的化合物或其药学上可接受的盐可在临床施用期间以各种口服和肠胃外剂型施用。配制时，使用稀释剂或赋形剂(如常用的填充剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂)制备制备。用于口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂是通过将一种或多种化合物与至少一种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖明胶等)混合而制备的。此外，除了简单的赋形剂外，还使用硬脂酸镁和滑石粉等润滑剂。口服施用的液体制剂包括混悬液、口服溶液、乳剂和糖浆。除了常用的简单稀释剂水和液体石蜡外，还可包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂。胃肠外施用的制剂包括灭菌水溶液、非水溶剂、悬浮液和乳剂。作为非水溶剂和悬浮液，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射酯(如油酸乙酯)。
110、含有由式7表示的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分的癌免疫治疗组合物可通过肠胃外施用，并且肠胃外施用可通过皮下注射、静脉注射、肌肉注射或胸腔注射的注射方法进行。
111、此时，为了配制用于肠胃外施用的剂型，将由式7表示的化合物或其药学上可接受的盐与水与稳定剂或缓冲液混合以制备溶液或悬浮液，并且该溶液或悬浮液可以安瓿或小瓶单元的剂型施用。该组合物可灭菌和/或可含有助剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲液，以及其他治疗上有用的物质，并且可根据混合、造粒或包衣方法配制，这些方法属于相关领域的方法。
112、用于口服施用的剂型的其它实例包括片剂、丸剂、硬/软胶囊、溶液、混悬液、乳化剂、糖浆、颗粒剂、酏剂、酥剂。这些剂型除活性成分外还含有稀释剂(例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸)、润滑剂(例如，二氧化硅、滑石粉、硬脂酸和镁或钙盐，和/或聚乙二醇)。片剂可含有粘合剂，如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷，在某些情况下可含有崩解剂，如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐、沸腾混合物和/或吸收剂、着色剂、调味剂和甜味剂。
113、此外，本发明提供一种癌免疫治疗佐剂，含有sting和trim29的相互作用抑制剂，以式7表示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
114、此外，本发明提供一种抗癌组合剂，包括癌免疫治疗佐剂和癌免疫治疗剂。
115、癌免疫治疗佐剂优选增加癌免疫治疗剂的疗效，并激活选自下列的一种或多种免疫因子：细胞毒性t细胞、辅助性t细胞、nk细胞和细胞因子。
116、此外，癌免疫治疗佐剂优选与癌免疫治疗剂同时或顺序施用，但本发明并不局限于此。
117、所述癌免疫治疗剂可选自下列的一种或多种：c-二-gmp(环二胍酸酯)，cgamp，3'3'-cgamp，c-二-gamp，c-二-amp和2'3'-cgamp，它们可激活sting信号传导，或抗-pd1，抗-pdl1，抗-ctla4，抗-lag3，抗-vista，抗-btla，抗-tim3，抗-hvem，抗-cd27，抗-cd137，抗-ox40，抗-cd28，抗-pdl2，抗-gitr，抗-icos，抗-sirpα，抗-ilt2，抗-ilt3，抗-ilt4，抗-ilt5，抗-egfr，抗-cd19和抗-tigit，其为相关领域中的免疫检查点抑制剂，但本发明不限于此。
118、所述癌免疫治疗佐剂或组合剂优选对选自下列的一种或多种癌具有抗癌活性：假粘液瘤，肝内胆管上皮癌，成肝细胞瘤，肝癌，甲状腺癌，结肠癌，睾丸癌，骨髓增生异常综合征，成胶质细胞瘤，口腔癌，唇癌，蕈样真菌病，急性骨髓样白血病，急性淋巴细胞白血病，基底细胞癌，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞癌，雄性乳腺癌，脑癌，垂体腺瘤，多发性骨髓瘤，胆囊癌，胆道癌，结直肠癌，慢性骨髓样白血病，慢性淋巴细胞白血病，成视网膜细胞瘤，脉络膜黑色素瘤，壶腹癌，膀胱癌，腹膜癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，鼻窦癌，非-小细胞肺癌，舌癌，星形细胞瘤，小细胞肺癌，小儿脑癌，小儿淋巴瘤，小儿白血病，小肠癌，脑膜瘤，食管癌，神经胶质瘤，肾盂癌，肾癌，心脏癌，十二指肠癌，恶性软组织癌，恶性骨癌，恶性淋巴瘤，恶性间皮瘤，恶性黑色素瘤，眼癌，外阴癌，输尿管癌，尿道癌，未知的原发位点的癌，胃淋巴瘤，胃癌，胃类癌，胃肠间质癌，维尔姆斯癌，乳腺癌，三重阴性乳腺癌，肉瘤，阴茎癌，咽癌，妊娠滋养层疾病，子宫颈癌，子宫内膜癌，子宫肉瘤，前列腺癌，转移性骨癌，转移性脑癌，纵隔癌，直肠癌，直肠类癌，阴道癌，脊柱癌，声学许旺细胞瘤，胰腺癌，唾液腺癌，卡波西肉瘤，佩吉特氏疾病，扁桃体癌，鳞状细胞癌，肺腺癌，肺癌，肺鳞状细胞癌，皮肤癌，肛门癌，横纹肌肉瘤，喉癌，胸膜癌，血癌和胸腺癌，但本发明不限于此。
119、此外，本发明的癌免疫治疗佐剂和复方剂的具体描述与本发明的“用于癌免疫治疗的药物组合物”的描述相同。
120、此外，本发明提供一种癌免疫治疗剂的筛选方法，包括：
121、(1)步骤包括分别编码与发光蛋白结合的sting蛋白和与发光蛋白结合的trim29蛋白的基因的载体；
122、(2)将步骤(1)的载体转化进细胞的步骤；
123、(3)用测试物质处理步骤(2)转化的细胞的步骤；和
124、(4)将步骤(3)所述测试物质处理的细胞与未处理的对照组进行比较，并选择降低来自处理细胞的发光信号的物质的步骤。
125、此外，本发明提供一种用于筛选癌免疫治疗剂的试剂盒，包括与发光蛋白结合的sting蛋白和与发光蛋白结合的trim29蛋白。
126、所述与步骤(1)的发光蛋白结合的sting蛋白是通过将lgbit与sting的c端结合而获得的，而与发光蛋白结合的trim29蛋白是通过将smbit结合到trim29的c端或n端而获得的。lgbit和smbit不直接相互作用，而仅通过连接蛋白之间的相互作用结合以执行发光酶的功能。
127、步骤(1)中的载体是指用于在宿主细胞中表达靶基因的装置。载体包括用于表达靶基因的元件，并且可包括复制起点、启动子、操作基因(操纵子)、转录终止序列(终止子)等，并且还可包括用于确认适当的酶位点(例如，限制性内切酶位点)以引入宿主细胞基因组和/或成功引入宿主细胞的选择标记，和/或核糖体结合位点(rbs)，用于翻译成蛋白、ires(内部核糖体进入位点等。载体还可包括启动子以外的转录控制序列(例如，增强子)。
128、此外，所述载体可是质粒dna、重组载体或相关领域已知的其它载体，具体可是线性dna质粒dna、重组非病毒载体、重组病毒载体或诱导型基因表达载体系统，重组病毒载体可是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、辅助依赖性腺病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒或牛痘病毒载体，但本发明不限于此。
129、此外，转化的细胞可是干细胞、祖细胞或动物细胞，但不限于此。
130、此外，试剂盒的组分可是宿主细胞，其中分别引入包括编码与发光蛋白结合的sting蛋白和与发光蛋白结合的trim29蛋白的基因的载体、用于培养宿主细胞的培养基、用于培养宿主细胞的容器、用于分析荧光水平的软件、配备软件的硬件系统等。
131、同时，本发明的癌免疫治疗剂筛选方法和试剂盒的具体描述与本发明的“用于癌免疫治疗的药物组合物”的描述相同。
132、下面，结合实施例和实验例对本发明作详细描述。
133、但是，以下实施例和实验例具体说明本发明，并且本发明的内容不受实施例和实验例的限制。
134、【实施例1：试剂盒和试剂的制备】
135、dmem(dulbecco改良的eagle培养基)(11995-065)、mem(最小必需培养基)(11095-080)、rpmi 1640(11875-093)、opti-mem(31985-070)、fbs(胎牛血清)(16000044)、抗生素-抗真菌溶液(15240062)和trypletm express溶液(12605-010)购自gibco，invitrogen[carlsbad，ca]。pbs(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液购自welgene[韩国庆山]。制备溶于dmso(二甲基亚砜)中的化合物进行生物学评价。dmso、环己酰亚胺、放线菌素d、mg132、脱氧胆酸钠、igepal ca-630、吐温-20、na3vo4、naf、triton-x-100、过硫酸铵和n,n,n',n'-四甲基乙二胺购自sigma-aldrich[密苏里州圣路易斯]。
136、此外，三(羟甲基)氨基甲烷购自acros organics[马萨诸塞州沃尔瑟姆]，nacl购自samchun chemical[韩国大田]，完全片剂无edta蛋白酶抑制剂混合物(04693132001)购自罗氏[瑞士巴塞尔]。2',3'-环状gmp-amp(cgamp)购自invivogen[中国香港白石角]或apexbio[德克萨斯州休斯顿]，nanobittm ppi mcs入门试剂盒(n2014)和nano-glo活细胞检测试剂盒(n2012)购自promega[威斯康星州麦迪逊市]，ez-cytox wst检测试剂盒购自daeil bio co.ltd.[韩国首尔]。
137、为了测量细胞裂解物中的蛋白质浓度，micro bcatm蛋白质测定试剂盒购自pierce[waltham，ma]，3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)和用于elisa的辣根过氧化物酶(hrp)底物购自invitrogen[calsbad，ca]，30％丙烯酰胺双溶液(37.5:1，ac4004-050-00)和lammeli取样缓冲液(5×sds-page加载缓冲液，sf2002-110-0)购自biosang[seongnam，韩国]。蛋白凝胶脚轮包括聚偏二氟乙烯(pvdf)膜和蛋白印迹设备，购自bio-radlaboratories，inc.[hercules，ca]，amersham ecl prime蛋白印迹detection system(rpn2232)和percoll购自ge healthcare life science[chicago，il]，rneasy mini kitfor rna extraction kit购自qiagen[hilden，germany]。
138、lipofectamine ltx和plus试剂以及lipofectamine rnaimax购自thermofisherscientific[waltham，ma]，所有用于逆转录的qpcr引物、sirna和accupower cyclescriptrt预混液(dt20)购自bioneer，inc.[韩国大田]，用于qpcr的kapa sybr green 2×abiprism试剂购自kapa biosystems。此外，rbc裂解缓冲液购自biolegend[加利福尼亚州圣地亚哥]，foxp3/转录因子染色缓冲液购自ebioscience[加利福尼亚州圣地亚哥]、100mm/150mm细胞培养皿、透明96孔板、透明12孔板、透明6孔板、96孔白色平底tc处理的显微测试测定微板(353296)，透气密封膜(axygen bf-400-s)购自康宁公司(亚利桑那州格伦代尔市)。
139、此外，用于nanobit筛选的6针多印迹复制器(vp408)购自v&；p scientific，inc.[san diego，ca]，nunc maxisorp 96孔elisa板(439454)购自costar，pcmv6-trim29-myc-flag质粒用于蛋白印迹，在trim29过表达后从origene[rockville，md]购买，用pcdna3.1载体(pcdna3.1-flag-sting和pcdna3.1-trim29-myc)制造用于elisa的flag或myc标记质粒，prk5-ha-泛素(wt和k48)质粒购自addgene。
140、【实施例2：抗体的制备】
141、抗β肌动蛋白(#4970)、抗sting(#13647，用于蛋白印迹)、抗磷酸化sting(s365)(#72971)、抗tbk1/nak1(#3504)、抗phsopho-tbk1/nak1(s172)(#5483)、抗irf3(#4302)、抗磷酸化irf3(s399)6)(#29047)、hrp偶联的抗兔igg[#7074]和hrp偶联的抗小鼠igg[#7076]抗体购自cell signaling technology[danvers，ma]，抗flag m2(f1804)抗体购自sigma-aldrich[st.louis，mo]，抗trim29/atdc(b-2)抗体(sc-166707，用于检测人trim29)、抗trim29/atdc(c-2)(sc-376125，用于检测小鼠trim29)和蛋白a-琼脂糖珠(sc-2001)购自santa cruz biotechnology[dallas，tx]。此外，抗泛素(ab134953)抗体购自abcam[英国剑桥]，抗ha标签(51642-2-ap，用于elisa)和抗sting(19851-1-ap，用于facs)抗体购自proteintech[rosemont，il]。
142、此外，cd274(b7-h1，pd-l1)-apc，cd3(17a.2)-pe，cd4(rm45)-fitc，cd8α(53-6.7)-apc-cy7，cd19(6d5)-bv650，cd11b(m1/70)-bv786，ly6c(hk1.4)-pe-cy7，ly6g(1a8)-apc，cd45.2(104)-percp-cy5.5，ifnγ(xmg1.2)-apc，cd279(29f.1a12)-apc，颗粒酶b(qa16a02)-fitc和穿孔素(s16009a)-pe是流式细胞术的抗体，购自biolegend[san diego，ca]、gr1(rb6-8c5)-bv510、cd49b(hma2)-bv605、f4/80(t45-2342)-bv711、foxp3(r16-715)-pe、tnf-α(mp6-xt22)-pe和i-a/i-e(m5/11)-bv605购自bd bioscience[san jose，ca]。
143、【实施例3：细胞系动物模型的制备】
144、a431人皮肤鳞状细胞癌细胞和ct26鼠结肠癌细胞均取自韩国细胞系库。从atcc(美国型培养物)获得原始264.7鼠巨噬细胞和hek293t人胚胎肾细胞。从8周龄雌性c57bl/6小鼠获得小鼠骨髓来源细胞，从8周龄ova特异性cd8+tcr转基因小鼠(ot-i小鼠)获得ova特异性cd8+t细胞(ot-i t细胞)。此外，balb/c小鼠是从杰克逊实验室[bar harbor，me]获得的。此外，在实验中，使用8至12周龄的雌性小鼠，所有小鼠，包括野生型balb/c，均在首尔大学医学院的动物设施中繁殖和管理，所有动物实验均经首尔国立大学实验动物资源研究所动物护理和使用委员会批准进行(批准号：snu-190621-3-13)。
145、【实施例4：细胞培养】
146、将raw264.7和hek293t细胞在包含10％(v/v)fbs和1％(v/v)抗生素-抗真菌溶液的dmem中培养，并将a431细胞在包含10％(v/v)fbs和1％(v/v)抗生素-抗真菌溶液的mem中培养。此外，将ct26细胞在rpmi 1640培养基中培养，包括10％(v/v)fbs和1％(v/v)抗生素-抗真菌溶液。同时，将细胞保存在100mm细胞培养皿中，置于5％ co2培养箱中，设置为37℃和湿润条件。
147、【实施例5：实验设备及程序】
148、使用biotek synergy ht酶标仪[winooski，vt]在96孔板中进行吸光度测量，用于elisa分析和bca分析。使用biotek synergy htx酶标仪[winooski，vt]对用于nanobit筛选的白底96孔板进行发光测量。bio-rad laboratories，inc.的chemidoctm mp成像系统用于蛋白印迹分析的化学发光信号分析。
149、此外，通过使用biorad[hercules，ca]提供的imagelab 6.0程序对化学发光信号进行定量。使用ge healthcare[伊利诺伊州芝加哥]的nanoview进行rna定量。使用appliedbiosystems[foster city，ca]的stepone plus实时荧光定量pcr系统进行定量实时荧光定量pcr。使用graphpad prism 8[la jolla，ca]分析图形。
150、此外，对于流式细胞术实验，使用bd biosciences[san jose，ca]的facscalibur或facsaria ii(ncirf)和tree star[ashland，or]的flowjo软件分析细胞。
151、【实验例1：筛选抑制sting和trim29相互作用的化合物】
152、【1-1：高效生理活性搜索方法的构建】
153、为了观察蛋白-蛋白的相互作用，构建了一种基于双分子发光互补测定的高效生理活性搜索方法。如图1所示，将构成发光蛋白荧光素酶的两种蛋白lgbit和smbit分别引入sting和trim29的末端部分。lgbit和smbit不直接相互作用，而仅通过连接蛋白之间的相互作用结合以执行发光酶的功能。
154、为了通过将lgbit和smbit引入sting和trim29来获得sting和trim29的相互作用发光信号，尝试将lgbit和smbit分别引入sting和trim29的n端和c端的8种组合，如图2所示。因此，与一起引入不与sting相互作用的蛋白(称为halotag)的情况相比，将lgbit引入sting的c末端，将smbit引入trim29的n末端，将lgbit引入sting的c末端，将smbit引入trim29的c末端，证实了更高的发光信号。
155、【1-2：sting和trim29相互作用抑制剂的发现】
156、使用实验例[1-1]中建立的系统，以以下方式进行筛选。
157、具体地，将hek293t细胞系接种在100mm培养皿中并培养一天。此后，将分别含有sting-lgbit和smbit-trim29的质粒组合，或含有sting-lgbit和halotag-smbit作为阴性对照的质粒组合引入细胞并再培养一天。根据制造商的方案，使用thermofisher的lipofectamine ltx进行质粒的引入。培养后，将引入质粒的细胞转移到白底96孔板中，接种并再培养一天。按照制造商的方案用promega公司的nano-glo活细胞试剂处理每个孔后，每5分钟振荡一次，获得发光信号。当信号稳定时，用化合物处理每个孔，然后获得发光信号。通过将该获得的发光信号标准化为稳定时每个孔的发光信号而获得值，观察sting-trim29相互作用是否受到抑制。
158、【1-3：sting-trim29相互作用抑制的确认】
159、通过对实验例[1-2]的筛选，证实了氧代哌嗪衍生物通过抑制sting-trim29相互作用以浓度依赖性方式降低发光信号，如图3所示(图3)。
160、此外，所述氧代哌嗪衍生物由下面的【式1】至【式6】表示。
161、【式1】
162、4-((r)-4-(4-羟基苄基)-2-异丙基-5-(4-甲氧基苄基)-3-氧代-3,4-二氢吡嗪-1(2h)-基)-3-硝基-n-(((r)-四氢呋喃-2-基)甲基)苯甲酰胺
163、
164、【式2】
165、4-((r)-5-环戊基-4-(4-羟基苄基)-2-异丙基-3-氧代-3,4-二氢吡嗪-1(2h)-基)-3-硝基-n-(((r)-四氢呋喃-2-基)甲基)苯甲酰胺
166、
167、【式3】
168、(r)-4-(5-环戊基-4-(4-羟基苄基)-2-异丙基-3-氧代-3,4-二氢吡嗪-1(2h)-基)-n,n-二乙基-3-硝基苯甲酰胺
169、
170、【式4】
171、(r)-4-(5-环戊基-4-(4-羟基苄基)-2-异丙基-3-氧代-3,4-二氢吡嗪-1(2h)-基)-n-异丁基-3-硝基苯甲酰胺
172、
173、【式5】
174、4-((s)-5-环戊基-2-(4-氟苄基)-4-(4-羟基苄基)-3-氧代-3,4-二氢吡嗪-1(2h)-基)-3-硝基-n-(((r)-四氢呋喃-2-基)甲基)苯甲酰胺
175、
176、【式6】
177、4-((r)-5-苄基-4-(4-羟基苄基)-2-异丙基-3-氧代-3,4-二氢吡嗪-1(2h)-基)-3-硝基-n-(((r)-四氢呋喃-2-基)甲基)苯甲酰胺
178、
179、【实验例2：确认通过氧代哌嗪衍生物诱导sting蛋白的细胞内量增加】
180、为了确认[实验例1]中发现的式1至6的氧代哌嗪衍生物是否通过抑制sting-trim29的相互作用来增加细胞内sting的量，通过重复的蛋白印迹实验证实了化合物处理后的细胞内sting量。
181、首先，将a431细胞系接种在透明的12孔板中并培养一天。此后，分别用式1至6的化合物处理细胞，然后再培养24小时。最后，除去细胞的上清液培养基后，稀释剩余的上清液并用pbs(磷酸盐缓冲盐水)除去，制备蛋白印迹样品。制备蛋白印迹样品的所有程序均在4℃下进行。用ripa裂解缓冲液(50mm tris-hcl ph 7.5、150mm nacl、1％(w/v)脱氧胆酸钠、2mm na3vo4、5mm naf、蛋白酶抑制剂混合物和1％(v/v)igepal ca-630)处理细胞15分钟，收集溶液，并在13000g下离心15分钟以获得上清液。根据制造商的方案，使用micro bcatm蛋白测定试剂盒(thermofisher)测量上清液的蛋白浓度。使用ripa裂解缓冲液将每个样品的浓度调整为相同，然后根据制造商的比例加入5×的sds-page上样缓冲液(biosesang)，并在95℃下处理5分钟。处理后的样品通过sds-page进行分析，然后转移到pvdf膜上，并在含有4％bsa的tbst溶液中培养30分钟。将一抗在4℃下培养1天或室温下培养1小时，然后在室温下用tbst溶液洗涤4次。二抗在室温下培养一小时。根据制造商针对每种抗体的方案，将抗体溶液稀释在含有1％bsa的tbst溶液中。最后，经过4次tbst洗涤处理后，采用amersham的ecl(增强化学发光)素溶液制备溶液，使用bio-rad laboratories，inc.的chemidoc mp测量化学发光信号，使用imagelab 6.0程序对获得的结果进行定量，并使用prism 8.0程序绘制结果。
182、结果，通过量化作为上述分析结果获得的条带强度值如图4所示，并证实所有氧代哌嗪衍生物的式1至6都增加了细胞内sting的量。
183、【实验例3：确认氧代哌嗪衍生物的sting激动剂增加免疫激活功效】
184、【3-1：使用qrt-pcr确认cgamp免疫激活功效的增加】
185、为了确认式1至6的氧代哌嗪衍生物是否通过增加sting的量来增加sting激动剂cgamp的免疫激活功效，通过定量实时荧光定量pcr(qrt-pcr)实验确认了sting亚细胞因子干扰素-β(ifn-β)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-15(il-15)和白细胞介素-15受体α(il-15rα)的基因表达水平。
186、具体地，将raw264.7细胞接种在透明的12孔板中并培养一天。此后，分别用式1至6的cgamp和氧代哌嗪衍生物处理细胞，然后培养6小时。最后，除去细胞的上清液培养基后，用pbs(磷酸盐缓冲盐水)稀释剩余的上清液并取出以制备qrt-pcr样品。根据制造商的方案，使用qiagen的rneasy mini kit从细胞中提取mrna。使用ge医疗的nanoview设备测量rna浓度后，定量1μg rna，并根据制造商的方案使用accupower cyclescript rt预混剂dt20(bioneer)产品合成互补dna(cdna)。根据制造商的方案，将获得的cdna与能够检测kapa biosystems，inc.的kapa sybr green 2×abiprism溶液中gapdh(对照组)、ifn-β和il-6基因的引物dna混合。使用stepone plus实时荧光定量pcr系统(appliedbiosciences)分析混合样品，并使用prism 8.0程序绘制结果。
187、同时，分析中使用的引物的dna碱基序列如下表1所示。
188、【表1】
189、 qpcr引物 序列(5'-3') mgapdh_f(seq id no：1) tgggctacactgagcaccag mgapdh_r(seq id no：2) gggtgtcgctgttgaagtca mifnβ_f(seq id no：3) aagagttacactgcctttgccatc mifnβ_r(seq id no：4) cactgtctgctggtggagttcatc mil6_f(seq id no：5) tccagttgccttcttgggac mil6_r(seq id no：6) gtactccagaagaccagagg mil15_f(seq id no：7) gagactttcatcccagttcg mil15_r(seq id no：8) ttccttgcagccagattctg mil15rα_f(seq id no：9) cccacagttccaaaatgacga mil15rα_r(seq id no：10) gctgccttgatttgatgtaccag
190、结果，如图5所示，证实式1至6的所有氧代哌嗪衍生物在与cgamp的共同处理下都增加了sting亚细胞因子ifn-β和il-6的表达。
191、此外，如图6所示，证实式1的化合物还增加了il-15和il-15rα的表达，这是已知在sting下游表达的其他细胞因子，除了ifn-β和il-6之外，以时间依赖性和浓度依赖性的方式。
192、【3-2：使用蛋白印迹法确认cgamp免疫激活功效的增加】
193、经证实，式1的氧代哌嗪衍生物通过蛋白印迹以与上述[实施例2]相同的方式增加了cgamp的sting亚免疫信号通路激活的作用。
194、结果，如图7所示，证实，当sting被cgamp激活时，下游信号转导蛋白tbk1和irf3的磷酸化增加，从而增加免疫细胞因子的表达，并且证实当与式1的氧代哌嗪衍生物联合施用时，磷酸化程度进一步增加。
195、【实验例4：trim29介导的sting的lys48聚合多泛素化降解抑制的鉴定】
196、证实了式1至6的氧代哌嗪衍生物是否通过trim29介导的lys48聚合多泛素化(k48连锁特异性多泛素化)阻止sting的降解来增加细胞内量。为此，选择式1的化合物作为代表化合物，如图8所示，基于elisa(酶联免疫吸附测定)方法，使用转化的泛素蛋白，将泛素蛋白的赖氨酸残基48以外的所有赖氨酸残基均替换为精氨酸，进行定量sting lys48聚合多泛素化检测。
197、具体地，将hek293t细胞接种在透明的6孔板中并培养一天。此后，引入pcdna3.1-flag-sting(表达与flag标记相连的sting的质粒)、pcdna3.1-trim29-myc(表达与myc标记相连的trim29的质粒)和prk5-ha-泛素-k48(ha标记与泛素相连的质粒表达蛋白，其中赖氨酸残基48以外的所有赖氨酸残基均被精氨酸取代)并培养一天。此时，使用puc19空载体对每种实验条件引入的dna总量进行标准化。根据制造商的方案，使用thermofisher的lipofectamine ltx进行质粒的引入。培养1天后，除去上清液培养基，对含有mg132和配方1化合物的培养基进行处理，再培养3小时。此时，仅以使用未用mg132处理的样品的分析值(一种防止去除泛素化蛋白的蛋白酶体抑制剂)作为对照组的方式定量检测化合物的作用，并从用mg132处理的样品的分析值中减去分析值。最后，除去细胞的上清液培养基后，用pbs(磷酸盐缓冲盐水)稀释除去剩余的上清液，制备elisa处理样品。用elisa裂解缓冲液(25mmtris-hcl ph 7.5、150mm nacl、10mm edta、10mm n-乙基马来酰亚胺、1mm na3vo4、1mmnaf、蛋白酶抑制剂混合物和1％(v/v)triton-x-100)处理细胞15分钟，收集溶液并以13000g离心15分钟，得到上清液。使用bradford测定试剂测量上清液的蛋白浓度。使用elisa裂解缓冲液将样品浓度均设置为400μg/ml。为了确认定量浓度，以制造商与部分样品的比例加入5×sds-page上样缓冲液(biosesang)，然后将所得物在95℃下处理5分钟，并使用上述蛋白印迹法进行分析。
198、对于elisa分析，将flag抗体(sigma)在pbs中以1:3000(体积比)稀释，并在nunca/s的maxisorp elisa板上以每孔100μl处理一天，温度为4℃。此后，除去上清液，然后用elisa洗涤液(含有0.05％吐温-20的pbs溶液)用每孔200μl洗涤细胞3次。然后，每孔300μl含有5％ bsa的pbs溶液在室温下处理2小时。用elisa洗涤液洗涤所得物5次，然后在室温下用每孔100μl先前制备的样品处理3小时。将所得物用elisa洗涤液洗涤10次，然后在室温下用每孔100μl的ha抗体(proteintech)在含有1％ bsa的pbs中以1:2000(体积比)稀释处理1小时。将所得物用elisa洗涤液洗涤5次，然后在室温下用每孔100μl的hrp聚合兔igg抗体(cst)在含有1％bsa的pbs中稀释1:2000(体积比)处理1小时。将所得物用elisa洗涤液洗涤5次，然后在室温下用每孔100μl3,3',5,5”-四甲基联苯胺(tmb)溶液(hrp酶的底物)处理10分钟，以进行显色。每孔分液50μl 2nh2so4完成显色反应，使用biotek instruments的synergy ht酶标仪在450nm处测量吸光度，并使用prism 8.0程序绘制结果。
199、因此，如图8所示，通过捕获flag标记的sting然后检测ha标记的ha标记物，其选择性地仅标记赖氨酸48聚合的多泛素化抗体，能够检测sting的lys48聚合多泛素化程度。由于用式1的代表性化合物处理，证实trim29介导的赖氨酸48聚合的sting多泛素化受到抑制。此外，通过蛋白印迹法证实，各对照组和式1的化合物样品的浓度均能很好地定量。
200、此外，为了交叉验证elisa实验的结果，确认了当用mg132处理防止泛素化蛋白降解时，式1的化合物的sting增加作用是否消失。
201、结果，如图9所示，使用蛋白印迹法，证实当mg132用式1的化合物处理时，sting没有增加。
202、此外，为了排除式1的化合物通过泛素介导的反应以外的细胞机制发生sting表达增加的可能性，将转录抑制剂放线菌素d(actd)和核糖体翻译抑制剂环己酰亚胺(chx)与式1的化合物共处理，并使用蛋白印迹法确认是否仍保持sting增加效果。
203、结果，如图10所示，证实即使在细胞转录和翻译机制受到抑制的条件下，式1的化合物仍然增加了细胞内sting的量。
204、【实验例5：确认氧代哌嗪衍生物与sting的结合】
205、基于式1的化合物，通过细胞热位移测定(cetsa)和等温剂量反应指纹图谱(itdrf)验证了本发明的氧代哌嗪衍生物是否与sting和trim29之间的sting结合，以抑制其相互作用，这是验证小分子化合物与靶蛋白之间相互作用的主要技术(d.m.molina etal.,science 2013,341,84-87)。
206、为了使用cetsa技术验证式1的化合物的靶标，将人a431细胞系和小鼠raw264.7细胞系接种在100mm或150mm培养皿上并培养一天。此后，将细胞收集在50ml试管中，并用包括1.5625μm、3.125μm、6.25μm、12.5μm、25μm、50μm和100μm的式1的化合物的培养基处理2小时。然后，将细胞等量分配，分别在图11(a431)或图13(raw264.7)所示的温度下处理3分钟，并在25℃下稳定3分钟。将上述温度处理的细胞以1000g离心3分钟，除去上清液，用pbs洗涤细胞，进一步离心除去所有上清液。用pbs-n溶液(pbs中含有0.4％igepal ca-630)处理洗涤后的细胞并均衡，然后使用液氮重复快速冻融过程共3次，裂解细胞。之后，在4℃下以20000g离心20分钟，将上清液转移到新容器中，并根据制造商的方案使用micro bca tm蛋白测定试剂盒(thermofisher)测量每个浓度。使用ripa裂解缓冲液均匀调节每个样品的浓度，根据制造商的比例加入5×sds-page上样缓冲液(biosesang)，并将所得物在95℃下处理5分钟，并使用上述蛋白印迹法进行分析。
207、结果，如图11所示，通过cetsa结果证实，在人细胞系a431中，式1的化合物仅通过选择性结合sting诱导热不稳定。此外，如图12所示，通过itdrf结果交叉验证，式1的化合物以浓度依赖性方式降低了sting在高浓度下的热稳定性，而不影响trim29。
208、此外，如图13所示，通过cetsa结果证实，在小鼠细胞系raw264.7中，式1的化合物仅通过选择性结合sting诱导热不稳定。此外，如图14所示，通过itdrf结果交叉验证，式1的化合物在高浓度下以浓度依赖性方式降低了sting的热稳定性，而不影响trim29。
209、【实验例6：确认氧代哌嗪衍生物对增加细胞内sting量的影响】
210、验证了氧代哌嗪衍生物是否增加了sting激动剂和其他癌免疫治疗的疗效，包括免疫检查点抑制剂。首先，通过流式细胞术和蛋白印迹法验证了氧哌嗪衍生物是否增加了sting的量。
211、为了通过流式细胞术测定sting的细胞内量，将raw264.7细胞接种在透明的6孔板中并培养一天。此后，用溶液处理细胞，其中式1的化合物在不含fbs的培养基中稀释，并培养24小时。最后，除去细胞的上清液培养基，然后用pbs(磷酸盐缓冲盐水)稀释并除去剩余的上清液，并用含有2mm edta的pbs溶液处理细胞5分钟，并用培养基进一步处理并收集。离心收集的细胞后，除去上清液，将细胞重新分布在facs溶液(hank平衡盐溶液(hbss)中，包括2％马血清和0.05％ nan3)，并测量细胞数。收集每个样品1×106个细胞并离心，除去上清液，用pbs洗涤细胞一次。用4％多聚甲醛(pfa)溶液在室温下处理10分钟固定细胞，用triton溶液(含有0.1％bsa和0.5％triton-x-100的pbs溶液)处理，离心，然后除去上清液。sting一抗(proteintech)在室温下处理2小时。然后，加入triton溶液，进行离心，除去上清液，并将所得物用fitc聚合的二抗(proteintech，fitc偶联的亲和力山羊抗兔igg)或同型对照组(zymed)在室温下处理1小时。最后，加入triton溶液，进行离心，除去上清液，将细胞重新分配到200μl的triton溶液中，并使用bd bioscience的facscalibur仪器进行分析，并使用tree star，inc.的flowjo程序定量分析结果。
212、结果，如图15所示，当细胞用式1的化合物处理时，细胞内sting的荧光标记强度以浓度依赖性方式增加，而同种型对照组没有任何变化。此外，如图16所示，通过蛋白印迹交叉验证，raw264.7细胞中sting的细胞内量由式1的化合物以浓度依赖性方式增加。此外，如图17所示，还通过qrt-pcr方法验证了raw264.7细胞中sting的增加与rna转录无关。
213、【实验例7：通过氧代哌嗪衍生物的sting激动剂确认提高bmdc抗原呈递功效的效果】
214、经证实，式1的化合物增加了sting激动剂的骨髓来源的树突状细胞(bmdc)对细胞毒性t细胞(cd8+t细胞)的抗原呈递功效。
215、具体地，从8周龄雌性c57bl/6小鼠的股骨和胫骨获得小鼠骨髓来源的细胞。2×106个细胞在2ml mlr培养基(补充有10％ fbs、1％1m hepes、1％谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌剂的rpmi 1640培养基)中培养，并补充有10ng/ml mgm-csf和5ng/ml il-4，分化成树突状细胞(bmdc)。在细胞培养开始后的第三天，加入2ml mlr培养基。此外，在第6天，用50μg/ml ova蛋白和/或100ng/ml脂多糖(lps)处理2×106个树突状细胞，以及不同浓度的cgamp和/或式1所代表的化合物。此后，将细胞在37℃下在5％ co2培养箱中培养24小时，然后对树突状细胞活化标志物(cd80、cd86、mhc ii)进行流式细胞术。随后，将5×104个树突状细胞与2×105个cfse标记的ot-1t细胞(ova特异性cd8+t细胞)一起温育，以观察ot-1t细胞增殖。
216、结果，如图18所示，证实当直接处理ova抗原时，式1的化合物通过增加cgamp对bmdc的激活和从bmdc到ot-1t细胞的抗原呈递功效，以浓度依赖性方式促进细胞增殖。
217、【实验例8：根据同时处理氧代哌嗪衍生物和cgamp对bmdc的交叉抗原呈递能力的确认】
218、以与上述[实验例7]相同的方式，获得并分化小鼠骨髓来源的细胞。第六天，将2×106个树突状细胞(bmdc)与2×106个mc38或mc38-ova肿瘤细胞冻融共培养3次，并用不同浓度的cgamp和/或配方1化合物处理。将细胞在37℃下在5％ co2培养箱中培养24小时，然后对树突状细胞活化标志物(cd80、cd86、mhc ii)进行流式细胞术。然后，将5×104个细胞与2×105个cfse标记的ot-1t细胞(ova特异性cd8+t细胞)一起温育，以观察ot-1t细胞增殖。
219、因此，如图19所示，当连续表达ova抗原的mc38细胞系(mc38-ova)和对照组的mc38细胞系被杀灭然后处理时，通过证明式1的化合物通过以浓度依赖性方式增加cgamp对bmdc的激活和从bmdc到ot-1t细胞的抗原呈递功效来促进细胞增殖，并且这种效果确实在mc38对照组的条件下根本不发生。
220、【实验例9：确认ot-i细胞的抗原特异性细胞毒性】
221、以与上述[实验例7]相同的方式，获得并分化小鼠骨髓来源的细胞。第6天，在50μg/ml的ova蛋白存在下，用不同浓度的cgamp和/或配方1化合物处理2×106个树突状细胞。在37℃的5％ co2培养箱中温育24小时后，将5×104个细胞与2×105个cfse标记的ot-1t细胞一起温育1天以激活ot-i t细胞。将效应细胞，即活化的ot-i t细胞，与2×105个靶细胞共培养，即用100gy(1×105个mc38肿瘤细胞和1×105个表达rfp的mc38-ova肿瘤细胞)照射的mc38和mc38-ova肿瘤细胞，以各种“效应:靶标”比例(1:1或3:1)。然后，在37℃下在5％co2培养箱中培养24小时后，使用facscalibur和flowjo软件确认ot-i t细胞的ova特异性细胞毒性。
222、结果，如图20所示，通过图19的实验证实，ot-1激活的t细胞仅选择性地杀死表达ova的细胞系。
223、【实验例10：用cgamp和/或氧代哌嗪衍生物处理cd8+t细胞时t细胞死亡的分析】
224、从c57bl/6小鼠的淋巴结中获取cd8+t细胞，并使用macs进行分离。在5ng/ml il-2存在下，在预涂有1μg/ml抗cd3和0.5μg/ml抗cd28的平板上激活cd8+t细胞。在37℃的5％co2培养箱中温育24小时后，用不同浓度的cgamp和/或式1的化合物处理活化的cd8+t细胞，并再温育24小时。收获细胞并用膜联蛋白v/7-aad染色以观察细胞死亡。显示的数据至少涉及三个独立实验。
225、结果，如图21所示，与用cgamp治疗的情况相比，证实在单独处理式1的化合物或与cgamp联合处理的所有条件下，式1的化合物不会诱导或促进细胞毒性t细胞的死亡。
226、【实施例11：通过配方1化合物在体内同源小鼠模型中确认cgamp增加免疫抗癌功效的效果】
227、【11-1：肿瘤生长抑制作用的确认】
228、将2×105个ct26细胞系在50μl培养基中制备并皮下注射。此后，如图22所示，当注射的肿瘤大小达到100mm3时，将cgamp和式1的化合物直接注射到肿瘤中。cgamp溶液的最终成分为peg400:蒸馏水＝40:60，每次进样20μl。配方1化合物的溶液以dmso:peg400:蒸馏水＝2:40:58的组成制备，每次进样20μl。cgamp溶液每两天注射一次，共四次，式1的化合物的溶液每四天注射一次，共两次，从cgamp的第二次施用开始。每两天用卡尺测量肿瘤大小，其体积计算为(长×宽×高/2)。每两天测量一次小鼠的体重。
229、结果，如图23所示，在cgamp(cg)和式1的化合物联合治疗的实验组中，与对照组相比，证实了肿瘤生长被抑制，并且在最后一天提取的肿瘤的重量减少，并且还证实了当与式1的化合物联用给药时，与用cgamp单次治疗的试验组相比，肿瘤生长以浓度依赖性方式被抑制。
230、此外，如图24所示，证实无论cgamp和式1的化合物单独或组合处理的情况如何，均未观察到体重或毒性信号的显着变化。
231、【11-2：增强免疫活化和免疫抗癌功效的确认】
232、为了验证免疫细胞浸润到肿瘤组织中以及浸润免疫细胞的激活程度，将cgamp(cg)和配方1的化合物单独或联合处理，如图25所示，在最后一次治疗后两天提取肿瘤，并进行流式细胞术。在用二氧化碳对小鼠实施安乐死后提取肿瘤。用剃须刀片将肿瘤组织分成小块，用dmem溶液处理，包括2％马血清，0.5mg/ml胶原酶d和40μg/ml dnase i，在37℃下1小时，并通过40μm过滤器渗透，从而分离成单个细胞。通过percoll浓度梯度离心将肿瘤浸润白细胞(tils)从分离的细胞中分离出来，并用红细胞裂解液处理去除红细胞。将获得的细胞重新分布在上述facs溶液中，用抗小鼠cd16/cd32抗体(克隆2.4g2)在4℃下处理10分钟，中和单个免疫细胞的fcγrii/iii受体。在4℃下进行一抗处理，持续30分钟。将处理后的细胞在离心后重新分布到pbs溶液中，然后进一步离心以除去上清液。用4％多聚甲醛(pfa)溶液在室温下固定细胞10分钟，用triton溶液(含有0.1％bsa和0.5％triton-x-100的pbs溶液)处理，离心，然后除去上清液。细胞因子(ifnγ(xmg1.2)-apc、穿孔素(s16009a)-pe、颗粒酶b(qa16a02)-fitc、biolegend)一抗在室温下处理2小时。最后，加入triton溶液，进行离心，除去上清液，将细胞重新分配到200μl的triton溶液中，并使用bdbioscience的facscalibur设备进行分析，并使用tree star，inc.的flowjo程序定量分析结果。
233、结果，如图26所示，通过确认在造血干细胞来源的细胞，即代表总til的cd45阳性(cd45+)细胞的比例方面，在处理cgamp和式1的化合物组合的条件下，验证了整个免疫反应的环境被激活，肿瘤内总t细胞和细胞毒性t细胞浸润增加，髓源性抑制细胞(mdsc)总比降低，mdsc是抑制免疫反应的细胞。此外，通过细胞因子(tnf-α)和活化因子(颗粒酶b，穿孔素)比例的增加，证实浸润的细胞毒性t细胞(cd8+t细胞)的活性增加。
234、【11-3：确认肿瘤内免疫细胞中sting表达水平】
235、为了研究通过配方1化合物在肿瘤内免疫细胞中sting增加是免疫激活和免疫抗癌功效增加的基础，如图27所示，单独用配方1化合物治疗肿瘤，在最终治疗后一天提取肿瘤，通过流式细胞术确认其内部sting的量。如上所述，在用二氧化碳安乐死后，提取肿瘤，分离til，并以与[实施例6]相同的方式进行细胞内sting染色。
236、结果，如图28所示，证实在以肿瘤相关巨噬细胞(tam)和树突状细胞(dc)为代表的抗原呈递细胞中，sting的量增加。此外，证实在所有肿瘤相关巨噬细胞中，与m2巨噬细胞相比，直接激活免疫反应的m1巨噬细胞中更明显地表现出增加sting的作用。
237、【11-4：抗癌免疫系统构建效果的确认】
238、验证了在cgamp和式1的化合物联合处理下，除了在图18至21中证实的提高抗原呈递功效的结果外，抗癌免疫系统也构建在整个生物体中，因此活化的细胞毒性t细胞能够清除药物未注射到的其他位置的癌细胞。为此，如图29所示，首先移植原发肿瘤，然后在4天后移植继发肿瘤，并且仅在每个肿瘤的大小达到100mm3和20mm3时才对原发肿瘤进行施用。
239、结果，如图30所示，与图23中的结果相似，证实与单次施用cgamp(cg)相比，与单次施用cgamp(cg)相比，在治疗下，原发肿瘤的肿瘤生长受到抑制，最终肿瘤体积减少。此外，最终证实肿瘤死亡也有效地发生在未直接注射药物的继发性癌中。因此，从结果中证实，配方1的化合物有效地促进了整个生物体中抗癌免疫系统的构建。
240、【11-5：式1的化合物与免疫检查点治疗剂联合治疗效果的确认】
241、证实了在与现有免疫检查点治疗剂联合治疗的情况下，从构建式1的化合物的全身抗癌免疫系统的功效中是否可提高疗效。为此，如图31所示，每三天静脉注射一次pd-1抗体，一种免疫检查点治疗剂，每四天将配方1的化合物直接注射到癌体内一次，然后测量肿瘤的生长和重量。
242、结果，如图32所示，在pd-1抗体和配方1化合物联合处理的情况下，证实与用pd-1抗体单次处理相比，肿瘤生长和最终肿瘤重量以浓度依赖性方式降低。
1.癌免疫治疗组合物，其含干扰素基因刺激因子(sting)和含三方基序蛋白29(trim29)的相互作用抑制剂作为活性成分。
2.根据权利要求1所述的癌免疫治疗组合物，其中所述相互作用抑制剂与sting结合。
3.根据权利要求1所述的癌免疫治疗组合物，其中所述相互作用抑制剂通过trim29介导的sting的lys48聚合多泛素化(k48连锁特异性多泛素化)来抑制sting降解。
4.根据权利要求1所述的癌免疫治疗组合物，其中所述相互作用抑制剂上调sting。
5.根据权利要求1所述的癌免疫治疗组合物，其中所述相互作用抑制剂增加sting激动剂的活性。
6.根据权利要求1所述的癌免疫治疗组合物，其中所述相互作用抑制剂激活选自下列的一种或多种免疫因子：细胞毒性t细胞、辅助性t细胞、nk细胞和细胞因子。
7.根据权利要求1所述的癌免疫治疗组合物，其中所述癌免疫治疗剂预防或治疗选自下列的一种或多种癌：假粘液瘤，肝内胆管上皮癌，成肝细胞瘤，肝癌，甲状腺癌，结肠癌，睾丸癌，骨髓增生异常综合征，成胶质细胞瘤，口腔癌，唇癌，蕈样真菌病，急性骨髓样白血病，急性淋巴细胞白血病，基底细胞癌，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞癌，雄性乳腺癌，脑癌，垂体腺瘤，多发性骨髓瘤，胆囊癌，胆道癌，结直肠癌，慢性骨髓样白血病，慢性淋巴细胞白血病，成视网膜细胞瘤，脉络膜黑色素瘤，壶腹癌，膀胱癌，腹膜癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，鼻窦癌，非-小细胞肺癌，舌癌，星形细胞瘤，小细胞肺癌，小儿脑癌，小儿淋巴瘤，小儿白血病，小肠癌，脑膜瘤，食管癌，神经胶质瘤，肾盂癌，肾癌，心脏癌，十二指肠癌，恶性软组织癌，恶性骨癌，恶性淋巴瘤，恶性间皮瘤，恶性黑色素瘤，眼癌，外阴癌，输尿管癌，尿道癌，未知的原发位点的癌，胃淋巴瘤，胃癌，胃类癌，胃肠间质癌，维尔姆斯癌，乳腺癌，三重阴性乳腺癌，肉瘤，阴茎癌，咽癌，妊娠滋养层疾病，子宫颈癌，子宫内膜癌，子宫肉瘤，前列腺癌，转移性骨癌，转移性脑癌，纵隔癌，直肠癌，直肠类癌，阴道癌，脊柱癌，声学许旺细胞瘤，胰腺癌，唾液腺癌，卡波西肉瘤，佩吉特氏疾病，扁桃体癌，鳞状细胞癌，肺腺癌，肺癌，肺鳞状细胞癌，皮肤癌，肛门癌，横纹肌肉瘤，喉癌，胸膜癌，血癌和胸腺癌。
8.癌免疫治疗组合物，其包含由式7表示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐作为活性成分：
9.根据权利要求8所述的癌免疫治疗组合物，其中式7是式1至6所表示的化合物中的任一种：
10.根据权利要求8所述的癌免疫治疗组合物，其中所述化合物抑制sting和trim29的相互作用。
11.根据权利要求8所述的癌免疫治疗组合物，其中所述化合物通过trim29介导的sting的lys48聚合多泛素化来抑制sting降解，以上调sting或增加sting蛋白的量。
12.根据权利要求8所述的癌免疫治疗组合物，其中所述化合物激活选自下列的一种或多种免疫因子：细胞毒性t细胞、辅助性t细胞、nk细胞和细胞因子。
13.癌免疫治疗佐剂，其包含根据权利要求1所述的相互作用抑制剂、根据权利要求8所述的由式7表示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
14.根据权利要求13所述的癌免疫治疗佐剂，其中所述癌免疫治疗佐剂提高癌免疫治疗剂的疗效。
15.根据权利要求13所述的癌免疫治疗佐剂，其中所述癌免疫治疗佐剂与癌免疫治疗剂同时或顺序施用。
16.根据权利要求15所述的癌免疫治疗佐剂，其中所述癌免疫治疗剂是选自下列的一种或多种：二-gmp(环二胍酸酯)，cgamp，3'3'-cgamp，c-二-gamp，c-二-amp，2'3'-cgamp，抗-pd1，抗-pdl1，抗-ctla4，抗-lag3，抗-vista，抗-btla，抗-tim3，抗-hvem，抗-cd27，抗-cd137，抗-ox40，抗-cd28，抗-pdl2，抗-gitr，抗-icos，抗-sirpα，抗-ilt2，抗-ilt3，抗-ilt4，抗-ilt5，抗-egfr，抗-cd19和抗-tigit。
17.抗癌联合治疗剂，其包含癌免疫治疗剂和根据权利要求13所述的癌免疫治疗佐剂。
18.筛选癌免疫治疗剂的方法，其包括：
19.根据权利要求18所述的癌免疫治疗剂的筛选方法，其中所述与步骤(1)的发光蛋白结合的sting蛋白是通过将lgbit与sting的c端结合而获得的。
20.根据权利要求18所述的癌免疫治疗剂的筛选方法，其中所述与步骤(1)的发光蛋白结合的trim29蛋白是通过将smbit与trim29的c端结合或将smbit与trim29的n端结合而获得的。
21.根据权利要求18所述的癌免疫治疗剂的筛选方法，其中所述癌免疫治疗剂通过调节sting和trim29的相互作用来上调sting。
22.用于筛选癌免疫治疗剂的试剂盒，其包含：
